張成明， 董保成， 李硯飛， 劉曉玲， 白耀博， 曹 丹， 劉 潔， 李十中

(1.徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 徐州市生物制藥與廢棄物綜合利用工程中心， 江蘇 徐州 221006； 2.清華大學(xué)，核能與新能源技術(shù)研究院，中美生物燃料聯(lián)合研究中心， 北京 100084； 3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)生態(tài)與資源保護(hù)總站， 北京 100125； 4.天津大學(xué) 化工學(xué)院， 天津 300350； 5.青縣新能源技術(shù)推廣中心， 河北 滄州 062650； 6.中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院， 北京 100012)

隨著大型養(yǎng)殖場(chǎng)的興建與運(yùn)營(yíng)，養(yǎng)殖業(yè)在給社會(huì)提供了大量產(chǎn)品的同時(shí)，也帶來(lái)一些環(huán)境污染隱患。其中，養(yǎng)殖糞污已經(jīng)成為人們必須面對(duì)的問題。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全國(guó)每年產(chǎn)生畜禽糞污38 億噸。畜禽糞污價(jià)值高，但未充分利用。奶牛在我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)中占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，牛糞的合理處理也引起眾多學(xué)者的興趣，并取得很多重要成果。目前牛糞的處理方法包括厭氧消化、好氧堆肥、制作墊床、制備生物炭、養(yǎng)殖蚯蚓等[1-2]。各種方式均各有利弊，在特定條件下都有所應(yīng)用。采用厭氧消化技術(shù)對(duì)牛糞進(jìn)行處理，在回收能量的同時(shí)，還可以實(shí)現(xiàn)對(duì)糞污的減量化、無(wú)害化，以及高值化利用。厭氧消化結(jié)束后的沼液、沼渣通過(guò)深加工可以生產(chǎn)出高品質(zhì)的有機(jī)肥，在獲得良好經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)也可以獲得良好的生態(tài)效益和社會(huì)效益[3]。

牛糞屬于纖維質(zhì)類原料，在其厭氧消化過(guò)程中，水解步驟是整個(gè)過(guò)程的限速步驟。為了提高纖維質(zhì)原料的可生化性，在厭氧消化及纖維素乙醇領(lǐng)域，發(fā)展起了多種有效的原料預(yù)處理方式。常見的預(yù)處理方式包括物理法、化學(xué)法和生物法[4-6]。物理法較常用的為粉碎、汽爆、熱水解、輻射等，化學(xué)法常用的為酸處理、堿處理、濕法氧化、離子液體等。常用的生物預(yù)處理方法包括真菌處理、菌群、酶處理等[7-11]。在酶處理法中，常用的酶包括纖維素酶、半纖維素酶、植酸酶，以及漆酶等。李秋園[12]以木糖渣為底物，考察了纖維素酶預(yù)處理對(duì)其沼氣發(fā)酵的影響。結(jié)果表明，當(dāng)纖維素酶添加量為40 FPU·g-1時(shí)，試驗(yàn)組總固形物和揮發(fā)性固形物的利用率分別提高了19.47%和21.85%，產(chǎn)氣量是對(duì)照組的2.34倍。王婷婷[13]等將酶(耐高溫α-淀粉酶(13.4 U·g-1)、糖化酶(4.9 U·g-1)和纖維素酶(0.8 FPU·g-1)與酒糟進(jìn)行混合，然后直接進(jìn)行干式沼氣發(fā)酵。結(jié)果表明，加酶后沼氣產(chǎn)量增加24.7%，底物甲烷得率增加36.8%。

為了減少預(yù)處理的設(shè)備投資和節(jié)省預(yù)處理時(shí)間，結(jié)合牛糞的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及厭氧消化過(guò)程pH值中性略偏堿性的特性，本文擬采用添加中性纖維素酶來(lái)改善牛糞的厭氧消化性能。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

