劉艷娜，任兆瑞，2，顏景斌，2

1.上海市兒童醫(yī)院/上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳研究所，上海 200040；2.上海市胚胎與生殖工程重點實驗室/國家衛(wèi)健委醫(yī)學(xué)胚胎分子生物學(xué)重點實驗室，上海 200040

近年來，隨著全球人口的老齡化，神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病率逐漸升高。這類疾病的共同病理特征是大腦神經(jīng)元數(shù)量的減少及功能的喪失，最終導(dǎo)致認知障礙、記憶功能喪失及運動感覺功能缺失等神經(jīng)系統(tǒng)異常的臨床表現(xiàn)［1］。世界衛(wèi)生組織預(yù)測，到2040 年神經(jīng)退行性疾病的死亡率將超過癌癥，成為世界第二大致死性疾病，它已經(jīng)嚴重影響人類的生活質(zhì)量。但是，至今還沒有針對這類疾病的有效治療方案。因此，對神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機制進行研究具有重要的意義。

過去的研究中，神經(jīng)退行性疾病的研究主要集中在非神經(jīng)系統(tǒng)的細胞系和模型小鼠中，但是這些細胞或動物模型并不能完全反映人類神經(jīng)退行性疾病的病理學(xué)特征。直到2006 年，YAMANAKA 等［2］通過向體細胞中導(dǎo)入一些轉(zhuǎn)錄因子，獲得了誘導(dǎo)多能干細胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）。iPSC 作為研究人類疾病發(fā)病機制和評估治療方法的模型顯示出巨大潛力。

iPSC 的多能性使其可以向多種細胞分化。體外將人誘導(dǎo)多能干細胞（human induced pluripotent stem cell，hiPSC）定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細胞，解決了動物和人之間的種屬差異以及人類樣本稀缺性的問題，為體外研究神經(jīng)退行性疾病的分子機制提供了一種很好的模型。CHANG 等［3］利用BiSF 方法成功將DS-iPSC 誘導(dǎo)為神經(jīng)元細胞。BiSF 方法中最關(guān)鍵的2 種誘導(dǎo)因子分別是6-溴靛玉紅-3'-肟（6-bromoindirubin-3'-oxime，BIO） 和SB431542，二者均有促進神經(jīng)元的生長和功能恢復(fù)的作用［4-7］。眾所周知，骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）可以阻斷神經(jīng)的分化，促進表皮細胞的發(fā)育，所以抑制BMP 對神經(jīng)誘導(dǎo)是非常關(guān)鍵的，而BIO 和SB431542 都沒有抑制BMP 的作用。另外，SB431542 對iPSC 分化的作用還存在一定的爭議［8，9］。因此，我們推測BiSF 方法并不能達到最佳的誘導(dǎo)效率。所以本研究在BiSF 方法的基礎(chǔ)上添加了BMP4 抑制劑4-［6-（4-異丙氧基苯基）吡唑并［1，5-a］嘧啶-3-基］喹啉（4-［6-［4-（1-methylethoxy）phenyl］pyrazolo［1，5-a］pyrimidin-3-yl］quinoline，DMH1），通過對BiSF 誘導(dǎo)方法的改進，以期獲得一種更為穩(wěn)定的hiPSC 向神經(jīng)元分化的誘導(dǎo)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 本研究使用的hiPSC購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（American type culture collection，ATCC）（ACS-1011），是由正常男性新生兒的包皮成纖維細胞誘導(dǎo)而成。

1.1.2主 要 試 劑DMEM-F12、 Neurobasal、Essential 8 培養(yǎng)基、N-2 添加劑、B27、NEAAs、Matrix、Knockout血清替代物、Geltrex 及2-巰基乙醇購于美國Invitrogen 公司，干細胞專用消化液購于ATCC，SB431542、Y-27632、TritonX-100、牛血清白蛋白（bovine albumin，BSA）及BIO 均購于美國Sigma 公司，重組人堿性成纖維細胞生長因子2

