張婧怡，余璠，葛家春，黃成，劉茂松

（1.南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210023;2.江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇 南京 210017）

中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）又稱河蟹，是中國(guó)本土的重要水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)物種[1,2]。高錳酸鉀（potassium permanganate）是水產(chǎn)養(yǎng)殖的傳統(tǒng)藥物[3]，主要采用浸泡法和潑灑法用于防治細(xì)菌性疾病、真菌性病害和水體環(huán)境的消毒[4]。它與有機(jī)物體接觸，使酶蛋白和原漿蛋白中的活性基團(tuán)如巰基（-SH）迅速氧化變?yōu)槎蜴湥?S-S）而失活，起到殺菌作用[5]。目前高錳酸鉀對(duì)魚類血液、味覺(jué)結(jié)構(gòu)等毒性影響已有許多報(bào)道[6,7]。Darwish 等[8]研究發(fā)現(xiàn)高錳酸鉀損傷斑點(diǎn)叉尾（Ictalurus punctatus）鰓。高錳酸鉀對(duì)河蟹纖毛蟲、顫抖病、擬阿腦蟲病、蟹奴病以及弧菌病等病害有一定的治療效果[9-11]。但高濃度高錳酸鉀會(huì)導(dǎo)致水產(chǎn)動(dòng)物中毒死亡[12]，一般認(rèn)為高錳酸鉀濃度越高毒性越強(qiáng)。

本研究采用靜水生物毒性實(shí)驗(yàn)，在測(cè)定高錳酸鉀溶液對(duì)河蟹半致死及安全濃度的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究早熟蟹和幼蟹在安全濃度的高錳酸鉀溶液下的生長(zhǎng)，以期為幼蟹育苗中用藥方法、劑量和浸浴時(shí)間提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

篩選300 只無(wú)損傷、活動(dòng)能力強(qiáng)、規(guī)格一致的河蟹進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其中早熟蟹150 只，幼體蟹150 只，各組雄、雌蟹數(shù)量比例接近1∶1。

高錳酸鉀晶體采用上海聯(lián)試化工試劑有限公司產(chǎn)品，純度99.5%。試驗(yàn)容器為容積50 L 的塑料水箱，實(shí)驗(yàn)前對(duì)塑料水箱進(jìn)行徹底清洗。試驗(yàn)用水為曝氣24 h 后靜置的自來(lái)水。

1.2 方法

1.2.1 河蟹靜水毒性實(shí)驗(yàn)

早熟蟹毒性實(shí)驗(yàn)按等比間距設(shè)置7 個(gè)高錳酸鉀濃度梯度：32 mg·L-1、64 mg·L-1、128 mg·L-1、256 mg·L-1、512 mg·L-1、1 024 mg·L-1和2 048 mg·L-1。幼蟹毒性實(shí)驗(yàn)設(shè)置4 個(gè)濃度梯度：16mg·L-1、32 mg·L-1、64 mg·L-1和128 mg·L-1，每組各16 只。

各組實(shí)驗(yàn)中高錳酸鉀溶液深度均高于河蟹，每隔6 h 記錄河蟹的存活情況，每隔24 h 更換一次高錳酸鉀溶液。實(shí)驗(yàn)持續(xù)96 h。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中水溫控制在15～20℃。

1.2.2 河蟹生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，將16 mg·L-1高錳酸鉀溶液浸浴96 h 的幼蟹放置清水中飼養(yǎng)，觀察高錳酸鉀損傷后的存活和生長(zhǎng)。

本實(shí)驗(yàn)取體質(zhì)量（7.2±1.5）g 早熟蟹、和體質(zhì)量（5.2±1.3）g 幼體蟹各30 只，分別浸浴在安全濃度10 mg·L-1和5 mg·L-1處理96 h，后轉(zhuǎn)入清水后繼續(xù)飼養(yǎng)1 個(gè)月，以未經(jīng)高錳酸鉀處理的河蟹作對(duì)照，飼養(yǎng)水箱中均添加水花生。

