萬國盛，蘭公劍，王 恩，陳 栩，林 萍，徐 丹

（南京正大天晴制藥有限公司，江蘇 南京 210046）

1-（4-氨基苯基）-5,6-二氫-3-（4-嗎啉基）-2（1H）-吡啶酮（以下稱SM1） 是一種吡啶酮類化合物，是重要的醫(yī)藥中間體[1]，主要用于化學(xué)藥物阿哌沙班的合成。而SM1 主要是以4-硝基苯胺（化合物1）為原料經(jīng)?；? 個(gè)步驟合成（見圖1），合成過程中雖有除雜精制工序，但化合物1 以及各中間體（化合物2、3、4、5）均有進(jìn)一步微量殘留至SM1 中的可能，應(yīng)控制其在SM1 中的殘留量，進(jìn)而控制其以原型或結(jié)構(gòu)類似的傳導(dǎo)雜質(zhì)的形式傳遞到藥品中的風(fēng)險(xiǎn)，根據(jù)化學(xué)藥物研究的相關(guān)文獻(xiàn)和指導(dǎo)原則[2-4]，將本品中各雜質(zhì)的限度制定為0.015%，并建立了可靠的分析方法。

圖1 SM1 的合成路線Fig.1 Synthetic route of SM1

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試藥

SM1（批號(hào)：268-5-181015-01、268-5-181017-07）；化合物1 對照品（批號(hào)：268-SM-181019-01，含量：99.86%）；化合物2 對照品（批號(hào)：268-1-892-7，含量：98.67%）；化合物3 對照品（批號(hào)：268-2-892-9A，含量：97.86%）；化合物4 對照品（批號(hào)：268-3-1689-59C，含量：98.00%）；化合物5 對照品（批號(hào)：268-4-828-53，含量：98.27%），上述試藥生產(chǎn)商均為Vcare Pharmatech Co., Ltd.。

1.2 儀器與試劑

Waters Arc 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司，配置Empower3 工作站）；METTLER TOLEDO XS204 型電子天平、METTLER TOLEDO XP205DR型電子天平、METTLER TOLEDO ME802E 型電子天平，梅特勒-托利多公司。

甲醇（色譜純 美國TEDIA 公司）；NH4Ac（色譜純 美國ROE 公司）；實(shí)驗(yàn)用水為默克Millipore 超純水儀自制超純水。

1.3 色譜條件

采用Waters SunFire C18（150mm×4.6mm，3.5μm）色譜柱，流動(dòng)相A 為0.03mol·L-1乙酸銨緩沖液（取乙酸銨2.31g，加水至1000mL 使溶解，搖勻）-甲醇（75∶25），流動(dòng)相B 為0.03mol·L-1乙酸銨緩沖液（取乙酸銨2.31g，加水至1000mL 使溶解，搖勻）-甲醇（25∶75），梯度洗脫：0～35min，A 100%～0%；35～40min，A 0%；40～40.1min，A0%～100%；40.1～45min，A 100%，流速為1.0mL·min-1，檢測波長320nm，柱溫35℃。

1.4 溶液的制備

溶劑 甲醇-水（50∶50）。

供試品溶液的制備 取SM1 約200mg，精密稱定，置50mL 量瓶中，加溶劑適量，超聲使溶解，用溶劑稀釋至刻度，搖勻。

對照品混合貯備液 分別取化合物1～5 對照品各約3mg，精密稱定，置于同一100mL 量瓶中，加溶劑適量，超聲溶解，用溶劑稀釋至刻度，搖勻。

對照品溶液的制備 精密量取上述對照品混合貯備液適量，用溶劑定量稀釋制成每1mL 中約含各雜質(zhì)0.6μg 的溶液。

加標(biāo)供試品溶液 取SM1 和化合物1～5 對照品各適量，精密稱定，用溶劑溶解并定量稀釋制成每1mL 中含SM1 約4mg、化合物1～5 各約0.6μg 的溶液。

