段燦星，曹言勇，董懷玉，夏玉生，李紅，胡清玉，楊知還，王曉鳴

1中國農業(yè)科學院作物科學研究所/農作物基因資源與基因改良國家重大科學工程，北京 100081；2河南省農業(yè)科學院糧食作物研究所，鄭州 450002；3遼寧省農業(yè)科學院植物保護研究所，沈陽 110161；4吉林省農業(yè)科學院植物保護研究所，吉林公主嶺 136100

0 引言

【研究意義】玉米（Zea mays L.）是中國最主要的糧飼兼用作物，也是重要的工業(yè)原料和能源植物，在國民經濟和農業(yè)生產中占有重要地位。2000年以來，中國玉米種植面積持續(xù)增長，2012年達3 910.9萬hm2，總產量22 955.9萬t，占谷物總種植面積和總產量的 40.26%和 40.52%，超越水稻成為中國第一大糧食作物；2015年播種面積和總產均創(chuàng)歷史新高，分別達到4 496.8萬hm2和26 499.2萬t；此后雖有所下降，但2019年播種面積和總產量仍達4 128.4萬hm2和26 077.9萬t（http://www.stats.gov.cn/tjsj/ndsj/2020/indexch.htm）。因此，玉米的安全生產直接影響中國糧食安全和延伸產業(yè)的健康發(fā)展。隨著全球氣候變暖、栽培耕作方式轉變和品種更替，玉米病蟲害發(fā)生呈持續(xù)加重趨勢，已成為制約玉米高產穩(wěn)產的重要因素[1-3]。莖腐病是世界玉米生產中普遍發(fā)生且對生產具有重大影響的土傳病害，也是中國玉米生產上具有突出影響的重要病害，是玉米全程機械化實施中的重要制約因子。近年來，莖腐病在中國玉米不同生態(tài)區(qū)持續(xù)嚴重發(fā)生，如2013—2015年，東北地區(qū)連續(xù)陰雨導致莖腐病高發(fā)，2014年9月上旬至中旬，黃淮地區(qū)連續(xù)降雨導致莖腐病嚴重發(fā)生，2016年東北、西北地區(qū)莖腐病重度發(fā)生，對玉米制種影響極大，2017年黃淮地區(qū)莖腐病偏重發(fā)生，2017—2018年東北地區(qū)重度發(fā)生（部分數(shù)據(jù)未發(fā)表），給中國玉米生產造成了重大損失，因此，控制莖腐病為害，對于保障玉米安全生產具有重要意義[3-5]?！厩叭搜芯窟M展】玉米莖腐病致病菌復雜多樣，但中國莖腐病的病原主要為腐霉菌（以腫囊腐霉Pythium inflatum為主）和鐮孢菌（以禾谷鐮孢Fusarium graminearum為主）兩大類[6-7]，國外多由鐮孢菌引起莖腐病[8-9]。腐霉莖腐病具有突發(fā)性強的特點，其典型癥狀為青枯，曾在20世紀80年代對生產造成較大影響。一般發(fā)病年份，腐霉莖腐病田間發(fā)病率為 5%—10%，在病害重發(fā)年份，田間發(fā)病率可達20%—30%，一些感病品種的發(fā)病率達 40%—80%，可引起30%以上的產量損失[10-11]。與腐霉莖腐病相比，鐮孢莖腐病發(fā)生更為普遍，其田間癥狀包括青枯和黃枯2種類型。據(jù)報道，在北美，鐮孢莖腐病給玉米生產造成了嚴重的經濟損失，堪薩斯州因鐮孢莖腐病每年造成玉米減產約 5%，在重病田，發(fā)病率可達90%—100%，減產高達50%；在俄亥俄州，一般引起5%—10%的產量損失；在內布拉斯加州，一般年份因鐮孢莖腐病減產5%，較重時減產10%—20%。在中國，該病引起玉米減產達20%，重度發(fā)生時造成的損失更大[4]。