王振偉

（乾元浩生物股份有限公司，江蘇 南京 210000）

在社會現(xiàn)代發(fā)展的新階段，獸用生物制品質(zhì)量不斷提升，很多企業(yè)在生產(chǎn)中重視獸用生物制品中支原體檢驗，利用現(xiàn)代化各種檢驗手段，分析各種相關(guān)組織，獲得生物材料制備藥品，制定相應的獸用疫苗，有效預防相應疾病產(chǎn)生，也可以應用在獸類病癥治療中。本文主要分析對獸用生物制品中支原體檢驗的影響因素，結(jié)合當前的發(fā)展問題，探討有效的獸用生物制品中支原體污染的有效預防策略和目前常用的檢驗方法，切實提升獸用生物制品支原體檢驗的準確率。

1 影響獸用生物制品中支原體檢驗的因素

1.1 原材料 對獸用生物制品中支原體的檢驗需要按照相關(guān)檢驗標準和利用培養(yǎng)法進行。獸用生物制品中支原體可以在無細胞培養(yǎng)基中逐漸生長，但其有一定的營養(yǎng)需求，而且條件比較苛刻。在對獸用生物制品中支原體檢驗時，利用培養(yǎng)法需要選擇綜合性培養(yǎng)基，我國專用的獸藥典指出，在對獸用生物制品進行支原體檢驗時，主要用兩種實驗培養(yǎng)基，即液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基，且培養(yǎng)基中包含多種營養(yǎng)物質(zhì)。而進行支原體檢驗的培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)都是從動物體內(nèi)提取的物質(zhì)，這些營養(yǎng)物質(zhì)會因生產(chǎn)廠家的不同而有所差異，即使是同一廠家生產(chǎn)的，批次不同也會有所差異，所以在實際應用前需要就廠家資質(zhì)進行全面了解。培養(yǎng)基的敏感性還受相關(guān)物質(zhì)影響，特別要注意蛋白水解物的質(zhì)量。

由于獸用生物制品中支原體的檢驗需要利用培養(yǎng)法，所以要選擇合適的培養(yǎng)基，加強對培養(yǎng)基原材料的嚴格把控，在檢驗前提前做好各項測試，如培養(yǎng)基中需要各種試劑和附加成分，應該選擇純度較高的。同時培養(yǎng)基中所用的各種培養(yǎng)液，必須按照要求進行制備儲存，要重點防控避免中污染。

1.2 培養(yǎng)基制備量 在檢驗獸用生物制品中支原體時，很多檢驗人員會考慮成本問題，因此在利用培養(yǎng)法檢驗過程中培養(yǎng)基制備量較少，此時很可能會導致獸用生物制品受到支原體污染。

如果在培養(yǎng)基中存在無機鹽類，則具有一定的緩沖作用，無機鹽類可以使培養(yǎng)基內(nèi)的液體滲透壓和pH 值得以維持，使支原體能在培養(yǎng)基中有效生存。但是如果培養(yǎng)基內(nèi)的液體較少，會導致相應參數(shù)與支原體的需求存在差異，相關(guān)數(shù)值如果過高或過低都會導致支原體群體出現(xiàn)膨脹萎縮，此時會改變原有的支原體代謝路徑，嚴重時會直接導致死亡。同時，培養(yǎng)基內(nèi)的各種無機鹽在有一定的拮抗作用，需要保證無機鹽類各離子有合適的配比，才能使培養(yǎng)基內(nèi)支原體保持其生理平衡，維持生長檢驗符合要求。除此之外培養(yǎng)基內(nèi)的氨基酸含量也會對支原體生長產(chǎn)生一定影響，氨基酸含量主要是影響支原體的代謝，如果添加量控制不好，會導致培養(yǎng)基內(nèi)緩沖作用達不到要求，氨基酸含量不足很容易出現(xiàn)支原體培養(yǎng)失敗。在實際操作制備培養(yǎng)基中，應該按照要求，嚴格按照標準完成各項步驟，根據(jù)配方要求配備各種物品，控制好添加的順序，制備中把各物品進行溶解后，然后按照要求混合。

1.3 培養(yǎng)基滅菌方法

1.3.1 液體培養(yǎng)基 利用液體培養(yǎng)基對獸用生物制品中支原體的檢驗，需要考慮某些成分不能耐受加熱，所以對培養(yǎng)基中的血清等物質(zhì)進行過濾除菌。

1.3.2 固體培養(yǎng)基 利用固體培養(yǎng)基則需要考慮到有些成分對加熱消毒有不同的耐受力，所以應該根據(jù)各種成分的特性，選擇合適的方法進行消毒除菌，并保證嚴格按照規(guī)范操作。制備固體培養(yǎng)基需要嚴格把控兩個步驟，（1）要對基礎(chǔ)固體培養(yǎng)基進行高壓滅菌，此時主要考慮到固體的耐熱性比較好，通過設(shè)定好具體參數(shù)的高壓滅菌器進行滅菌消毒，時間控制在20min 左右，后續(xù)在設(shè)備溫度有效降低后，及時打開設(shè)備蓋子取出培養(yǎng)基。（2）固體培養(yǎng)基制備中的其他成分，如果不耐熱，需要按照液體培養(yǎng)基的制備方法，通過過濾方式進行除菌操作。