牛糞取自徐州某奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)。自然風(fēng)干后，粉碎后，過(guò)20目篩保存。厭氧污泥取自彭城啤酒廠。工業(yè)級(jí)中性纖維素酶由某有限公司提供，由真菌經(jīng)液體深層發(fā)酵制得，主要為內(nèi)切纖維素酶，并含有較低活力的外切纖維素酶和β-葡萄糖苷酶組分。酶的最適溫度為55℃～80℃，有效溫度25℃～85℃；最適pH值6.0～7.5，有效作用pH值 4.5～9.0。酶活≥5000 FPU·mL-1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 厭氧消化條件

采用甲烷潛力分析儀進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(AMPTS II，碧普)，反應(yīng)瓶體積500 mL，裝液量400 mL，產(chǎn)氣量采用排水集氣法，采用 2 mol·L-1NaOH溶液吸收CO2，獲得的體積為甲烷體積。厭氧系統(tǒng)總固形物(Total solids, TS)為7%，接種物和底物揮發(fā)性固形物(Volatile solids, VS)比為2∶1，發(fā)酵溫度35℃±2℃。根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中性纖維素酶使用量。以牛糞固形物含量為基礎(chǔ)添加，添加量分別為0，50，100，150，200 FPU·g-1TS。加入不同濃度的纖維素酶后，不進(jìn)行單獨(dú)的預(yù)處理實(shí)驗(yàn)，直接進(jìn)行厭氧消化。

1.2.2 檢測(cè)方法

TS，VS，氨氮，化學(xué)需氧量(Chemical oxygen demand, COD)含量測(cè)定見參考文獻(xiàn)[14]。

2 結(jié)果與討論

實(shí)驗(yàn)檢測(cè)和計(jì)算牛糞厭氧消化過(guò)程中的甲烷日產(chǎn)氣量、甲烷累積產(chǎn)氣量以及底物甲烷得率來(lái)反映牛糞的厭氧消化性能。

2.1 中性纖維素酶對(duì)牛糞厭氧消化性能的影響

添加中性纖維素酶后，所有實(shí)驗(yàn)組均出現(xiàn)多個(gè)產(chǎn)氣高峰，酶添加量不同，對(duì)日產(chǎn)氣規(guī)律影響顯著(見圖1)。對(duì)于所有的實(shí)驗(yàn)組，發(fā)酵開始第1天出現(xiàn)產(chǎn)氣高峰，且明顯高于隨后的日產(chǎn)氣量。這是因?yàn)槲⑸锟梢钥焖倮门＜S中的溶出組分以及酶液中部分有機(jī)物進(jìn)行產(chǎn)氣造成的。酶添加量從0 到200 FPU·g-1時(shí)，最高日產(chǎn)氣量分別為88.3，127.1，185.6，165.4和208.2 mL。第1高峰過(guò)后產(chǎn)氣短暫回落，酶添加量為0，50和100 FPU·g-1試驗(yàn)組產(chǎn)氣在第4～8天時(shí)分別出現(xiàn)第2個(gè)產(chǎn)氣高峰，最高產(chǎn)氣量分別為37.4，41.3和43.7 mL。隨后日產(chǎn)氣量不斷減少，至發(fā)酵結(jié)束。當(dāng)酶的添加達(dá)到150 FPU·g-1時(shí)，第1高峰結(jié)束后，從第2天至11天產(chǎn)氣量較低，保持在15～25 mL。隨后產(chǎn)氣量緩慢增加，第2產(chǎn)氣高峰出現(xiàn)在第22天，達(dá)到45.4 mL。當(dāng)酶的添加量為200 FPU·g-1時(shí)，第1產(chǎn)氣高峰值最高，為208.2 mL。但直到發(fā)酵23 d時(shí)，日產(chǎn)氣量均保持在很低的水平。從第24天開始，日產(chǎn)氣量維持在20～25 mL，直到第39天，出現(xiàn)一個(gè)產(chǎn)氣相對(duì)穩(wěn)定的時(shí)期。根據(jù)圖1所示，當(dāng)中性纖維素酶添加量超過(guò)150 FPU·g-1時(shí)，在厭氧消化過(guò)程中出了一個(gè)持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)的產(chǎn)氣高峰。這與纖維素質(zhì)原料經(jīng)過(guò)堿預(yù)處理的產(chǎn)氣規(guī)律很類似[5]。數(shù)據(jù)也說(shuō)明，將中性纖維素酶直接加入到厭氧消化系統(tǒng)中也是可行的。