隨著氣候變化、秸稈還田和免耕少耕等栽培模式的推廣，田間病原菌不斷積累，致使中國玉米莖腐病發(fā)生呈加重趨勢，尤其是近年來推廣的高密度種植方式，使田間環(huán)境更加有利于莖腐病的發(fā)生，同時，由該病害引發(fā)或加劇的植株早衰、倒伏現(xiàn)象又成為推廣高密度種植技術的主要障礙[12-13]。田間病害調查表明，抗病品種具有明顯的降低病害發(fā)生率、減輕產量損失的作用。因此，種植和利用抗病品種是控制莖腐病的安全、經濟和有效措施。優(yōu)異的抗性種質是進行抗病品種選育的前提和基礎。開展玉米種質資源抗莖腐病人工接種鑒定與評價，是篩選抗莖腐病種質的必要途徑。王富榮等[14]結合運用田間自然發(fā)病和土壤根埋接種（土埋傷根接種）的方法，鑒定了1 550份玉米種質對腐霉莖腐病的抗性；孫淑琴等[15]采用玉米播種時埋菌接種和成株期傷莖根埋接種相結合的方法，對20個夏玉米品種進行了腐霉莖腐病抗性鑒定；宋燕春等[16]利用土壤根埋接種法鑒定了 287份重要玉米自交系對腐霉莖腐病的抗性。自2000年以來，筆者采用土壤根埋接種的方法對國家種質庫保存和引進的約5 000份玉米自交系和農家種進行了抗腐霉莖腐病鑒定，篩選出一批對腐霉莖腐病抗性較好的材料，部分材料已用于抗性基因挖掘和種質創(chuàng)新研究[17-21]，但這些種質對鐮孢莖腐病抗性如何，尚未可知。通過針扎玉米基部第一莖節(jié)注射孢子懸浮液的方式，鑒定評價了一些自交系和雜交種對鐮孢莖腐病的抗性，篩選出數(shù)份抗性材料[22-24]；AFOLABI等[25]利用自然發(fā)病和帶菌牙簽接種相結合的方法，對50份來自國際熱帶農業(yè)研究所的自交系進行了多年多點抗鐮孢莖腐病鑒定，獲得4份高抗材料；趙子麒等[26]運用土壤根埋接種法鑒定了48份自交系對鐮孢莖腐病的抗性，但其對腐霉莖腐病的抗性尚不清楚?！颈狙芯壳腥朦c】種質資源是抗病育種的物質基礎，是保障國家糧食安全和種業(yè)健康發(fā)展的戰(zhàn)略資源，而資源的表型精準鑒定是有效利用玉米種質的重要途徑和策略。國內外均十分重視玉米種質資源的抗病鑒定與評價工作，針對不同玉米病害開展了一系列抗性鑒定研究，篩選出一些抗病種質，在此基礎上，開展抗病種質創(chuàng)制和抗病品種選育與利用，對于相關病害的控制起到了積極的作用。然而，以往大部分研究選取的材料具有一定的局限性，且抗性評價工作大多在固定的鑒定圃完成，很少涉及到多年多環(huán)境的鑒定與評價，而莖腐病的發(fā)生和為害程度受環(huán)境影響很大，玉米對莖腐病的抗性反應通常因環(huán)境不同而產生較大的差異，上述研究中篩選出的種質能否在不同環(huán)境條件和不同生態(tài)區(qū)都表現(xiàn)出穩(wěn)定的抗性，尚未可知[5,14-17,22-24]。【擬解決的關鍵問題】本研究對2 004份遺傳背景豐富的玉米種質資源進行大規(guī)模多年多點的田間自然發(fā)病鑒定，篩選出在大田自然條件下對莖腐病抗性較好或綜合性狀突出的代表性種質，用于人工接種抗性精準鑒定；建立和完善玉米種質抗腐霉莖腐病和鐮孢莖腐病精準鑒定的方法，對690份代表性種質進行3年共6點的人工接種抗性鑒定，明確這些種質對腐霉莖腐病和鐮孢莖腐病的真實抗性水平，篩選出不同年份和不同環(huán)境下對莖腐病均表現(xiàn)出穩(wěn)定抗性的材料，為大規(guī)模開展玉米種質抗莖腐病精準鑒定提供有效的方法和技術規(guī)程，為玉米抗莖腐病育種和品種的抗性改良提供可利用的抗性資源，為促進玉米抗莖腐病育種，加速抗性種質的高效利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