系統(tǒng)適用性要求 加標(biāo)供試品溶液各化合物色譜峰與相鄰色譜峰之間的分離度應(yīng)不小于1.5。

2 結(jié)果與討論

2.1 專屬性試驗(yàn)

在建立的色譜條件下空白溶劑對檢測無干擾，各待測化合物色譜峰與相鄰峰之間的分離度均大于1.5，方法專屬性良好，圖2 為系統(tǒng)適用性溶液色譜圖。

圖2 系統(tǒng)適用性溶液色譜圖Fig.2 Liquid chromatogram of system suitability solution

2.2 檢測限和定量限

根據(jù)ICH 指導(dǎo)原則Q2（R1）中信噪比（S/N）法分別確定本品的檢測限（LOD）和定量限（LOQ），按S/N約為3∶1 確定檢測限濃度，按S/N 約為10∶1 確定定量限濃度。取化合物1～5 對照品各適量，用溶劑逐級(jí)稀釋，在建立的色譜條件下進(jìn)樣分析，并將定量限溶液平行配制6 份分別測試，考察保留時(shí)間的RSD 和峰面積的RSD，確認(rèn)方法在檢測限濃度下的精密度。最終測得化合物1 的檢測限和定量限分別為37.90ng·mL-1和76.67ng·mL-1，化合物2 的檢測限和定量限分別為24.93ng·mL-1和56.71ng·mL-1，化合物3 的檢測限和定量限分別為45.85ng·mL-1和103.93ng·mL-1，化合物4 的檢測限和定量限分別為90.84ng·mL-1和144.70ng·mL-1，化合物5 的檢測限和定量限分別為42.42ng·mL-1和83.18ng·mL-1，6 份定量限溶液中各化合物色譜峰保留時(shí)間的RSD（n=6）為0.1%～0.2%，峰面積的RSD（n=6）為1.4%～3.5%，表明方法的檢測靈敏度和定量限濃度下的精密度均良好。

2.3 線性和范圍

取1.4 項(xiàng)下對照品混合貯備液適量，用溶劑依次稀釋可得到各化合物濃度分別為0.18、0.3、0.45、0.6、0.9 和1.2μg·mL-1的系列線性溶液（分別相當(dāng)于限度濃度的30%、50%、75%、100%、150%和200%），在建立的色譜條件下依次進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，以各化合物的峰面積（A）為縱坐標(biāo)，以濃度（C，μg·mL-1）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，化合物1～5 的線性范圍依次 為0.182 ～1.211、0.207 ～1.379、0.224～1.491、0.186～1.241、0.185～1.230μg·mL-1，相關(guān)系數(shù)r 均大于0.999，線性回歸方程如下：化合物1：y=49112x+307.87，相關(guān)系數(shù)r=0.9998；化合物2：y=90560x+815.57，相關(guān)系數(shù)r=0.9999；化合物3：y=39359x+388.64，相關(guān)系數(shù)r=0.9998；化合物4：y=22887x-133.01，相關(guān)系數(shù)r=0.9998；化合物5：y=52958x+263.49，相關(guān)系數(shù)r=0.9998。

2.4 準(zhǔn)確度

本次研究中準(zhǔn)確度以加樣回收率（%）評(píng)價(jià)，取已測定上述5 個(gè)化合物含量的SM1 供試品（化合物2～5 均未檢出，本底量為零）約200mg，精密稱定，置50mL 量瓶中，精密加入1.4 項(xiàng)下對照品混合貯備液適量，用溶劑稀釋至刻度，分別制成相當(dāng)于限度濃度50%、100%、150%水平的加樣回收率試驗(yàn)溶液，每個(gè)濃度水平平行配制3 份，在建立的色譜條件下依次進(jìn)樣分析，計(jì)算加樣回收率及RSD（n=9）。結(jié)果見表1、2。