1.4 培養(yǎng)器皿及容器 檢驗獸用生物制品中支原體時，對培養(yǎng)基的要求非常高，為了達到合適的支原體培養(yǎng)要求，需要選擇合適的器皿和容器。如果利用玻璃器皿制備培養(yǎng)基，必須保證選用的玻璃容器是清潔無污染的，在制備培養(yǎng)基前需要放入高壓設(shè)備進行滅菌，還要對器皿進行干烤消毒。如果使用的器皿及容器則會導致支原體培養(yǎng)失敗。不能達到要求，因此需要重視培養(yǎng)器皿及容器的準備，在應用前特別重視對玻璃器皿或容器的洗滌，以保證符合檢驗獸用生物制品中支原體的要求。清洗玻璃制品用的清洗劑可能會在內(nèi)表面或瓶蓋等部位存留，如果不重視，會影響培養(yǎng)基質(zhì)量。為了保證獸用生物制品中支原體培養(yǎng)和檢驗順利進行，應該對檢驗所用的各種培養(yǎng)器皿和容器的潔凈程度進行檢測。很多廠家由于忽視培養(yǎng)基制備中的玻璃器皿及容器潔凈度問題，在后續(xù)開展相應獸用生物制品中支原體檢驗時，檢驗工作會受到很大的影響，導致檢驗質(zhì)量不符合要求。目前很多廠家會利用玻璃器皿制作檢驗獸用生物制品中支原體的培養(yǎng)基，如果使用塑料制品，可能在生產(chǎn)中會有一定的毒素殘留，而且不同的材質(zhì)是需要使用不同的生產(chǎn)工藝，培養(yǎng)基器皿表面的吸附能力也會有所差異，因此，應該在培養(yǎng)器皿及容器各方面多加關(guān)注。

2 預防支原體污染獸用生物制品的有效策略

2.1 加強原材料的控制 在獸用生物制品生產(chǎn)中，會利用到細胞、血清等多種原材料，這些原材料都有利于支原體生存。獸用生物制品生產(chǎn)中的各種原材料會受到多種支原體污染，所以在獸用生物制品中，必須保持原材料處于無菌狀態(tài)，此時應該加強對原材料的污染控制，提前采取有效策略，有效阻止出現(xiàn)支原體污染。另外，在細胞培養(yǎng)時，工作人員必須保持良好的個人衛(wèi)生狀態(tài)，在操作中嚴格按照要求，以有效避免獸用生物制品被支原體污染。要在發(fā)展中逐漸建立并完善其相應管理制度，通過制度規(guī)范構(gòu)建完善的檢驗體系，對各項細胞進行多次的嚴格檢驗，保證所有的細胞都是沒有支原體污染狀態(tài)。最后，在現(xiàn)代化發(fā)展中，需要引進新型的細胞等，需要利用各種新設(shè)備進行隔離培養(yǎng)，在生產(chǎn)制作前要進行嚴格檢驗，保證檢驗符合質(zhì)量要求，才能進入車間。

2.2 加強對獸用生物制品生產(chǎn)環(huán)境的控制 在生產(chǎn)車間內(nèi)必須要建立完善的管理制度，日常應該按照計劃進行清潔消毒，負責人員需要對內(nèi)部環(huán)境進行定期檢測，保證檢測各項數(shù)據(jù)在合格數(shù)值范圍內(nèi)。日常生產(chǎn)中必須對各個環(huán)節(jié)進行細化管理，加強生產(chǎn)中的設(shè)備、物品以及人員把控，明確具體的出入路線，避免各項在發(fā)展中出現(xiàn)交叉感染。如果對生產(chǎn)車間的設(shè)備進行消毒必須要嚴格徹底，在對設(shè)備進行消毒時需要參考相應資料，并且提前了解生產(chǎn)設(shè)備使用特性，通常是通過高壓滅菌方式來消毒，適用時可以對一般設(shè)備進行消毒水浸泡，必須使所有生產(chǎn)設(shè)備在投入生產(chǎn)前進行徹底消毒。進入生產(chǎn)環(huán)境內(nèi)的所有物品，需要提前做好表面消毒，或者是把相應物品放置在紫外線燈罩區(qū)照射后，才可進入生產(chǎn)車間。

2.3 加強對人員的管理 平時要規(guī)范對獸用生物制品中支原體檢測的生產(chǎn)流程，工作人員上崗前要提前進行專業(yè)培訓，要求所有進入生產(chǎn)車間的工作人員都必須更換符合要求的衣物，保證自身沒有裸露皮膚，如果相關(guān)人員存在呼吸道癥狀或有皮膚病必須嚴格禁止進入，特別是不能讓其進入的車間重點關(guān)注區(qū)域。同時，日常生產(chǎn)要求所有工作人員必須按照要求規(guī)范操作，保證個人操作的規(guī)范性，避免出現(xiàn)細節(jié)上的操作誤差。比如在手術(shù)臺操作中，如果手離開操作臺，需要使用器皿，需要及時對各項器械進行消毒，否則很容易出現(xiàn)支原體污染問題。如果工作人員在操作臺操作中出現(xiàn)流汗問題用手擦，或相應設(shè)備與人體裸露皮膚相接觸，都會導致支原體出現(xiàn)污染。