由國家重點研發(fā)計劃“玉米種質資源精準鑒定與創(chuàng)新利用”項目組提供的具有豐富遺傳多樣性的玉米種質2 004份以及其中的690份代表性自交系。

1.2 田間自然發(fā)病試驗設計與管理

田間自然發(fā)病鑒定地點均設置在玉米主產區(qū)，包括河南原陽（113°97′E，35°05′N）、山東章丘（117°30′E，36°43′N）、北京順義（116°34'E，40°13'N）、北京房山（116°04′E，39°38′N）、遼寧沈陽（123°58′E，42°04′N）、吉林公主嶺（124°48'E，43°30'N）、黑龍江哈爾濱（126°63′E，45°75′N）等地。選擇具有代表性，中上等肥力水平試驗地。試驗田平整、平坦，施肥水平及其他管理與當?shù)厣a水平相當。試驗采取隨機排列，3 m行長，單行種植，2—3次重復，密度為60 000—67 500 株/hm2。

1.3 田間莖腐病自然發(fā)病調查與評價

在玉米生長后至蠟熟后期，參照玉米抗病蟲性鑒定技術規(guī)范（NY/T 1248.6-2016和NY/T 1248.7-2016）[27-28]，采用目測典型癥狀如植株明顯枯黃/枯死/果穗倒掛等，結合手捏法進行田間莖腐病調查，莖基部變軟、空松，能用手捏動植株判定為發(fā)病株。根據(jù)調查發(fā)病株數(shù)、總株數(shù)，計算發(fā)病率，進行抗性評價。

1.4 莖腐病人工接種精準鑒定

1.4.1 鑒定用病原菌 具有致病力強的腫囊腐霉（P.inflatum）和禾谷鐮孢（F.graminearum），分別由中國農業(yè)科學院作物科學研究所和遼寧省農業(yè)科學院植物保護研究所采集、分離、純化、培養(yǎng)并保存。

1.4.2 試驗設計 抗莖腐病精準鑒定在具有噴灌設施或者灌溉條件良好的抗病鑒定圃進行。同一批次的種質材料在3個不同生態(tài)環(huán)境中進行2年抗性鑒定，或在2個不同生態(tài)環(huán)境中進行3年的抗性鑒定。腐霉莖腐病鑒定圃設置在北京昌平（116°14′E，40°10′N）、河南原陽（113°97′E，35°05′N）、河南長葛（113°52′E，34°10′N），鐮孢莖腐病鑒定點設置于遼寧沈陽（123°58′E，42°04′N）、吉林公主嶺（124°48'E，43°30'N）、吉林梨樹（124°33′E，43°32′N）。

試驗材料采取隨機排列，每份材料雙行種植，行長5.0 m，行距0.6 m，每行留苗25株，植株密度為67 500株/hm2。田間采用雙小區(qū)（背靠背）種植（根據(jù)當?shù)氐牟シN習慣，背靠背中間可種植高粱或留 40 cm的小過道），觀察道寬1 m。每隔100行設置1組已知抗病/感病對照材料，常用的為自交系齊319（抗）或1145（抗）、掖107（感）（如果某鑒定點出現(xiàn)上述抗、感自交系生長不適的話，在現(xiàn)有對照種的基礎上，再增加一組適于當?shù)厣L且抗感特性穩(wěn)定的材料作為對照種）。

1.4.3 接種 將致病力強的腫囊腐霉或禾谷鐮孢接種于直徑為9 mm、含有20 mL經高壓滅菌的PDA（馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g和水1 000 mL）平板培養(yǎng)基上，于25℃黑暗培養(yǎng)5—7 d，待菌絲布滿PDA表面時，按每10皿菌體兌水700 mL的比例，勻漿成糊狀，用于注射接種。

在玉米植株散粉后3—5 d，在植株靠近地表的第2莖節(jié)中部，利用電鉆（配以直徑6 mm鉆頭）以45°角向斜下方打孔，深度達莖髓中部。鉆孔后，以灌有糊狀接種體的無針頭注射器將 1.0 mL病菌接種體注入玉米植株莖髓中，并以凡士林密封孔口。接種后田間充分澆灌1次，然后進行正常肥水管理。發(fā)病過程中，選擇連續(xù)的晴天進行澆灌1—2次水，模擬暴雨暴晴的病害誘發(fā)條件。

