劉宇文， 伍 勛， 諶 宇， 鄒耀華， 侯 娜

(杭州市食品藥品檢驗研究院，浙江 杭州 310022)

鱉甲、龜甲均收載于2020年版《中國藥典》一部，均為單一來源中藥，分別為鱉的背甲和烏龜?shù)谋臣准案辜譡1]，本課題組前期研究和有關(guān)文獻均顯示當(dāng)前混偽情況在龜鱉甲類中藥中較多[2-3]，這些混偽品有可能會轉(zhuǎn)移到中成藥中，因此其質(zhì)量如何也需要研究人員密切關(guān)注。

傳統(tǒng)的性狀鑒別是龜鱉甲類藥材的主要鑒別手段，但對于含該類藥材的中成藥并不適用，分子鑒定技術(shù)在龜鱉甲類藥材的報道較多，推廣到中成藥也還不成熟[4-7]。近年來，特征肽段專屬性鑒別方法在膠類藥材監(jiān)管中應(yīng)用成熟[8-13]，課題組結(jié)合相關(guān)研究，擬將超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法與固相萃取小柱(SPE)聯(lián)合應(yīng)用，建立可用于檢測中成藥中11種龜鱉甲(烏龜、巴西紅耳龜、花龜、黃喉水龜、黃緣閉殼龜、緬甸陸龜、小鱷龜、印度楞背龜、鱉、角鱉、珍珠鱉)類成分的專屬性方法。

1 材料

1.1 儀器 G6495B型超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Agilent公司)，配置MPP(MassProfiler Professional)(Ver.B.14.00)、MassHunter (Ver.B.10.00)；XS205型電子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；TW-8型恒溫水浴鍋(深圳市優(yōu)博萊科技有限公司)。

1.2 試劑 Oasis 親生親油平衡固相萃取柱(美國Waters公司，批號150A37158B)；測序用胰蛋白酶(美國Sigma公司，批號SLBZ8570)。碳酸氫銨(分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號20190911)；乙腈(美國Tedia公司，批號AS1122-001，質(zhì)譜純)；甲酸(美國Thermo Fisher Scientific公司，批號100291，質(zhì)譜純)；水為超純水。

1.3 藥材 鱉TrionyxsinensisWiegmann、烏龜Chinemysreevesii(Grsy)、巴西紅耳龜Trachemysscriptaelegans(Wied.)、黃喉水龜Clemmysmutica(Cantor)、花龜Ocadiasinensis(Gray)、小鱷龜Chelydraserpentina(Linnaeus)、黃緣閉殼龜CyclemysflavomarginataGray.、緬甸陸龜Testudoelongate(Blyth)、印度楞背龜Kachugatectum(Gray)、角鱉Apalonespinifera、珍珠鱉Apaloneferox(Schneider)對照藥材經(jīng)杭州市食品藥品檢驗研究院諸葛隴副主任中藥師鑒定為正品，標(biāo)本保存于杭州市食品藥品檢驗研究院中藥天然藥物檢驗所標(biāo)本室中。35批市售中成藥涉及19個品種，其中18批含鱉甲類成分，17批含龜甲類成分，具體見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 分析條件

2.1.1 色譜 Eclipse Plus十八烷基硅烷鍵合硅膠填料色譜柱(2.1 mm×150 mm，1.8 μm)；流動相乙腈(A)-0.1%甲酸(B)，梯度洗脫，程序見表2；體積流量0.3 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量1 μL。

2.1.2 質(zhì)譜 ESI+離子源；MRM模式，正負(fù)離子切換掃描；毛細(xì)管電壓4 kV；錐孔電壓166 V；源區(qū)溫度325 ℃；干燥氣溫度200 ℃；體積流量 14 L/min；霧化器壓力50 psi(1 psi=6.895 kPa)；霧化氣、碰撞氣N2。

2.1.3 特征離子對MRM條件建立 本課題組提取11種龜鱉甲的蛋白溶液，以胰蛋白酶酶解對照藥材溶液，利用高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜(HPLC-Q-TOF)與化學(xué)統(tǒng)計分析相結(jié)合進行分析，獲得的質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)進行預(yù)處理，以分子特征提取模式提取保留時間和質(zhì)荷比(m/z)參數(shù)，作為一個數(shù)據(jù)對(EMRT數(shù)據(jù)對)，并剔除異常數(shù)據(jù)結(jié)果，保存為CEf文件?？傠x子流圖CEf文件采用MPP軟件進行統(tǒng)計分析，11種龜鱉甲各自特征肽段信息被查找到，再將特征肽段信息導(dǎo)入安捷倫定性分析軟件Agilent Qualitative Analysis B.10.00進行再驗證確認(rèn)，最終確定了11種龜鱉甲的專屬性特征肽段[3,14-15]。針對篩選出的特征肽段，通過串聯(lián)質(zhì)譜平臺建立MRM方法，詳細(xì)信息見表3。