圖1 不同纖維素酶添加量時(shí)牛糞的日甲烷產(chǎn)氣量

如圖2所示，隨著中性纖維素酶使用量的增加，甲烷總產(chǎn)氣量逐漸增加，但是在高濃度添加酶時(shí)除了一定的產(chǎn)氣延遲。對(duì)照組牛糞累積甲烷產(chǎn)量為773.1 mL，酶使用量從50 FPU·g-1增加到200 FPU·g-1時(shí)，累積產(chǎn)氣量分別為770.3，857.6，118.4和1085.6 mL。當(dāng)酶使用量100 FPU·g-1時(shí)，相應(yīng)實(shí)驗(yàn)組出了較為明顯的產(chǎn)氣延遲。

圖2 不同纖維素酶添加量時(shí)牛糞的累積甲烷產(chǎn)氣量

2.2 中性纖維素酶對(duì)提高牛糞甲烷得率的影響

根據(jù)甲烷累計(jì)產(chǎn)氣量以及實(shí)驗(yàn)中添加的牛糞質(zhì)量(8 g)可以出不同實(shí)驗(yàn)條件下牛糞的甲烷得率(見圖3)。在不考慮發(fā)酵周期的情況下，隨著中性纖維素酶的添加，牛糞的甲烷得率在不斷增加，分別為96.6，96.3，107.2，127.3和135.7 mL·g-1。與對(duì)照組相比分別增加0%，11%，32%和40%。數(shù)據(jù)表明，當(dāng)中性纖維素酶使用量較低時(shí)，對(duì)底物甲烷得率沒有影響；而隨著中性纖維素酶使用量的增長(zhǎng)，酶對(duì)底物甲烷得率的促進(jìn)作用愈發(fā)明顯。這從另外一個(gè)角度說(shuō)，中性纖維素酶的加入可以促進(jìn)牛糞的降解率。

圖3 中性纖維素酶對(duì)底物甲烷得率的影響

為了評(píng)估酶使用量對(duì)甲烷產(chǎn)量的影響，計(jì)算得到甲烷增加量和酶使用量(底物TS質(zhì)量×酶添加濃度)的比值，并以酶添加濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行了作圖(見圖4)。

圖4 單位酶對(duì)牛糞甲烷產(chǎn)量的貢獻(xiàn)

如圖4所示，隨著酶使用量的增加，單位酶對(duì)產(chǎn)氣的貢獻(xiàn)也在增加，但是很快就達(dá)到了平衡。當(dāng)酶添加比例為100 FPU·g-1時(shí)，酶對(duì)產(chǎn)氣額貢獻(xiàn)為0.11，而當(dāng)酶添加濃度為150和200 FPU·g-1時(shí)，酶的功效值均為0.20。這意味著，即使進(jìn)一步增加酶的使用量，酶對(duì)產(chǎn)氣的貢獻(xiàn)也不會(huì)再增加了。這一數(shù)據(jù)有助于在工程實(shí)踐中進(jìn)行經(jīng)濟(jì)核算。

2.3 產(chǎn)氣現(xiàn)象的初步分析

本實(shí)驗(yàn)中，厭氧消化體系的固形物濃度較低(7%)，且底物(牛糞)為難降解性物質(zhì)，因此，不會(huì)出現(xiàn)有機(jī)負(fù)荷過(guò)高而導(dǎo)致產(chǎn)氣延遲的結(jié)果。中性纖維素酶是本實(shí)驗(yàn)唯一引入的外源物質(zhì)，因此，產(chǎn)氣高峰延遲的原因應(yīng)該是由酶引起的。在絕大多數(shù)情況下，酶就是蛋白質(zhì)，在合適的厭氧消化條件下，蛋白質(zhì)會(huì)被分解為氨氮，而氨氮是常見的厭氧消化的抑制物。因此，對(duì)發(fā)酵結(jié)束后沼液中的氨氮進(jìn)行了檢測(cè)，以評(píng)估氨氮的抑制性。此外，對(duì)沼液的COD也進(jìn)行了檢測(cè)，以衡量體系中有機(jī)物的降解情況。結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同中性纖維素酶添加時(shí)厭氧消化結(jié)束后沼液中的氨氮和COD濃度