表1 化合物1 的加樣回收率結(jié)果Tab.1 Recovery results of compound 1

表2 化合物2～5 的加樣回收率結(jié)果Tab.2 Recovery results of compound 2～5

2.5 進(jìn)樣精密度

精密量取1.4 項(xiàng)下對照品混合貯備液1.0mL，置于50mL 量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為進(jìn)樣精密度測試溶液，在建立的色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 針，記錄色譜圖。

結(jié)果各化合物保留時(shí)間的RSD（n=6）均為0.1%，各化合物峰面積的RSD（n=6）為0.2%～0.4%，表明系統(tǒng)的進(jìn)樣精密度良好。

2.6 重復(fù)性

精密量取1.4 項(xiàng)下對照品混合貯備液1.0mL，置于50mL 量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，平行配制6 份，作為重復(fù)性測試溶液，在建立的色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，測定每一份溶液中各化合物的含量，并計(jì)算各化合物含量的RSD。結(jié)果各化合物含量的RSD（n=6）為0.7%～2.2%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.7 中間精密度

由不同實(shí)驗(yàn)人員在不同日期，使用不同的儀器，按照2.6 項(xiàng)下的方法進(jìn)行試驗(yàn)，將測定結(jié)果與重復(fù)性項(xiàng)下測得的6 份結(jié)果合并計(jì)算各化合物含量的RSD。結(jié)果各化合物含量的RSD（n=12） 為4.3%～6.0%，表明方法的中間精密度良好。

2.8 溶液穩(wěn)定性

按照1.4 項(xiàng)下方法制備對照品溶液和供試品溶液，在室溫條件下放置0、4、8、12 和24h 進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，分別考察對照品溶液和供試品溶液中各化合物峰面的變化情況，并以各化合物在不同時(shí)間點(diǎn)測得的峰面積與0h 峰面積的比值進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果各化合物在不同時(shí)間點(diǎn)測得的峰面積與0h 峰面積的比值為96.5%～104.3%，表明溶液穩(wěn)定性良好。

根據(jù)質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（QbD）理念，質(zhì)量源于良好可靠的設(shè)計(jì)，必須增加對產(chǎn)品特性的全面了解和對生產(chǎn)過程的可靠控制，并建立設(shè)計(jì)空間[5]，因此，在藥物生產(chǎn)之前根據(jù)具體工藝的合成機(jī)制、起始原料及各中間體的基本結(jié)構(gòu)，充分評(píng)估產(chǎn)品的雜質(zhì)譜，并將相關(guān)的雜質(zhì)在合成的中間體中進(jìn)行研究和控制是保障藥品質(zhì)量的有效方法，將相關(guān)的雜質(zhì)控制前置，可避免其在藥品中超限的風(fēng)險(xiǎn)。因此，在本品中建立相關(guān)雜質(zhì)的分析方法并進(jìn)行嚴(yán)格控制，對保障后續(xù)藥品的質(zhì)量是必要且有效的。

根據(jù)各待測化合物均具有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)選擇紫外檢測器檢測，化合物1～5 的定量限分別達(dá)到76.67、56.71、103.93、144.70 和83.18ng·mL-1，均低于測定條件下各化合物限度濃度的30%，檢測靈敏度滿足檢驗(yàn)需求?；衔?～5 的平均加樣回收率分別為100.4%、100.4%、102.4%、104.5%和103.7%，化合物1、2、3、5 回收率的RSD 均小于5%，化合物4 因50%濃度水平下回收率略高，進(jìn)而致使其回收率的RSD 達(dá)13.8%，但未超過15%，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果滿足現(xiàn)行版《中國藥典》四部通則“9101 分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”對準(zhǔn)確度的驗(yàn)證要求。

3 結(jié)論

目前，尚無文獻(xiàn)對本品中的雜質(zhì)研究進(jìn)行專門的報(bào)道，本研究建立的分析方法已成功應(yīng)用于SM1中的5 種雜質(zhì)檢測，為其生產(chǎn)工藝和質(zhì)量控制提供了有效的支撐，也可為其他醫(yī)藥中間體或藥品的質(zhì)量控制提供參考。