王玉龍，林青，孫亞慧，王文琳，張津源，周瑋

（1.大連海洋大學,水產(chǎn)與生命學院，遼寧 大連 116023；2.遼寧輕工職業(yè)學校，遼寧 大連 116100；3.大連?？h(huán)境監(jiān)測科技有限公司，遼寧 大連 116000）

刺參（Apostichopus japonicus）營養(yǎng)和經(jīng)濟價值較高，已經(jīng)成為遼寧和山東等地的重要養(yǎng)殖對象之一[1-3]。2018 年全國海參產(chǎn)量約1.74 萬t，養(yǎng)殖面積達到2.38 萬hm2[4]。刺參多以池塘養(yǎng)殖為主。為打破制約刺參養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的瓶頸，近年來大力推廣微孔曝氣裝置，輔助調(diào)控水質(zhì)取得了很好的效果。如快速增氧和去除底泥中有機質(zhì)等，但在使用過程中存在易堵塞和維護費用高的缺點[5,6]。本研究團隊研發(fā)了養(yǎng)水機輔助水質(zhì)調(diào)控設備，在實際調(diào)控水質(zhì)中較于前兩種方式具一定優(yōu)勢[7-9]。

在生產(chǎn)中，可通過換水和水質(zhì)調(diào)控設備輔助保持較好養(yǎng)殖水質(zhì)，但環(huán)境中微生物在養(yǎng)殖池塘中物質(zhì)循環(huán)和能量流動、改善水質(zhì)環(huán)境以及刺參健康中起到了關鍵作用[10]。如假交替單胞菌（Pseudoalteromonas nigrifaciens）、假單胞菌（Pseudoalteromonas）和溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）等都可使刺參患病[11-13]。而枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）和乳酸菌（Lactic acid bacteria,LAB）等，對養(yǎng)殖環(huán)境水質(zhì)的改善、提高養(yǎng)殖生物的非特異性免疫酶活性以及促進養(yǎng)殖生物生長等都有明顯的作用[14-16]。秋季是刺參重要的生長期，養(yǎng)殖環(huán)境的變化會對刺參的生長有一定的影響。因此，對秋季刺參養(yǎng)殖池塘環(huán)境中菌群結(jié)構(gòu)的研究具有重要的意義。

傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)方法存在一定局限性，無法滿足細菌群落結(jié)構(gòu)研究的需要[17,18]。近年來，隨著分子生物學的發(fā)展，尤其是高通量測序技術發(fā)展，是研究環(huán)境中菌群結(jié)構(gòu)的重要手段[19,20]。目前對刺參池塘養(yǎng)殖中菌群結(jié)構(gòu)的研究，多利用DGGE 指紋圖譜技術[21,22]，其存在反應優(yōu)勢菌信息少和操作繁瑣等問題，而利用16S rDNA 高通量技術研究刺參養(yǎng)殖池塘的菌群結(jié)構(gòu)，則應用優(yōu)勢明顯[10]。本研究利用該技術研究了自然納潮、微孔曝氣和養(yǎng)水機3 種水質(zhì)管理方式下，參池環(huán)境中的菌群結(jié)構(gòu)，以期為參池管理方式的選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗在大連市青堆子海域（N39.78°,E123.32°）的自然納潮、微孔曝氣和養(yǎng)水機池塘3 種海參養(yǎng)殖池中進行。試驗池均為矩形，面積都為5.1 hm2，池塘內(nèi)南深北淺，泥沙池底。實驗期間各池塘不投餌和藥，統(tǒng)一管理。

養(yǎng)水機是本研究團隊自主研發(fā)的新型水質(zhì)調(diào)控裝置（專利號：ZL200610077526.5）見圖1。其工作原理是通過進水管道把池塘表層溶氧量相對較高的水引入到底層動力泵，通過動力泵把表層高溶氧量的水射入底層水體中，實現(xiàn)表底層水體強制交換，使得養(yǎng)殖池塘水體的流動加快，并增加底層水體的溶氧量。此外，水體的強制交換過程有利于養(yǎng)殖池塘水體表底層的混合均勻，對于養(yǎng)殖池塘水體會出現(xiàn)的溫度和鹽度的分層具有一定的破壞作用，可以降低因水體分層造成養(yǎng)殖池塘底層水體缺氧現(xiàn)象的發(fā)生。養(yǎng)水機位于池塘進水口最低處，水泵功率750 W，噴頭出水量為12 m3/h，每天21:00—次日9:00 工作12 h。