實(shí)驗(yàn)期間及時(shí)清理死亡個(gè)體和廢物。河蟹四肢松散無(wú)力，用潔凈的玻璃棒輕輕觸碰無(wú)明顯反應(yīng)，且用濾網(wǎng)撈出至清水10 min 內(nèi)無(wú)任何反應(yīng)時(shí)判定死亡。實(shí)驗(yàn)期間對(duì)照組河蟹未出現(xiàn)死亡，實(shí)驗(yàn)組死亡率不需校正。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后根據(jù)實(shí)驗(yàn)對(duì)象的死亡率、高錳酸鉀溶液濃度、實(shí)驗(yàn)對(duì)象的死亡時(shí)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，繪制時(shí)間-劑量-死亡率模型（time-does-mortality model，TDM 模型），利用SPSS 26.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

死亡率=[（初始存活數(shù)-實(shí)際存活數(shù)）/初始存活數(shù)]×100%。

安全濃度SC=96h LC50×0.1。

2 結(jié)果與分析

實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，河蟹活力正常，放入各濃度高錳酸鉀溶液后，開始無(wú)規(guī)則游動(dòng)，后趨于聚集在水箱一側(cè)或角落，活性減弱，基本集群靜伏。

2.1 早熟蟹毒性影響

在1 024 mg·L-1和2 048 mg·L-1高錳酸鉀溶液下，河蟹活動(dòng)頻繁，急躁不安，攀爬水箱壁。96 h 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，32 mg·L-1及以下高錳酸鉀濃度組均未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，而256 mg·L-1及以上高錳酸鉀濃度組在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前所有個(gè)體均死亡（表1）。隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，高錳酸鉀對(duì)河蟹的LC50逐漸降低，安全濃度為10.67 mg·L-1（表2）。對(duì)照組個(gè)體在實(shí)驗(yàn)期間無(wú)死亡。

表1 高錳酸鉀對(duì)早熟蟹的毒性影響Tab.1 Toxicity of potassium permanganate to precocious crab

表2 各記錄時(shí)間下高錳酸鉀對(duì)早熟蟹的半致死濃度Tab.2 The median-lethal concentration（LC50）of potassium permanganate on precocious crab at each recording time

參考時(shí)間-劑量-死亡率模型（time-does-mortality model，TDM 模型），在僅考慮半數(shù)死亡的情況下，計(jì)算各下濃度的LC50后，對(duì)散點(diǎn)進(jìn)行回歸曲線擬合，得到藥物濃度和藥物作用時(shí)間的關(guān)系（圖1），其中t 為藥物作用時(shí)間（h），用于初步判斷特定處理下高錳酸鉀對(duì)個(gè)體的毒性影響。

圖1 早熟蟹在半數(shù)死亡條件下，藥物濃度和作用時(shí)間關(guān)系圖Fig.1 The relationship between drug concentration and exposure time under half death of the crab

2.2 性未成熟幼蟹毒性影響

實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，河蟹活力正常，放入溶液后無(wú)規(guī)則游動(dòng)后，迅速呈現(xiàn)聚集情況，然后趨于穩(wěn)定靜伏。各濃度組在24 h 前均無(wú)死亡。16 mg·L-1及以下高錳酸鉀濃度組個(gè)體在實(shí)驗(yàn)期間均無(wú)死亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)只有128 mg·L-1組所有個(gè)體均死亡（表3）。隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，高錳酸鉀對(duì)河蟹的LC50逐漸降低，安全濃度為5.38 mg·L-1（表4）。實(shí)驗(yàn)期間對(duì)照組無(wú)死亡。

表3 高錳酸鉀對(duì)幼蟹的毒性影響Tab.3 Toxic effects of potassium permanganate on juvenile crabs

表4 各記錄時(shí)間下的幼蟹的半致死濃度Tab.4 The median-lethal concentration（LC50）of potassium permanganate on juvenile crab at each recording time

參考TDM 模型，在僅考慮半數(shù)死亡的情況下，計(jì)算各條件下的LC50后，對(duì)散點(diǎn)進(jìn)行回歸曲線擬合（圖2），得到藥物濃度和藥物作用時(shí)間的關(guān)系為：lnc=117.837/t+2.978，R2=0.870，，其中c 為藥物濃度（mg·L-1），t 為藥物作用時(shí)間（h）。