1.4.4 抗病性調查與評價 在接種后的鑒定材料生長進入蠟熟期（接種后40 d），即可進行調查。調查時，先砍除莖稈上部節(jié)段，留地上莖4—5節(jié)，縱剖莖稈，從縱剖面查看莖稈中莖髓部變色或壞死的病斑區(qū)域大小。逐株調查莖髓部發(fā)病面積，記載發(fā)病級別（表1）。

表1 玉米對莖腐病抗性的發(fā)病級別劃分Table 1 Classification of disease score of maize resistance to stalk rot

根據(jù)單株病情級別，計算每份鑒定材料的平均病情級別，進行抗性評價（表2）。

表2 玉米對莖腐病抗性的評價標準Table 2 The criteria of evaluation of maize resistance to stalk rot

莖腐病平均病情級別計算公式如下：

SRS為莖腐病病情級別（stalk rot score，SRS），SRSA為莖腐病平均病情級別（stalk rot score on average，SRSA）；i=1為第1個單株，n為最后第n個單株。計算保留1位小數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2010對抗性鑒定的表型數(shù)據(jù)進行分析與處理，利用R語言對鑒定結果進行相關性分析。

2 結果

2.1 玉米種質對莖腐病的自然發(fā)病鑒定與評價

2016—2018年，各自然發(fā)病鑒定圃的莖腐病發(fā)生狀況表明，在田間自然發(fā)病條件下，莖腐病發(fā)病程度受環(huán)境影響大，不同年份間和不同環(huán)境條件下，發(fā)病程度差異明顯。2016年，各自然發(fā)病鑒定圃的莖腐病均發(fā)生較輕；2017年，遼寧沈陽、北京順義和山西定襄的莖腐病偏重發(fā)生，感病和高感材料的占比達45%；2018年，山西定襄地區(qū)的莖腐發(fā)生較重，其他鑒定點均發(fā)生偏輕。通過對2016—2018年各自然發(fā)病鑒定點的抗性鑒定數(shù)據(jù)進行綜合分析，發(fā)現(xiàn)共有508份種質在田間自然發(fā)病條件下，在各鑒定點均對莖腐病表現(xiàn)出較為穩(wěn)定的抗性，其中表現(xiàn)高抗（highly resistant，HR）、抗?。╮esistant，R）和中抗（moderately resistant，MR）的材料分別為79、106和 323份，上述自交系將成為玉米抗莖腐病人工接種精準鑒定種質選擇的重要參考（表3）。

表3 2016—2018年田間自然發(fā)病鑒定中對莖腐病表現(xiàn)不同抗性的部分種質Table 3 Some maize germplasm with different levels of resistance to stalk rot from naturally infected identification during 2016-2018

2.2 玉米種質抗莖腐病精準鑒定方法比較分析

2016—2017年，在北京昌平和河南原陽，利用土壤根埋接種和莖基部注射接種法對隨機挑選的 90份玉米品種和種質資源進行了腐霉莖腐病和鐮孢莖腐病的抗性鑒定（圖1），結果表明，用上述2種方法鑒定評價的結果絕大部分一致，在腐霉莖腐病鑒定中，抗病對照齊319的發(fā)病率和抗性級別分別為16.7%和4.5，均表現(xiàn)為中抗，感病對照掖107的發(fā)病率和抗性級別分別為33.3%和8.5，表現(xiàn)為感?。╯usceptible，S）和高感（highly susceptible，HS），其中，86.7%的被鑒定材料在2種鑒定方法中，對腐霉莖腐病的抗性反應表現(xiàn)一致（相同的抗性水平），僅極少數(shù)材料在 2種鑒定方法中表現(xiàn)出較大差異。利用上述2種方法進行的腐霉莖腐病鑒定評價結果的相關性分析顯示，兩者的相關系數(shù)r=0.87，表明2種接種方法的評價結果具有高度的相關性（圖 2-A）。在鐮孢莖腐病抗性鑒定中，抗病對照齊319在上述2種鑒定方法中分別表現(xiàn)為抗病和中抗，感病對照掖 107均表現(xiàn)為高感，81.1%的被鑒定材料對鐮孢莖腐病的抗性反應表現(xiàn)一致，2種鑒定方法的評價結果之間的相關系數(shù)r=0.84，表明兩者之間的相關性高（圖 2-B）。整體來看，與土壤根埋接種相比，注射接種時直接把接病原物定量注入莖髓部，確保每株玉米能成功接種，因此，被鑒定材料整體上發(fā)病程度更充分，可有效用于玉米抗莖腐病種質資源的篩選，為規(guī)?；_展玉米種質抗莖腐病精準鑒定奠定了基礎。