（recombinant human fibroblast growth factor 2， rh-FGF2） 購于美國R＆D 公司，DMH1 購于美國TargetMol公司，4%多聚甲醛購于上海朝瑞生物科技有限公司，細胞計數(shù)試劑盒8（cell counting kit-8，CCK-8）購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 抗體 實驗中用到的一抗：小鼠抗人SSEA1 購于英國Abcam 公司，小鼠抗人neuronal βⅢ微管蛋白（β Ⅲ-tubulin） 購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，小鼠抗人nestin 購于美國R&D 公司。二抗：Alexa Fluro 488 標記的山羊抗鼠免疫球蛋白G （immunoglobulin G，IgG） 購于英國Abcam 公司，Cy3 標記山羊抗小鼠IgG 及細胞染色液4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）均購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 hiPSC 培養(yǎng) hiPSC 培養(yǎng)在預(yù)先鋪有Geltrex的培養(yǎng)皿中，每日換液，當細胞融合到70%～80%時用干細胞專用消化液消化細胞，接種于鋪有Geltrex的35 mm 培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5% CO2的孵箱中培養(yǎng)。

1.2.2 hiPSC 定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元 當hiPSC 融合到75%左右啟動分化，共分為3 組：對照組、BiSF 組及BiSF+DMH1 組。將細胞消化后從Geltrex包被培養(yǎng)皿中分離，在未包被的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)2 d，對照組hiPSC 后續(xù)不做任何處理，BiSF 組及BiSF+DMH1 組換新的DMEM-F12 培養(yǎng)基（包含20%Knockout 血清替代物、2 mmol 谷氨酸鹽、1 mmol NEAAS 及0.1 mmol 2-巰基乙醇），在孵箱中培養(yǎng)2 d。分化第5 日，更換新的DMEM-F12 培養(yǎng)基（包含2% N-2 添加劑、1 mmol NEAAS 及2 mmol 谷氨酸鹽），同時其中BiSF 組加入神經(jīng)誘導(dǎo)因子0.5 μmol BIO、10 μmol SB431542及10 ng/mL rh-FGF2，BiSF+DMH1組除了加入上述試劑還要加入0.5 μmol DMH1。培養(yǎng)3 d 后將培養(yǎng)基換為神經(jīng)元培養(yǎng)基（包含1%N-2添加劑及10 ng/mL rh-FGF2）。培養(yǎng)4 d 后，將細胞消化后轉(zhuǎn)移到預(yù)鋪Matrigel 的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基中加入2%B27、10 ng/mL rh-FGF2及10 μmol Y-27632。培養(yǎng)5 d后進行后續(xù)的鑒定實驗。

1.2.3 免疫熒光 將細胞種在Matrigel 預(yù)處理的玻片上，培養(yǎng)1 d 后，棄去培養(yǎng)基，用PBS 洗3 次，加入2 mL 4%多聚甲醛室溫靜置30 min，PBS 洗3 次，每次10 min。吸干PBS，加入0.2% TritonX-100 約1 mL，冰上靜置15 min，PBS 洗3 次，每次10 min。吸干PBS，加入5% BSA，室溫封閉1 h，PBS 洗3次，每次10 min。加入稀釋后的一抗［SSEA1（稀釋比例1∶200）、TRA-1-60 （稀釋比例1∶200）、nestin（稀釋比例1∶200）及βⅢ-tubulin（稀釋比例1∶200）］。一抗4 ℃過夜，第2 日吸去一抗，PBS 洗3 次，每次10 min，加入稀釋后的二抗，二抗Alexa Fluro 488 （稀釋比例1∶500）、Cy3 標記（稀釋比例1∶400），室溫孵育1.5 h。PBS 洗3 次，加入DAPI 室溫孵育10 min，PBS 洗3 次后鏡下觀察。

1.2.4 實時熒光定量PCR 采用Trizol 法抽提細胞的總RNA，用紫外吸收法測定RNA 的濃度，取1 000 ng 的RNA，以O(shè)ligo（dT）為引物，用反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒（SuperScript ⅣFirst-Strand Synthesis System）合成cDNA，以稀釋后的cDNA（稀釋比例1∶5） 為模板，每個樣本設(shè)3 個復(fù)孔，使用SYBR Green Premix ExTaq （TaKaRa） 進行實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）反應(yīng)，并在ABI7500 實時定量PCR 儀上進行反應(yīng)及數(shù)據(jù)的收集。選用管家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內(nèi)參來衡量目的基因的表達量。引物序列詳見表1。

表1 qRT-PCR檢測相關(guān)基因的引物序列Tab 1 Genes and primer sequences used for qRT-PCR analysis