2.4 加強對消毒滅菌環(huán)節(jié)的管理 有效預防獸用生物制品的支原體污染，需要重視消毒滅菌環(huán)節(jié)，嚴格按照要求進行消毒滅菌，避免各種生物制品出現(xiàn)污染物，減少微生物的滋生。在獸用生物制品生產(chǎn)過程中所用的各項器械和物品，都必須按照要求進行消毒滅菌，在投入生產(chǎn)前，需要提前做好無菌測試，達到要求的才可使用，這樣可從源頭上控制支原體污染事件。此外，需要加強對消毒滅菌環(huán)節(jié)的重視，了解日常使用的消毒滅菌方式的有效性，如果在消毒滅菌中高壓鍋或相關(guān)設(shè)備堆積過多的物品，很容易出現(xiàn)加熱不均勻，導致消毒滅菌不徹底。或在消毒滅菌中設(shè)定的循環(huán)時間比較短，特別是消毒滅菌的液體含量過高，此時可能存在一定的固體成分或膠狀物質(zhì)，在消毒滅菌中時間過短也會影響有效性。所以，在消毒滅菌環(huán)節(jié)必須提前就實際材料進行詳細分析，記錄各方面參數(shù)，從多方面進行把控，保證能夠達到理想效果。

2.5 合理使用抗生素，有效預防污染 根據(jù)相關(guān)研究可知，預防獸用生物制品的支原體污染可以通過抗生素發(fā)揮一定的抑制作用，所以在獸用生物制品生產(chǎn)過程中，可以合理使用抗生素來有效預防，避免出現(xiàn)支原體污染問題。但是很多支原體對抗生素的敏感性比較差，而且有些抗生素在使用中會存在一定的抗藥性，所以預防獸用生物制品的支原體污染時，需要選擇合適的抗生素種類，同時控制好抗生素的使用劑量，避免細胞等相關(guān)原材料的正常功能受到影響，同時能夠達到較好的污染預防效果。

3 常用的檢驗獸用生物制品中支原體方法

3.1 一步法試劑盒 獸用生物制品支原體檢驗方法在不斷推陳出新，目前多家公司在研究中研究出了一步法試劑盒，該法主要是通過專業(yè)擴增等溫技術(shù)，使支原體得檢驗操作非常簡單，選取很少的樣本量，就可以判定支原體檢測結(jié)果。根據(jù)曹媛媛等人的專業(yè)實驗室牛支原體檢驗來看，結(jié)合利用多種方法進行鑒定，每一種鑒定方法中都可以明確支原體物質(zhì)的存在，利用此些方法與培養(yǎng)法相比較，使用一步法可以快速了解檢驗結(jié)果，檢測周期非常短。與PCR 檢驗方法相比，一步法在操作中更為簡單快速，但是檢驗結(jié)果存在一定的特異性問題，不能針對研究的支原體種屬進行判別，根據(jù)此項研究可知，利用一步法試劑盒可以與其他檢測方法相結(jié)合，以此增強準確性。

3.2 PCR 檢驗方法 PCR 檢驗方法相對來說檢測過程中靈敏性比較高，而且檢驗的概率準確性高，利用此種檢測方法，可以快速了解檢測結(jié)果，目前結(jié)合各項設(shè)備利用PCR 檢測方法，可以逐漸實現(xiàn)自動化發(fā)展，在檢測過程中并不需要標本有過高的純度，因此該法在獸用生物制品中支原體檢驗的優(yōu)勢非常明顯。但也存在一定的問題，即檢驗結(jié)果存在假性狀態(tài)，需要根據(jù)獸用生物制品支原體各項條件進行多次摸索，在研究中需要對各項操作熟悉。

3.3 分離培養(yǎng)法 此項檢驗方法主要是通過培養(yǎng)基使支原體能夠出現(xiàn)典型菌落，具體應用中檢測結(jié)果比較準確。但具體應用中需要較長的時間，敏感性比較差。目前國家專用藥典中以此種方法作為專業(yè)檢測方法，還需要在未來發(fā)展中不斷探索新的檢驗方法。

4 總 結(jié)

在獸用生物制品生產(chǎn)中相關(guān)企業(yè)應該加強研究，探討有效的支原體檢測方法。支原體作為重要的病原微生物，如果出現(xiàn)感染會導致生物制品質(zhì)量明顯降低，基于獸用生物制品支原體污染的特性，應該從多方面加強管制，保證獸用生物制品的質(zhì)量。分析具體的影響因素，在發(fā)展中按照國家新的通用標準，在生產(chǎn)中對各個細節(jié)進行規(guī)范，及時排除各種污染因素，促進長遠發(fā)展。