圖2 幼蟹在半數(shù)死亡條件下，藥物濃度和作用時(shí)間關(guān)系圖Fig.2 The relationship between drug concentration and exposure period under the condition of half of the deaths

2.3 在安全濃度下，高錳酸鉀96 h 浸浴對(duì)早熟蟹及幼體蟹生長(zhǎng)的影響

由表5 可知：實(shí)驗(yàn)組早熟蟹和幼蟹的蛻殼率分別為20%和6.67%，而對(duì)照組則分別為13.33%和43.33%。實(shí)驗(yàn)組早熟蟹的蛻殼率與對(duì)照組沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05），實(shí)驗(yàn)組幼蟹的蛻殼率顯著小于對(duì)照組（P＜0.05）。在組內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組96 h 早熟蟹及幼蟹體質(zhì)量均無(wú)顯著增長(zhǎng)（P＞0.05），對(duì)照組96 h 的幼體蟹體增長(zhǎng)顯著（P＜0.05）。在組間，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組早熟蟹的體質(zhì)量增長(zhǎng)無(wú)顯著性差異（P＞0.05），對(duì)照組幼蟹體質(zhì)量增長(zhǎng)顯著大于實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05）。

表5 高錳酸鉀96 h 浸浴對(duì)早熟蟹及幼蟹生長(zhǎng)的影響Tab.5 Effect of 96 h potassium permanganate bathing on the growth of precocious crab and juvenile crab

3 討論

3.1 高錳酸鉀對(duì)河蟹的存活率的影響

一般認(rèn)為，水生動(dòng)物對(duì)各種藥物的敏感性隨著個(gè)體增大而降低。黃鶴忠等研究表明，河蟹大眼幼體的96 h LC50（半致死濃度）為1.5 mg·L-1[13]。在本實(shí)驗(yàn)中，早熟河蟹和幼蟹的96 h LC50分別為106.64 mg·L-1和53.81 mg·L-1，安全濃度SC 分別為10.66 mg·L-1和5.38 mg·L-1。該結(jié)果表明，幼蟹對(duì)高錳酸鉀濃度比成熟蟹更為敏感。研究發(fā)現(xiàn)，河蟹對(duì)高錳酸鉀的耐受性隨蟹齡增加而增強(qiáng)[14]。朱友芳等研究發(fā)現(xiàn)，中國(guó)花鱸（Lateolabrax japonicus）魚苗和幼魚的高錳酸鉀安全濃度為0.6 mg·L-1和0.9 mg·L-1[15]。譚樹華等[16]和趙朝陽(yáng)等[17]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：高錳酸鉀對(duì)克氏原鰲蝦（Procambarus clarkii）成蝦和幼蝦的安全濃度分別為2.65 mg·L-1和0.44 mg·L-1。這說(shuō)明不同水生動(dòng)物對(duì)高錳酸鉀的敏感性與規(guī)格相關(guān)，毒性隨著生物個(gè)體年齡的增大而逐漸減弱，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。