圖1 養(yǎng)水機模擬圖Fig.1 Diagram of a water quality regulator

微孔曝氣主要由供氣裝置、氣體傳輸管道和微孔曝氣管三部分組成。其工作原理是將空氣壓縮后通過安裝在池底的曝氣管，以微氣泡的形式向水中擴散。微孔曝氣設備在池塘水體缺氧時開啟，如陰雨天和夏季高溫期適當增加開機時間。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集

2017 年11 月按照《國家海洋調(diào)查規(guī)范》（GB/T12763）的方法采集三種實驗池塘水樣和泥樣，樣品標記信息見表1。樣品立即放入-80℃液氮冷凍后，再用干冰冷凍運送到北京諾禾致源科技股份有限公司測定。具體的樣品采集步驟見參考文獻郭超等[23]。每個樣品采集點采集兩個平行樣品。

表1 樣品標記信息Tab.1 Labels of the samples

1.2.2 樣品DNA 提取、PCR 擴增和測序

用CTAB 法提取樣本DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA，確保取得樣品DNA 的完整性。條帶清晰完整無拖尾則視為采集的樣品質(zhì)量合格。使用NanoPhotometerClassic Launched（IMPLEN,GER）測定其純度，提取成功樣品的DNA 保存于-20℃下備用。

應用含有Illumina 接頭和barcode 序列的引物341F-806R（Michelsen C F），擴增樣品中DNA 的16S rRNA 基因的V3～V4 可變區(qū)。最后應用Illumina Miseq 測序平臺完成序列測序。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理及生物信息學分析

首先，處理獲得的原始序列，保留有效序列。接著使用FLASH 和QIIME[24,25]軟件將序列拼接為tags，然后對tags 進行聚類。根據(jù)Greengenes 數(shù)據(jù)庫進行分類學注釋。最后，計算各個樣品的細菌群落相對豐度。應用PAST 軟件[24]計算6 個樣品中的細菌群落的α-多樣性。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌群落分類學注釋

由圖2 可知，6 個樣品中總tags 平均值為81 111，可分類的tags 平均值為70 794，無法分類的tags 平均值為2，非沉余tags 平均值為10 315，運算分類單元平均值為926。

圖2 三種刺參池塘水體和底泥微生物群落高通量測序得到的序列數(shù)目及運算分類單元數(shù)目Fig.2 The number of sequences of the microbial communities and the number of operational taxa in the waters and sediments in the three sea cucumber culture ponds by high-throughput sequencing

在養(yǎng)水機池塘水體和底泥中分別檢測出47 個門、100 個綱、448 個屬和56 個門、107 個綱、362 個屬的細菌。微孔曝氣池塘水體和底泥中分別檢測出44 個門、127 個綱、386 個屬和60 個門、128 個綱、450 個屬的細菌。自然納潮池塘水體和底泥中分別檢測出44 個門、98 個綱、398 個屬和55 個門、107個綱、440 個屬的細菌。

2.2 細菌群落結(jié)構(gòu)分析

三種刺參養(yǎng)殖池塘水體和底泥菌群結(jié)構(gòu)特征見圖3。由圖3 可知：在門水平上，三種池塘6 個樣品中相對豐富度占比前10 的門（圖3-a）分別為：變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、藍細菌門（Cyanobacteria）、浮霉菌門（Planctomycetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinocteria）和芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）。其占比為92.96%～99.05%。三種池塘底泥和水體中的絕對優(yōu)勢菌門都是變形菌門，相對豐富度占55.86%～70.86%。

圖3 不同水質(zhì)調(diào)控方式下參池養(yǎng)殖環(huán)境中菌群結(jié)構(gòu)特征Fig.3 Characteristics of bacterial flora in sea cucumber culture ponds under different water quality regulation methods

在綱水平上，6 個樣品中相對豐富度占比前10的綱（圖3-b）占比67.22%～92.76%。三種池塘底泥和水體中的絕對優(yōu)勢菌門都是變形菌門，相對豐富度占比55.86%～70.86%。在水樣中三種池塘的Alphaproteobacteria 和Gammaproteobacteria 都是占比前兩位的優(yōu)勢菌綱，相對豐度占比42.13%～63.45%。三種池塘的底泥樣品中Gammaproteobacteria 和Deltaproteobacteria 都是占比前兩位的優(yōu)勢菌綱，相對豐度占38.54%～50.56%。