圖1 2種不同方法接種玉米莖腐病Fig.1 Inoculation of maize stalk rot

圖2 利用土壤根埋接種和莖基部注射接種法鑒定玉米對莖腐病抗性的相關性分析Fig.2 Correlation analysis between soil inoculation and drilling inoculation for screening of maize resistance to stalk rot

2.3 玉米種質對腐霉莖腐病的抗性精準鑒定與相關性分析

2018—2020年，在北京昌平、河南長葛和河南原陽，利用莖基部注射法對690份代表性玉米種質進行了人工接種鑒定，病害調查顯示，3個鑒定點的材料均充分發(fā)病，其中，昌平點的發(fā)病程度更嚴重。抗病對照齊 319和感病對照掖 107的發(fā)病級別分別為3.3—5.4和7.3—9.0，表現(xiàn)為抗病-中抗和感病-高感。綜合分析每年的抗病鑒定數(shù)據(jù)表明，2018年，在2個鑒定點（北京昌平、河南長葛）對腐霉莖腐病綜合表現(xiàn)高抗（HR）、抗?。≧）、中抗（MR）、感?。⊿）和高感（HS）的種質占比分別為0、0、3.2%、14.3%和82.6%；2019年，在2個點（北京昌平和河南原陽）綜合表現(xiàn)為HR、R、MR、S和HS的種質占比分別為0、0、4.2%、15.4%和80.3%；2020年，在北京昌平和河南原陽均表現(xiàn)HR、R、MR、S和HS的種質占比分別為0、1.2%、4.8%、21.8%和72.2%，3年的抗性鑒定結果具有較好的一致性。通過對3年共6點的腐霉莖腐病鑒定結果進行相關性分析發(fā)現(xiàn)，不同年度和不同鑒定點之間的相關系數(shù)（r）為0.46—0.72，其中同一年度（2018、2019和2020年）2個鑒定點之間的r值分別為0.66、0.60和0.65，同一鑒定點不同年度間（北京昌平2018與2019年、2019與2020年、2018與2020年）相關系數(shù)分別為0.72、0.55和0.46，河南長葛（或原陽）不同年度間相關系數(shù)分別為0.68、0.67和0.72，表明各點之間的鑒定結果存在較好的相關性。3個年度間種質的綜合抗性相關性分析顯示，2018與2019年、2019與2020年、2018與2020年的r值分別為0.67、0.84和0.87，表明年度間綜合抗性的結果一致性高（圖3—圖5）。

圖3 玉米種質接種腐霉莖腐病的田間癥狀Fig.3 The symptom of maize Pythium stalk rot in the field

圖4 不同玉米種質接種腐霉莖腐病的莖髓部癥狀Fig.4 The symptom of maize stalk pith tissues caused by Pythium stalk rot

圖5 2018—2020年玉米種質在不同環(huán)境下對腐霉莖腐病抗性鑒定的相關性分析Fig.5 Correlation analysis between maize resistance to PSR at different environments during 2018-2020

綜合分析3年共6點的鑒定數(shù)據(jù)，篩選出24份對腐霉莖腐病抗性較好的種質，其中，冀資 H676、遼2235、冀資14L88、冀資14L101、丹337、M02N-23、Y1747、HRB16232、T628358、161085在各年各點的抗性均表現(xiàn)穩(wěn)定，是不可多得的抗腐霉莖腐病資源（表4）。

表4 2018—2020年抗腐霉莖腐病精準鑒定中表現(xiàn)穩(wěn)定抗性的24份種質Table 4 Twenty-four maize germplasm with stable resistance to Pythium stalk rot from precise characterization during 2018-2020