表1 中成藥信息

表2 梯度洗脫程序

表3 特征離子MRM采集參數(shù)

2.2 對照藥材溶液制備 取對照藥材(粉碎，過4號篩)各約1 g，精密稱定，置于150 mL具塞錐形瓶中，加入50 mL超純水，稱定質(zhì)量，室溫浸泡1 h，加熱回流1 h，放冷，超純水補足減失的質(zhì)量，加入0.5 g NH4HCO3，使溶解并搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液1 mL至5 mL量瓶中，加新制胰蛋白酶溶液1 mL(1 mg/mL 1%NH4HCO3溶液)，1%NH4HCO3溶液稀釋，定容至刻度，搖勻，37 ℃酶解12 h，即得[3]。

2.3 供試品溶液制備 取35批樣品(固體粉碎并過4號篩，液體適量混勻)適量，加入超純水混勻(約相當(dāng)于處方中原藥材1 g)，精密稱定質(zhì)量，置于150 mL具塞錐形瓶中，按“2.2”項下方法制備，再用HLB固相萃取小柱凈化酶解液，即得。

2.4 陰性樣品溶液制備 按照處方制備不含龜鱉甲類成分的陰性樣品適量，按“2.3”項下方法制備，即得。

2.5 肽段純化及條件優(yōu)化 采用HLB固相萃取小柱凈化酶解液[16]，先進行HLB固相萃取小柱活化(依次用1 mL甲醇、1 mL 1%甲酸活化)，然后取1 mL 對照品酶解液加到SPE小柱上，再依次用5%甲醇、1%甲酸進行洗脫，用1 mL含1%甲酸-乙腈(80∶20)溶液分次洗脫，收集洗脫液，洗脫液用氮氣吹干，用500 μL含0.1%甲酸-乙腈(95∶5)復(fù)溶，為進一步考察固相萃取過程對目標(biāo)特征多肽的損失，分別取11種龜鱉甲對照藥材酶解溶液過HLB柱，結(jié)果見表4。

表4 對照藥材特征肽固相萃取純化效果(n=3)

2.6 專屬性試驗 按“2.4”項下方法制備大補陰丸的陰性樣品溶液，再以龜甲對照藥材、含龜甲類成分中成藥為陽性對照，按“2.3”項下方法制備相應(yīng)陽性對照藥材溶液，選擇龜甲(烏龜)特征離子對m/z442.7(雙電荷)～631.3和m/z442.7(雙電荷)～560.3，在“2.1”項條件下進樣測定，結(jié)果見圖1。由此可知，在與陽性對照藥材溶液色譜圖中相應(yīng)位置上，陰性樣品未出現(xiàn)相應(yīng)特征離子對色譜峰，表明該方法具有良好的專屬性。同法對其他中成藥進行專屬性實驗，也得到類似結(jié)果。

2.7 穩(wěn)定性試驗 取對照藥材適量，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，于0、6、12、18、24、48 h在“2.1”項條件下進樣測定，測得烏龜甲、鱉甲、巴西紅耳龜甲、花龜甲、黃喉水龜甲、黃緣閉殼龜甲、緬甸陸龜甲、小鱷龜甲、印度楞背龜甲、角鱉甲、珍珠鱉甲峰面積RSD分別為6.6%、5.4%、4.9%、7.1%、6.6%、8.2%、5.3%、5.8%、5.7%、6.2%、4.7%，表明溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

注：1為質(zhì)荷比442.7(雙電荷)～560.0,2為質(zhì)荷比442.7(雙電荷)～631.0。圖1 龜甲類成分的特征分子離子峰色譜圖

2.8 檢測限 將對照藥材溶液逐級稀釋后，在“2.1”項條件下進樣測定，以信噪比3∶1為檢測限，測得烏龜甲、鱉甲、巴西紅耳龜甲、花龜甲、黃喉水龜甲、黃緣閉殼龜甲、緬甸陸龜甲、小鱷龜甲、印度楞背龜甲、角鱉甲、珍珠鱉甲檢測限分別為0.04、0.1、0.1、0.8、2、1、0.1、1、1、0.5、0.1 g/L。

2.9 重復(fù)性試驗 取同一批大補陰丸6份(批號181014)，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，采用龜甲(烏龜)的特征離子對m/z442.7(雙電荷)～631.3和m/z442.7(雙電荷)～560.3，在“2.1”項條件下進樣測定，測得上述特征離子對峰均有檢出，表明該方法重復(fù)性良好。