河蟹幼蟹在高錳酸鉀溶液中浸浴24 h 和48 h均未出現(xiàn)超過(guò)半數(shù)死亡，在本研究中未計(jì)算24 h 和48 h 的半致死濃度。參考時(shí)間-劑量-死亡率模型（time-does-mortality model,TDM 模型），在僅考慮半數(shù)死亡的情況下，得到性成熟蟹和未性成熟幼蟹在半數(shù)死亡條件下，藥物濃度和藥物作用時(shí)間的關(guān)系分別為：c=37248.87*t-1.219和lnc=117.837/t+2.978，式中，t 為藥物作用時(shí)間（h），用于初步判斷特定處理情況下高錳酸鉀的個(gè)體毒性。在相同時(shí)間間隔下，高錳酸鉀對(duì)河蟹的半致死濃度變化率逐漸降低；即在某一濃度下，高錳酸鉀對(duì)河蟹的死亡率影響隨著時(shí)間的增加而迅速升高，這表明前期高錳酸鉀對(duì)河蟹的毒性作用十分顯著，高錳酸鉀是一種快速致毒的藥物。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，高錳酸鉀的短期浸浴濃度通常為10～20 mg·L-1，時(shí)間約15～30 min；潑灑濃度為1.75～2.00 mg·L-1，時(shí)間需持續(xù)4 h[18]。對(duì)于早熟蟹，生產(chǎn)中短期的浸浴濃度和早熟蟹長(zhǎng)期安全濃度相接近；而對(duì)于未性成熟的幼蟹，短期的浸浴濃度雖然遠(yuǎn)低于作用時(shí)間內(nèi)的半致死濃度，但高于長(zhǎng)期安全濃度。在生產(chǎn)過(guò)程中，高錳酸鉀對(duì)河蟹是一種相對(duì)安全的潑灑消毒劑與預(yù)防藥物[19]；但用于河蟹浸浴消毒或者治療疾病時(shí)，則要考慮蟹齡和損傷情況，嚴(yán)格把握用藥濃度和用藥時(shí)間。

3.2 安全濃度下高錳酸鉀對(duì)河蟹生長(zhǎng)情況的影響

實(shí)驗(yàn)時(shí)，將16 mg·L-1高錳酸鉀溶液浸浴96 h 后的幼蟹清水中培養(yǎng)，所有幼蟹4 d 后均死亡。這與陸建學(xué)等[20]得出高錳酸鉀處理魚類后引起魚體組織產(chǎn)生應(yīng)激性病理變化，轉(zhuǎn)入清水后即可恢復(fù)正常的結(jié)論存在一定差異。其原因可能是不同物種耐受力不同。為此，本文增加了實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步探究長(zhǎng)期高錳酸鉀安全濃度對(duì)早熟蟹和幼蟹蛻殼的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以安全濃度10.0 mg·L-1和5.0 mg·L-1浸浴早熟蟹和幼蟹96 h 后，轉(zhuǎn)入清水飼養(yǎng)30 d，幼蟹的蛻殼率和體質(zhì)量增長(zhǎng)量顯著下降（P＜0.05）。這說(shuō)明安全濃度雖然對(duì)河蟹幼蟹的死亡率沒(méi)有影響，但對(duì)幼蟹的潛在傷害極大，阻礙其生長(zhǎng)發(fā)育。楊源浩[14]在研究高錳酸鉀溶液對(duì)損傷性河蟹成活率和蛻殼率中發(fā)現(xiàn)，10 mg·L-1的高錳酸鉀溶液持續(xù)飼養(yǎng)能夠顯著提高河蟹存活率和蛻殼率。這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致。本實(shí)驗(yàn)對(duì)象為無(wú)損傷幼蟹，而楊源浩等[14]主要研究損傷性蟹種的生長(zhǎng)情況。高錳酸鉀達(dá)到一定濃度對(duì)個(gè)體作用一定時(shí)間后，可造成不可逆轉(zhuǎn)的影響，在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中應(yīng)當(dāng)根據(jù)具體情況進(jìn)一步確定濃度和作用時(shí)間。

3.3 不足及展望

本實(shí)驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，環(huán)境條件與生產(chǎn)過(guò)程中存在一定的差異，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可作為生產(chǎn)中使用高錳酸鉀參考。在實(shí)際生產(chǎn)使用高錳酸鉀時(shí)仍然需要考慮養(yǎng)殖條件、病害情況選擇合適的用藥濃度。高錳酸鉀對(duì)河蟹的毒性與蟹齡有一定關(guān)系，在生產(chǎn)中用藥需要同時(shí)關(guān)注防治疾病和蟹齡，嚴(yán)格控制用藥濃度和時(shí)長(zhǎng)，在達(dá)到治療效果后迅速更換清水復(fù)蘇，以防高錳酸鉀對(duì)河蟹造成永久性損傷。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，將進(jìn)一步探究更低濃度和短時(shí)間對(duì)河蟹生長(zhǎng)發(fā)育的影響，確定高錳酸鉀用于浸浴的最適濃度和時(shí)間。