2.4 玉米種質對鐮孢莖腐病的抗性精準鑒定與相關性分析

2018—2020年，在遼寧沈陽、吉林公主嶺、吉林梨樹3個鑒定點共6個環(huán)境下，利用莖基部注射法對690份代表性玉米種質進行了鐮孢莖腐病接種鑒定，在蠟熟期進行的病害調查顯示，抗病對照齊319和感病對照掖107的發(fā)病級別分別為2.5—5.5和7.5—9.0，表現(xiàn)為抗病-中抗和感病-高感，表明抗病鑒定結果有效。遼寧沈陽鑒定點的接種材料3年發(fā)病程度均非常充分，被鑒定種質在3年間的抗性表現(xiàn)較為一致，絕大部分材料均表現(xiàn)為感病或高感；而2018年吉林梨樹接種的莖腐病發(fā)生明顯偏輕，2019—2020年吉林公主嶺的發(fā)病也欠充分，數(shù)據(jù)分析表明，2018—2020年，吉林3個環(huán)境下的鐮孢莖腐病發(fā)病程度在年度間存在較大差異，且同一年份中，吉林梨樹或公主嶺與遼寧沈陽鑒定點的發(fā)病程度差異大，可能與接種操作、環(huán)境條件差異以及接種后的田間管理方式相關，但玉米種質在每年2個點的綜合抗性表現(xiàn)較為一致。通過對3年各點的鐮孢莖腐病鑒定結果進行相關性分析顯示，6個環(huán)境之間的相關系數(shù)為0.00—0.76，同一年度（2018、2019和2020年）2個鑒定點之間的r值分別為0.12、0.04和0.05，遼寧沈陽不同年度間（2018與2019年、2019與2020年、2018與2020年）抗性的相關系數(shù)分別為0.50、0.65和0.53，吉林梨樹（或公主嶺）不同年度間相關系數(shù)分別為0.07、0.76和0.00，表明遼寧沈陽鑒定點3年間的結果以及2019與2020年吉林公主嶺的結果具有較強的相關性，其他各點的相關性弱，鑒定結果差異大。3個年度間鐮孢莖腐病的綜合抗性相關性分析顯示，2018與2019年、2019與2020年、2018與2020年的r值分別為0.40、0.74和0.72，表明年度間的綜合抗性結果相關性較高（圖6—圖7）。綜合6個環(huán)境下的鑒定數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，5份種質（冀資 C32、遼 785、遼 2235、吉資 1034和 16SD088）在各年各點均對鐮孢莖腐病表現(xiàn)出穩(wěn)定的抗性，是不可多得的抗鐮孢莖腐病資源（表5）。

圖6 不同玉米種質接種禾谷鐮孢莖腐病的莖髓部癥狀Fig.6 The symptom of maize stem pith tissues caused by Gibberella stalk rot

圖7 2018—2020年玉米種質在不同環(huán)境下對鐮孢莖腐病抗性鑒定的相關性分析Fig.7 Correlation analysis between maize resistance to GSR at different environments during 2018-2020

表5 2018—2020年抗鐮孢莖腐病精準鑒定中表現(xiàn)穩(wěn)定抗性的玉米種質Table 4 Five maize germplasm with stable resistance to Gibberella stalk rot from precision identification during 2018-2020

2.5 玉米種質對2種莖腐病抗性的相關性分析

對 690份玉米種質的腐霉莖腐病和鐮孢莖腐病的綜合抗性進行相關性分析（圖8），發(fā)現(xiàn)這些種質對 2種莖腐病抗性的相關系數(shù)為 0.44，表明上述材料對腐霉莖腐病和鐮孢莖腐病的抗性存在中等水平的相關性，由此推測部分種質對這兩種莖腐病具有相似的抗病機制，但大部分種質對這兩種病害的抗性存在差異。在上述 690份資源中，遼 2235和16SD088對腐霉莖腐病和鐮孢莖腐病均表現(xiàn)出較好的抗性，將為玉米抗莖腐病育種和品種抗性改良提供重要的抗源材料。

圖8 玉米種質對腐霉莖腐病與鐮孢莖腐病抗性的相關性分析Fig.8 Correlation analysis between PSR and GSR resistance in 690 maize germplasm