2.10 結(jié)果分析 18批含鱉甲的中成藥均檢出鱉甲(鱉)類成分，其中還有1批檢出珍珠鱉甲類成分；17批次含龜甲類成分中成藥中有2批只檢出龜甲(烏龜)類成分，6批只檢出巴西紅耳龜甲類成分，4批同時檢出龜甲、巴西紅耳龜甲類成分，3批同時檢出龜甲、巴西紅耳龜甲、小鱷龜甲類成分，1批同時檢出龜甲、巴西紅耳龜甲、小鱷龜龜甲、緬甸陸龜甲、花龜甲及鱉甲類成分，1批未檢出龜甲類成分，可能未投料或投料量太少。由此可知，含龜甲的中成藥大多存在偽品混充或者摻偽情況，僅12%的原料藥材基源符合2020年版《中國藥典》規(guī)定，提示各有關(guān)部門應(yīng)對該類中成藥的質(zhì)量控制引起足夠重視，雖然含鱉甲的中成藥情況稍好，但有關(guān)部門也需加強監(jiān)管。

3 討論

龜鱉甲類藥材在我國使用歷史悠久，均具有補陰益氣的功效，也是眾多中成藥的原料，例如大補陰丸、小兒肺咳顆粒、龜鹿二仙膏、化癥回生片、龜鱉丸、鹿龜酒等。前期研究發(fā)現(xiàn)，龜甲摻偽情況較為嚴(yán)重，例如，巴西紅耳龜、小鱷龜、中華花龜?shù)?，常有混入龜鱉甲藥材中。由于龜鱉甲類藥材品種基源的混亂，必然會造成含龜鱉甲的中成藥質(zhì)量的不可控，不利于該類中成藥的系統(tǒng)深入研究，也將增加監(jiān)管的和風(fēng)險和難度，同時，國家已出臺一些列法律法規(guī)加強對野生動物的保護，如何防止諸如緬甸陸龜?shù)缺Ｗo野生進入中藥領(lǐng)域，也是急需研究的課題。

龜鱉甲類藥材傳統(tǒng)性狀鑒別存在著很大的局限性，而中成藥中的龜鱉甲類成分已粉碎或提取過，性狀鑒別更是無能為力。龜鱉甲類藥材報道較多的DNA分子鑒定技術(shù)，應(yīng)用于中成藥尚有一定難度。蛋白質(zhì)、多肽等成分在龜鱉甲類藥材占主要部分，也是其重要的活性成分之一，利用串聯(lián)質(zhì)譜識別不同種源的龜鱉甲類藥材酶解后的溶液，可達(dá)到鑒別的目的。本實驗結(jié)合前期相關(guān)研究，最終建立了適合多種含龜鱉甲類中成藥的串聯(lián)質(zhì)譜特征肽專屬性檢測方法。本實驗所建立的串聯(lián)質(zhì)譜特征肽檢測方法專屬性強，可用于含龜鱉甲類成分中成藥質(zhì)量控制，鑒于每種中成藥中龜鱉甲類藥材的投料比例有所不同，建議檢測時適當(dāng)調(diào)整取樣量，本課題組下一步將擬研究建立含龜鱉甲類成分中成藥特征離子含量測定方法，用于該類中成藥的控制質(zhì)量。

研究發(fā)現(xiàn)，由于多為生粉投料，含龜鱉甲類成分中成藥采用超聲法提取效率不高[17-18]，最終確定采用加熱回流提取法提取，效果較好。研究還發(fā)現(xiàn)，對照品酶解液含較多雜質(zhì)會對檢測結(jié)果有影響，可用固相萃取小柱來凈化，先用5%甲醇可清洗極性大的蛋白質(zhì)等物質(zhì)和鹽，也可以防止孔堵塞，再20%酸性乙腈可洗脫目標(biāo)物，非目標(biāo)物留在固相萃取小柱上，達(dá)到了凈化酶解液的目的。

從實驗結(jié)果分析，由于龜甲價格遠(yuǎn)高于巴西紅耳龜甲，龜甲類成分中成藥中主要混偽品為巴西紅耳龜甲[3]，質(zhì)量不容樂觀，建議急需加強監(jiān)管。另外，含鱉甲類成分中成藥檢測結(jié)果，僅1批檢出混淆珍珠鱉甲類成分，表明質(zhì)量狀況尚好，可能因為鱉養(yǎng)殖量已經(jīng)非常大，成熟的養(yǎng)殖技術(shù)完全能夠滿足臨床用藥需要。