如圖5所示，隨著酶添加量的增加厭氧消化液中的氨氮濃度也隨之增加了。未添加纖維素酶時(shí)，最終體系的氨氮濃度為729 mg·L-1，當(dāng)酶添加量從5 FPU·g-1增加到20 FPU·g-1時(shí)，氨氮濃度從1027 mg·L-1增加到了1835 mg·L-1。通常認(rèn)為，當(dāng)氨氮濃度超過(guò)1000 mg·L-1時(shí)，會(huì)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)生一定的抑制。有研究表明，當(dāng)氨氮濃度到達(dá)1.7～14 g·L-1時(shí)，甲烷產(chǎn)量減少50%。需要說(shuō)明的是，氨氮對(duì)厭氧消化的抑制濃度與底物種類、微生物種群對(duì)氨氮的適應(yīng)性、厭氧消化體系的TS濃度，溫度，pH值等因素均有關(guān)[15-17]?，F(xiàn)有數(shù)據(jù)表明，氨氮確實(shí)有可能會(huì)造成本實(shí)驗(yàn)中的產(chǎn)氣延遲。但這僅僅是一種可能，這一結(jié)論需要深入細(xì)致的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)來(lái)進(jìn)行證實(shí)。氨氮也是目前大規(guī)模沼氣工程面臨的一個(gè)現(xiàn)實(shí)的技術(shù)問題。對(duì)于如何實(shí)現(xiàn)沼液的高效、低成本脫氨，有很多學(xué)者進(jìn)行了研究[18]。此外，圖1中的日產(chǎn)氣數(shù)據(jù)表明，中性纖維素酶在厭氧消化體系可以在很長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)維持活性，而不是被很快的分解掉。王婷婷[13]等也證實(shí)，直接將酶加入到厭氧消化體系中也可以起到促進(jìn)底物沼氣發(fā)酵的作用。這說(shuō)明，纖維素酶在厭氧消化體系中是可以長(zhǎng)時(shí)間發(fā)揮作用的。

牛糞本身的溶解性很差，在厭氧消化結(jié)束后，消化液的COD會(huì)維持在一個(gè)較低的水平。結(jié)果表明，隨著酶添加量增加，發(fā)酵結(jié)束后消化液的COD也隨之增加了(見圖5)，這有些出乎意料。發(fā)酵結(jié)束后，對(duì)照組的COD為1.34 g·L-1，當(dāng)酶添加50 FPU·g-1和100 FPU·g-1時(shí)，COD增加不明顯，分別為1.52 g·L-1和1.75 g·L-1。而隨著酶添加量的增加，發(fā)酵液中COD明顯增加，最高達(dá)5.69 g·L-1(200 FPU·g-1)。數(shù)據(jù)表明，當(dāng)酶添加量較高時(shí)，系統(tǒng)中的有機(jī)物殘留顯著增加了。這里潛在的原因包括： 1)中性纖維素酶本身帶入了一些無(wú)法被微生物分解的物質(zhì)； 2)中性纖維素酶作用于牛糞使其分解，進(jìn)而產(chǎn)生了一些難降解的物質(zhì)。具體的原因需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。

3 結(jié)論

直接向厭氧消化體系中添加中性纖維素酶可以提高牛糞的甲烷得率，這為纖維素酶的市場(chǎng)開拓提供了一個(gè)新的視角。本實(shí)驗(yàn)中酶制劑的使用量是比較高的，這應(yīng)該是由于厭氧消化體系的含水量過(guò)高造成的。在實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)充分考慮厭氧消化改善帶來(lái)的收益與酶制劑使用帶來(lái)的成本之間的平衡。中性纖維素酶在高劑量添加時(shí)會(huì)造成產(chǎn)氣高峰的延遲，原因需要進(jìn)一步分析。在后續(xù)研究中，可以考察固定化技術(shù)在該領(lǐng)域的應(yīng)用以降低酶的成本。