3 討論

玉米是中國主要的糧食作物和飼料作物，保障玉米安全生產，降低生產成本，不斷提高產量和品質，對于促進玉米產業(yè)健康發(fā)展和保障中國糧食安全具有重要意義。腐霉莖腐病和鐮孢莖腐病是玉米生長中后期的重要病害，生產上尚無針對該病害的有效防控手段，利用抗性品種無疑是控制莖腐病最為理想的措施。鑒于玉米莖腐病對生產為害的嚴重性以及品種抗性的重要性，在國家玉米新品種審定標準中，在中國所有玉米生態(tài)區(qū)，對高感莖腐病的品種實行一票否決，即玉米新品種的莖腐病田間自然發(fā)病和人工接種鑒定均未達到高感，否則不予以審定，因此，抗病性已成為玉米新品種不可或缺的特性。近年來，玉米種質和品種的抗病性鑒定與抗病品種的推廣得到了社會的廣泛認可，玉米育種工作者、育種企業(yè)和種植戶對于品種抗病的重要性認識不斷提高。玉米種質資源是抗病育種的物質基礎，精準鑒定和篩選出具有不同遺傳背景且在不同環(huán)境條件下均對莖腐病表現(xiàn)穩(wěn)定抗性的種質，對于促進玉米抗病育種具有重要意義。

3.1 玉米種質對莖腐病的自然發(fā)病鑒定與評價

本研究首次通過大規(guī)模多年多點的田間自然發(fā)病鑒定與多年多點的人工接種鑒定相結合的方式，精準鑒定和評價了玉米種質對腐霉莖腐病和鐮孢莖腐病的抗性水平。在2016—2018年，對2 004份具有廣泛遺傳背景的玉米種質進行了多環(huán)境（黃淮、京津冀、東北和西北）的田間自然發(fā)病鑒定，初步篩選出在田間自然發(fā)病條件下對莖腐病抗性較好的種質508份以及對其他病害綜合抗性好的種質，結合農藝性狀的田間綜合表現(xiàn)，挑選出部分對莖腐病或其他常見病害抗性較好或綜合性狀比較優(yōu)異的代表性種質690份，進行了3年共6個環(huán)境的人工接種精準鑒定，最終篩選出對腐霉莖腐病和鐮孢莖腐病具有穩(wěn)定抗性的玉米種質各24和5份。

綜合分析玉米田間自然發(fā)病與人工接種抗性鑒定的數(shù)據(jù)表明，與人工接種鑒定相比，田間自然發(fā)病鑒定確實存在許多不確定性，如不能保證同一批次的材料都感染病原菌、在不同環(huán)境可能存在不同種病原、病原菌侵染與玉米敏感生育期能否吻合、發(fā)病條件不進行任何人工干預、田間環(huán)境條件完全不可控等，導致表型受環(huán)境影響更大，對莖腐病而言尤為如此；人工接種則能保證被鑒定材料均能接種上特定病原菌，并且在接種后于鑒定圃創(chuàng)造適宜莖腐病病原菌侵染和擴展的環(huán)境條件，誘導該病害的發(fā)生和發(fā)展。本研究表明，在自然發(fā)病中對莖腐病表現(xiàn)較好抗性的材料，在人工接種后，大多表現(xiàn)出感病癥狀，而通過人工接種鑒定出的抗性種質，在自然發(fā)病中均對相應病害表現(xiàn)抗病，這種情況不難理解，因為接種物的單位體積病原菌濃度通常大大高于土壤中該病菌的自然濃度，且接種后鑒定圃中的環(huán)境條件適于莖腐病發(fā)生，無疑會導致莖腐病發(fā)生加重。盡管如此，由于自然發(fā)病是在多年多環(huán)境下進行的，其發(fā)病條件與大田生產品種所處的環(huán)境完全一致，在某種意義上講，自然發(fā)病鑒定的結果更接近于田間真實的抗性水平，因此，自然發(fā)病鑒定的結果具有一定的參考價值[29]。