1.2.5 CCK-8 檢測細胞增殖 將具有神經(jīng)干細胞（neural stem cells，NSC）特性的細胞制成懸液后吸取100 μL 加入預(yù)鋪有Matrigel 基質(zhì)膠的96 孔板，細胞密度為1 000 個/孔，空白對照組只加入培養(yǎng)基，放入5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)，第2 日向每孔中加入10 μL CCK-8，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，用酶標儀測定450 nm 處的吸光度。實驗分為BiSF 組和BiSF+DMH1 組，每組5 個平行孔及1 個空白對照孔，共檢測5 d，實驗重復(fù)3 次。取5 個平行孔的平行吸光度值減去空白對照組的吸光度值，繪制誘導(dǎo)分化細胞的生長曲線。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析并結(jié)合GraphPad Prism 5 軟件進行繪圖。定量資料采用x±s表示，2 組間比較采用t檢驗。以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hiPSC形態(tài)及鑒定

正常hiPSC 通過無滋養(yǎng)層培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，并且每日換液。從細胞形態(tài)上觀察，hiPSC 的細胞形態(tài)與胚胎干細胞（embryonic stem cell，ES）相似，呈典型的克隆狀生長。免疫熒光結(jié)果顯示培養(yǎng)的hiPSC 能表達多能干細胞特異性基因SSEA1、TRA-1-60，分別顯示為綠色熒光和紅色熒光（圖1A、B）。

圖1 hiPSC形態(tài)及多能性的鑒定Fig 1 hiPSC morphology and pluripotency identification

2.2 鏡下觀察不同誘導(dǎo)方法下細胞形態(tài)的變化

當hiPSC 融合到75%時，消化hiPSC，將細胞克隆團轉(zhuǎn)移到未鋪基質(zhì)膠的培養(yǎng)皿中，共分為3 個組，分別為BiSF+DMH1 組、BiSF 組，及未處理的對照組。在誘導(dǎo)分化第9 日可以看到BiSF+DMH1 組的細胞團周圍出現(xiàn)大量神經(jīng)樣梭形細胞（圖2A），BiSF組細胞團周圍出現(xiàn)少量突觸細胞，并且細胞團灰暗不規(guī)則（圖2B），而未作任何處理的hiPSC 并未貼壁（圖2C）。這個結(jié)果提示，2 種誘導(dǎo)方法均可能將hiPSC誘導(dǎo)分化為神經(jīng)樣的細胞。

圖2 誘導(dǎo)分化第9日鏡下觀察細胞形態(tài)Fig 2 Cell morphologies were observed under microscope on day 9 of differentiation

2.3 免疫熒光檢測NSC相關(guān)蛋白的表達

誘導(dǎo)分化第10 日將細胞團消化成單細胞后，接種到Matrigel 預(yù)處理的玻片上，培養(yǎng)2 d 后免疫熒光檢測nestin 的表達。結(jié)果顯示，2 個誘導(dǎo)組的細胞均表達NSC 特異性蛋白nestin，說明2 種方法都能將hiPSC 誘導(dǎo)分化為表達NSC 特異性基因的細胞，但是熒光強度和細胞形態(tài)并沒有很明顯的差異（圖3A）。

隨后，我們比較了2 種方法誘導(dǎo)細胞增殖的情況。將誘導(dǎo)分化的細胞團消化成單個懸浮細胞后，接種到預(yù)鋪有Matrigel 的96 孔板中，加入CCK-8 后檢測D（450 nm）值，連續(xù)監(jiān)測5 d。結(jié)果顯示，培養(yǎng)后第2 日的BiSF+DMH1 組D（450 nm）值高于BiSF組（0.69±0.02vs0.30±0.01），之后幾日的BiSF+DMH1 組D（450 nm）始終保持比較高的數(shù)值，在第5 日差異更加明顯（2.49±0.15vs1.37±0.06）并且差異都具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000，P=0.002）（圖3B）。這一結(jié)果表明，BiSF+DMH1 誘導(dǎo)組的NSC 樣細胞增殖能力明顯強于BiSF誘導(dǎo)組。

2.4 多能性基因及NSC相關(guān)基因的表達檢測

為了進一步比較2 種方法將hiPSC 誘導(dǎo)為具有NSC 特性細胞的能力，我們又檢測了干細胞相關(guān)基因的表達。qRT-PCR 結(jié)果顯示，誘導(dǎo)分化第13 日，2種方法誘導(dǎo)的細胞基本都不表達iPS 細胞特異性的多能基因NANOG及OCT4（圖4A、B），同時檢測了NSC 相關(guān)基因nestin 及PAX6的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)nestin 表達量在BiSF+DMH1 細胞組中明顯高于BiSF組（4.71±0.76vs1.58±0.30），PAX6在BiSF+DMH1組的表達量也明顯高于BiSF 組（3.48±0.74vs0.59±0.22）（圖4C、4D），且差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.019，P=0.011）。這些結(jié)果進一步說明了BiSF+DMH1組的誘導(dǎo)效率比BiSF組更高。