在屬水平上，6 個樣品中相對豐富度占比前30的屬（圖3-c）占比15.16%～47.04%。在6 個樣品中各自的第一優(yōu)勢菌屬有所不同，養(yǎng)水機池塘水樣中未確定（unidentified）的_Chloroplast（相對豐度為7.37%），微孔曝氣和自然納潮池塘是Lentibacter（相對豐度為13.17%和7.70%）。養(yǎng)水機池塘底泥樣品中是Desulfobulbus（相對豐度分別為1.94%），微孔曝氣和自然納潮池塘是Sulfurovum（相對豐度分別為5.84%和4.88%）。

2.3 菌群多樣性

2.3.1 α-多樣性分析

6 個樣品的文庫覆蓋率均大于0.970，說明本試驗數(shù)據(jù)具有較高的可信度。三種不同池塘底泥和水體樣本細菌群落的α-多樣性指數(shù)值見表2。由表2 可知，養(yǎng)水機池塘水樣中Chao、AC、Shannon 和Simpson 指數(shù)最高，微孔曝氣池塘水樣的Chao、ACE、Shannon 和Simpson 指數(shù)最低。

表2 不同水質(zhì)調(diào)控方式下池塘細菌的高通量測序結(jié)果Tab.2 High throughput sequencing results of bacteria in sea cucumber culture ponds under different water quality control methods

養(yǎng)水機池塘泥樣中Chao 和ACE 指數(shù)最低。自然納潮池塘的Shannon 指數(shù)最低。微孔曝氣池塘的Chao、ACE 和Shannon 指數(shù)都最高，而Simpson 指數(shù)最低。三種池塘的Simpson 指數(shù)一致。

隨著隨機抽取的序列總數(shù)的增加，Chao1、observed species 和Shannon 曲線圖（圖4），各個樣品的三種曲線到達60 000 這個臨界值時都趨于平緩，表示測序結(jié)果已經(jīng)可以反映當前樣品所包含的多樣性。繼續(xù)增加測序深度已不能檢測到數(shù)量較多且尚未發(fā)現(xiàn)的新類型OUT。

圖4 OUT 數(shù)目的稀釋曲線圖Fig.4 Dilution curve of OUT number

2.3.2 β-多樣性分析

由圖5 可知，第1 主坐標（PCoA1）、第2 主坐標（PCoA2）和第3 主坐標（PCoA3）的貢獻率分別為17.54%、12.28%和6.61%，三者累計貢獻率為36.43%。三種池塘水樣與底泥樣品的距離相對較遠。水樣的樣品中微孔曝氣池塘和自然納潮池塘距離較近，而養(yǎng)水機池塘與其他兩種池塘相聚較遠，但離泥樣的距離比其他兩種池塘要近。在底泥樣品中養(yǎng)水機池塘與自然納潮池塘較近，這兩種池塘較微孔曝氣池塘較遠。這表明在水樣中微孔曝氣池塘和自然納潮池塘菌群結(jié)構(gòu)差異性小，相似度高。而在底泥樣品中養(yǎng)水機池塘和自然納潮池塘菌群結(jié)構(gòu)差異性小，相似度高。

圖5 UniFrac PCoA 分析的樣品三維排序圖Fig.5 3 D ordered map of Sample dilution curve by UniFrac PCoA analysis

3 討論

3.1 不同水質(zhì)調(diào)控方式下參池環(huán)境中菌群多樣性

Chao1、ACE、Shannon 和Simpson 指數(shù)可用于評價細菌群落多樣性、物種豐富度和均勻度。根據(jù)保險假說（Insurance hypothesis），高生物多樣性有利于提高生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性[27]。表2 中三種池塘的Chao1、ACE、Shannon 和Simpson 指數(shù)都是底泥中高于水中，這與閆法軍等[28]和Zhao 等[29]的研究結(jié)果一致。這是因為海洋沉積物表層環(huán)境微生物量約占到海洋微生物總量的70%[30]。三種池塘水環(huán)境中，養(yǎng)水機池塘的Chao1、ACE、Shannon 和Simpson 指數(shù)均最高，微孔曝氣池塘最低。這是因為養(yǎng)水機池塘長時間的水體循環(huán)，使得池塘內(nèi)各水層間的浮游植物量和菌群分布相較于其他兩個池塘更為均勻[31,32]。浮游植物光合作用產(chǎn)生的有機質(zhì)會促進細菌的大量繁殖[31]。其次，養(yǎng)水機長時間的工作使水體擾動，底泥中的細菌隨著再懸浮顆粒進入水體。圖5 的UniFrac PCoA 分析中表明，養(yǎng)水機池塘水中樣品離底泥樣品比其他兩種池塘更近，可能與這個原因有關。雖然，微孔曝氣池塘同樣會造成水體擾動，但其在實際生產(chǎn)使用主要是為了快速給池塘增氧，開機時間相對較短，不會產(chǎn)生像養(yǎng)水機池塘那樣明顯的效果。高溶氧量會抑制厭氧細菌[10]。但三種池塘底泥中的結(jié)果反之。有研究表明，有機物含量對環(huán)境中菌群的多樣性和豐度有正相關關系[30,34-36]。因此，養(yǎng)水機池塘水環(huán)境中菌群多樣性最高。這對于水體較淺易受外界環(huán)境影響的刺參池塘，有利于養(yǎng)殖水體環(huán)境的穩(wěn)定，可以一定程度抑制病原菌的大量繁殖，有利于刺參的存活。