3.2 玉米種質抗莖腐病精準鑒定方法比較分析

本研究建立和完善了玉米種質抗莖腐病精準鑒定的新方法-莖基部注射法，利用該方法，對690份玉米代表性種質進行了抗腐霉莖腐病和鐮孢莖腐病精準鑒定，明確了上述種質對腐霉和鐮孢莖腐病的真實抗性水平，篩選出20余份對莖腐病具有穩(wěn)定抗性的材料。關于玉米莖腐病接種鑒定的方法，腐霉莖腐病以往通常采用土壤根埋接種（土埋傷根接種）法進行鑒定[5,14,16-18]，也有通過播種時埋菌接種結合成株期傷莖根埋接種鑒定[15]和苗期接種鑒定的報道[30]。而鐮孢莖腐病的鑒定，則通過土壤根埋接種法[26,31-33]、針扎玉米基部第一莖節(jié)注射孢子懸浮液[22,24]或帶菌牙簽接種[25]等方法進行，其中土壤根埋接種法應用廣泛。與莖基部注射法相比，土壤根埋菌法操作較為簡單，接近田間植株發(fā)病的實際情況，比較直觀，缺點是接種物用量大，接種和調查評價的操作相對較為粗放，接種時很難做到定量，且不能保證被鑒定的每株玉米都能接種上病原菌，調查時采用手捏莖基部是否變軟來確定發(fā)病株，導致不同調查人之間容易出現(xiàn)一定誤差；后者直接將定量的接種物注入玉米基部莖稈中，能確保被鑒定的每株材料均能定量接上病原菌，發(fā)病更為充分，而調查時剖開每株材料莖稈，根據(jù)病斑區(qū)域大小確定發(fā)病面積和病情等級，提高抗性評價精度，可有效用于種質資源的抗性鑒定評價，結果更為可靠，但鑒定過程涉及莖基部鉆孔、注射和凡士林封口以及逐株剖稈調查等試驗程序，工作量大且耗時費力。總之，上述2種莖腐病的接種鑒定方法，各有其優(yōu)缺點，玉米根際土壤埋菌法適用于玉米新品種的抗莖腐病鑒定與評價，莖基部注射接種法則更適合于種質資源抗莖腐病的精準鑒定。

3.3 玉米種質對腐霉莖腐病和鐮孢莖腐病的抗性精準鑒定與相關性分析

通過對腐霉莖腐病3年共6個環(huán)境的抗性鑒定數(shù)據(jù)進行的相關性分析表明，6個環(huán)境條件下的腐霉莖腐病抗性鑒定結果之間均存在較強的相關性，每年2個鑒定點之間的鑒定評價結果一致性較高，年度間的抗性評價結果也具有較高的一致性，尤其是不同年度間2個環(huán)境的綜合抗性情況更是趨于一致。然而，本研究中的690份代表性種質對鐮孢莖腐病的反應，在同一年份的2個鑒定點之間表現(xiàn)出很大的差異，吉林梨樹和公主嶺的玉米種質發(fā)病程度遠遠低于同年遼寧沈陽的同批次材料，在吉林梨樹和公主嶺鑒定點表現(xiàn)抗病或中抗的一些種質，在遼寧沈陽均表現(xiàn)出感病或高感，相關性分析也顯示出同一年度2個鑒定點評價結果的相關性非常低，且3年均是如此，可能與2個鑒定點的不同人員接種操作、環(huán)境條件差異以及接種后的田間管理方式和精細程度密切相關，然而，不同年度間2個環(huán)境的鐮孢莖腐病綜合抗性均具有較高的一致性，表明多年多點鑒定對于篩選抗莖腐病的種質具有重要意義，只有在不同環(huán)境條件、不同病害選擇壓力下均表現(xiàn)出抗病的材料，才是真正具有穩(wěn)定抗性種質的資源。

4 結論

對 2 004份遺傳背景豐富的玉米種質資源進行了 3年多環(huán)境的莖腐病田間自然發(fā)病抗性鑒定，篩選出 508份種質在各鑒定點均對自然發(fā)病條件下的莖腐病表現(xiàn)出較為穩(wěn)定抗性。建立和完善了玉米抗腐霉莖腐病和鐮孢莖腐病精準鑒定的新方法-莖基部注射法，并利用該方法對 690份代表性玉米種質進行了3年共6個環(huán)境的腐霉莖腐病和鐮孢莖腐病抗性精準鑒定，發(fā)現(xiàn)這些種質對 2種莖腐病的抗性具有中等水平的正相關性，篩選出對腐霉莖腐病和鐮孢莖腐病具有穩(wěn)定抗性的玉米種質各24和5份，其中2份材料對2種莖腐病同時表現(xiàn)出穩(wěn)定的抗性，是開展玉米抗莖腐病育種或對主栽品種進行抗性改良的重要抗源。

致謝：中國農業(yè)科學院作物科學研究所李春輝副研究員提供了玉米材料的種子和雜種優(yōu)勢類群數(shù)據(jù)，在此表示感謝。