圖4 誘導(dǎo)第13日多能性基因及NSC相關(guān)基因表達水平比較Fig 4 mRNA expression levels of pluripotency-related genes and NSC-related genes on day 13 of differentiation

2.5 神經(jīng)元特異性基因表達水平的比較

既然BiSF+DMH1 誘導(dǎo)分化的細胞具有NSC 特性，且細胞的增殖能力比BiSF 誘導(dǎo)組的強，那么用此種方法誘導(dǎo)分化的NSC 樣細胞是否能更加高效地分化為具有神經(jīng)元特性的細胞呢？隨后，我們將2 組誘導(dǎo)方法獲得的NSC 繼續(xù)向神經(jīng)元分化，并采用免疫熒光檢測分化細胞的神經(jīng)元特異性微管蛋白βⅢ-tubulin 的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2 組中均能檢測到βⅢ-tubulin 表達陽性的細胞，而BiSF+DMH1 組的紅色熒光強度明顯強于BiSF 誘導(dǎo)組（圖5A）。通過Image J軟件分析也發(fā)現(xiàn)BiSF+DMH1誘導(dǎo)組帶有紅色熒光的細胞數(shù)量明顯多于BiSF 誘導(dǎo)組（65.82%±5.43%vs30.38%±7.56%），且這種差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.003）（圖5B）。

同時，我們采用qRT-PCR 技術(shù)檢測2 組細胞中神經(jīng)元特異性基因MAP2的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BiSF+DMH1 組MAP2的相對表達水平明顯高于BiSF組（3.84±0.59vs1.28±0.22），而對照組hiPSC 幾乎不表達神經(jīng)元特異性基因MAP2（P=0.006）（圖5C）。上述結(jié)果說明，BiSF+DMH1 的誘導(dǎo)方法能夠更有效地將hiPSC 誘導(dǎo)分化為具有神經(jīng)元特性的細胞。

圖5 神經(jīng)元特異性標志物的檢測Fig 5 Detection of neuron-specific markers

3 討論

神經(jīng)退行性病變的研究方法很多，最常用的就是建立小鼠疾病模型。但是人類與動物之間存在著種屬差異，動物模型不能完全真實地反映人體中的情況。而對于神經(jīng)退行性疾病而言，只有從腦組織中獲取人體組織樣本才具有重要意義，這就使樣本的獲取變得非常困難。因此，神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究的挑戰(zhàn)之一就是找到一個有效的細胞研究系統(tǒng)，它應(yīng)該具有以下特性：①安全性和可重復(fù)性。②不涉及科學(xué)倫理問題。③發(fā)育起源與神經(jīng)譜系接近。④可以在體外穩(wěn)定地擴增，并可以很好地反映疾病的特性。⑤可用于細胞介導(dǎo)療法［10］。iPSC 的出現(xiàn)解決了這些問題，它可以來源于不同類型的體細胞，這些體細胞一般取自于健康人或患者，并通過重編程獲得iPSC，這些iPSC攜帶體細胞中所有的遺傳突變和基因的多態(tài)性。利用iPSC 的多能性，將其誘導(dǎo)分化為所需要的細胞，特別是神經(jīng)細胞，成為研究神經(jīng)系統(tǒng)病變發(fā)生機制的一種重要方法。

將iPSC 定向分化為神經(jīng)細胞主要分為2 個過程：①將多能干細胞，定向誘導(dǎo)為NSC。②將NSC 誘導(dǎo)分化為終末神經(jīng)細胞，包括神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞等。常用的誘導(dǎo)方法是將iPSC 懸浮培養(yǎng)后形成擬胚體（embryoidbody，EB），逐步分階段地加入誘導(dǎo)因子，最終達到定向分化的目的。因此，選擇合適的誘導(dǎo)因子在整個分化過程中至關(guān)重要。CHANG 等［3］利用BiSF 的方法，在誘導(dǎo)過程中添加了BIO、SB431542 及FGF2，將DS-iPSC 定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元，并且在誘導(dǎo)分化的神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)了阿爾茨海默病特有的病變，其出現(xiàn)β-淀粉樣蛋白的聚集及tau 蛋白過度磷酸化。BIO 與FGF2 對細胞的分化都有促進作用。FGF2 是一種活化的成纖維細胞生長因子，可增強脊椎動物和ESC 中的神經(jīng)分化的能力，有效地將hESC 轉(zhuǎn)化為NSC［11］。BIO 可以激活Wnt 信號通路［12-13］，在神經(jīng)分化初始階段的維持OCT4水平，其對神經(jīng)外胚層的作用至關(guān)重要，促進hESC 的神經(jīng)分化［14］。SB431542 是TGF-β-Smad2/3 通路的特異性抑制劑，可通過Smad2/3調(diào)節(jié)多能性基因Sox2、Oct4及Nanog的表達［15］，促進ESC 或iPSC 向神經(jīng)細胞分化［16-18］。但是，有研究指出SB431542 有助于維持ESC 的未分化狀態(tài)［19］，并且在小鼠iPSC 生成的過程中，可以代替誘導(dǎo)因子Oct4或者Sox2，加入SB431542 與其他誘導(dǎo)因子，同樣可以成功誘導(dǎo)出iPSC［8-9］?？梢钥闯觯琒B431542 對iPSC 分化的作用仍然存在一定爭議。所以本文將BiSF 誘導(dǎo)方法進行改進，選擇加入一種BMP 抑制劑來提高iPSC 向神經(jīng)元分化的誘導(dǎo)效率。