3.2 不同水質(zhì)調(diào)控方式參池環(huán)境中菌群特征

近年來，對刺參池塘環(huán)境中菌群群落組成已有報道。譚八梅等[37]、丁斯予等[38]和Zhao 等[29]研究發(fā)現(xiàn)，秋季刺養(yǎng)殖池塘水體和底泥中，第一和第二優(yōu)勢菌門均為變形菌門和擬桿菌門，前者為絕對優(yōu)勢菌門。這與本研究的3 種刺參養(yǎng)殖池塘的水體和底泥中菌群組成結(jié)果相似，其中，三種池塘的第一優(yōu)勢菌門一致，為變形菌門（相對豐度為55.86%以上）。由圖3-a 可知，在刺參養(yǎng)水機池塘水體的第二優(yōu)勢菌門為厚壁菌門，其他兩種池塘都為擬桿菌門。這可能是因為水溫的降低使得養(yǎng)水機池塘水體中厚壁菌門相對豐度變大[36]。微生物在分解底泥中有機質(zhì)時釋放熱量會使間隙水水溫升高8.5℃[39,40]。夜間養(yǎng)水機設備工作時，將表層的低溫水與底層高溫水交換，使得池塘內(nèi)底層水體溫度加速下降。而芽孢桿菌綱內(nèi)的物種具有較強的環(huán)境適應性[41]。因此養(yǎng)水機池塘內(nèi)第二優(yōu)勢菌門有別于其他兩種池塘。董春光等[14]發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門的枯草芽孢桿菌對養(yǎng)殖水體中的NO3--N 和NO2--N 有一定的去除作用，提升養(yǎng)殖水質(zhì)的同時促進了刺參的生長。養(yǎng)水機池塘水體環(huán)境在一定程度上要優(yōu)于其他兩種池塘。

在養(yǎng)水機、微孔曝氣和自然納潮3 種水質(zhì)調(diào)控方式下，刺參養(yǎng)殖池塘底泥中，第二優(yōu)勢菌門分別為擬桿菌門、綠灣菌門和厚壁菌門。養(yǎng)水機池塘和微孔曝氣池塘與其他的研究結(jié)果不一致，可能是因為增加水體溶氧量時對水體產(chǎn)生擾動有關。姚麗平[42]研究發(fā)現(xiàn)，不同曝氣強度影響底泥中細菌結(jié)構(gòu)分布和其在物質(zhì)循環(huán)過程中的作用。如流速為0.247 m/s、對應溶氧為6.18 mg/L、雷諾數(shù)為1 311 的曝氣條件下，以厚壁菌門和變形菌門為優(yōu)勢菌群，且對硫酸鹽還原菌生長有促進作用。自然納潮池塘厚壁菌門中的芽孢桿菌綱（Bacilli）和梭菌綱（Clostridia）為主要優(yōu)勢菌綱，其相對豐度分別為7.07%和3.83%（圖3-b）。孫永旭等[43]研究發(fā)現(xiàn)，缺氧組花鱸（Lateolabrax maculatus）腸道菌群變形菌門相對豐度顯著下降，而梭菌綱和擬桿菌綱明顯上升。自然納潮池塘相較于其他兩種池塘，細菌豐度變化趨勢與缺氧組花鱸腸道菌群豐度一致，說明自然納潮池塘的溶氧要低于其他兩種池塘。三種池塘中優(yōu)勢菌門、綱和屬是一致的（圖3），其差異主要表現(xiàn)在各優(yōu)勢菌門的相對豐度有所不同。這可能是養(yǎng)殖池塘內(nèi)環(huán)境不同所致[44,45]。說明刺參養(yǎng)殖池塘管理方式的不同，不能改變養(yǎng)殖環(huán)境中優(yōu)勢菌群結(jié)構(gòu)，但可以改變優(yōu)勢菌群的相對豐度。