BMP 能夠抑制神經(jīng)細胞的分化，已是大家所公認的［20-21］。將iPSC 在含有BMP4 上清液的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，人們發(fā)現(xiàn)Smad1 被磷酸化，iPSC 的分化得到有效的抑制。此種方法培養(yǎng)3代后，不僅iPSC的表型可以有效維持，iPSC中的多能基因的表達也未受到影響。同時，這些iPSC 仍有向3 個胚層分化的能力［22］。DMH1 可以直接作用于BMP4，通過抑制BMP4，從而使Smad3 磷酸化降低，達到促進神經(jīng)分化的作用［23］。前文提到SB431542 也能夠抑制Smad3磷酸化，阻斷TGFβ信號，但是對BMP介導(dǎo)的Smad3磷酸化沒有作用，它對BMP 是沒有直接作用的［24］。所以本研究在BiSF 基礎(chǔ)上加入BMP4 的抑制劑DMH1，希望能夠提高iPSC向神經(jīng)細胞分化的效率。

我們在懸浮培養(yǎng)hiPSC 2 d 后啟動誘導(dǎo)分化，分化第5 日除了加入BIO 和SB431542，又加入了BMP4抑制劑DMH1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與BiSF 組相比，加入DMH1后除了細胞形態(tài)有所不同（圖2），NSC特異性基因nestin、PAX6的表達量明顯增多（圖4）。Nestin與PAX6都是參與NSC 分化調(diào)控的重要基因，二者均在中樞神經(jīng)發(fā)育的一段時間內(nèi)有表達，之后會被成熟神經(jīng)細胞所特有的蛋白取代，而它們表達高峰期也恰為NSC 增殖的最旺盛時期［25-27］。因此，我們檢測了這個時期細胞的增殖情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BiSF+DMH1 組的細胞增殖能力明顯高于BiSF+DMH1 組（圖3B）。這說明2 種誘導(dǎo)方法均能將hiPSC 誘導(dǎo)分化為具有NSC 特性的細胞，但是BiSF+DMH1 誘導(dǎo)組能更加有效地將iPSC誘導(dǎo)分化為具有NSC特性的細胞。

NSC 具有分裂增殖的能力，在特定的條件下將分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞等不同類型的神經(jīng)細胞。所以，我們還觀察了2組中的NSC樣細胞分化為神經(jīng)元的能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2 種方法誘導(dǎo)的細胞均檢測到神經(jīng)元特異性蛋白βⅢ-tubulin的表達，但是BiSF+DMH1 誘導(dǎo)組中βⅢ-tubulin 陽性的細胞的占比達到65.8%，明顯高于BiSF組（圖5A、B）。而且BiSF+DMH1 組細胞中MAP2表達水平亦高于BiSF 組（圖5C）。這些結(jié)果說明BiSF+DMH1 方法誘導(dǎo)出的NSC 樣細胞能夠更高效地分化為具有神經(jīng)元特性的細胞。

近年來，NSC 移植治療神經(jīng)退行性疾病方面的研究取得了較大突破。越來越多的研究報告，幾種神經(jīng)退行性疾病的動物模型在NSC 移植治療后，癥狀都得到一定得改善［28-31］。我們通過對BiSF 方法的改進，顯著地提高了將hiPSC 誘導(dǎo)分化為神經(jīng)系統(tǒng)細胞的效率，將為神經(jīng)退行性疾病的研究及治療提供有力的工具。