劉 霞，李 強(qiáng)，陳 勇，趙淑娟，郭榮珍，史炳霞，陳巧力，南桂英，孟召霞，張 冉，張 靜

舌癌是口腔頜面部常見的惡性腫瘤，有80%屬于鱗狀細(xì)胞癌，以舌前2/3部位常見；20%為腺癌，多位于舌根部。舌癌的轉(zhuǎn)移與浸潤(rùn)是一個(gè)復(fù)雜的過程，可受多種基因調(diào)控[1]。有研究顯示，在腫瘤細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展過程中，細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)揮著重要的作用，骨橋蛋白(OPN)則是細(xì)胞外基質(zhì)中的一種非膠原蛋白，能參與細(xì)胞免疫、信號(hào)傳導(dǎo)、骨礦化、細(xì)胞黏附等過程[2]。富含脯氨酸的酪氨酸激酶2(Pyk2)則是黏著斑激酶中的一員，可改變多種含SH2結(jié)構(gòu)域的底物蛋白，使其磷酸化，對(duì)骨架重組、細(xì)胞黏附、離子通道激活等多種信號(hào)傳導(dǎo)通路具有調(diào)節(jié)作用，可調(diào)控細(xì)胞活性、增殖及遷移能力，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[3]。磷酸化的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(p-AKT)屬于高度保守的蛋白激酶，能夠調(diào)控細(xì)胞的增殖與分化[4]。OPN、Pyk2、p-AKT在多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中均發(fā)揮著重要的作用。基于此，本文分析OPN、Pyk2、p-AKT在舌鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)情況，分析三者與舌鱗狀細(xì)胞癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系，以期為臨床診療和預(yù)后評(píng)估提供新的參考標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2018年2月—2020年2月滄州市中心醫(yī)院診治103例舌鱗狀細(xì)胞癌組織(舌癌組)及距腫瘤邊緣>0.5 cm的癌旁正常組織(對(duì)照組)，其中男69例，女34例；年齡45～79(60.11±2.34)歲；臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期58例，Ⅲ～Ⅳ期45例；病理分化程度：低-中分化41例，高分化62例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移49例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移54例。治療方式：根治性手術(shù)66例，根治性手術(shù)+周圍淋巴結(jié)清掃37例；術(shù)后放化療：是69例，否34例。①納入標(biāo)準(zhǔn)：均經(jīng)術(shù)后病理檢查證實(shí)為舌鱗狀細(xì)胞癌；無其他惡性腫瘤；臨床資料完整；患者及家屬均簽署知情同意書。②排除標(biāo)準(zhǔn)：存在血液系統(tǒng)或免疫系統(tǒng)疾病者；合并心、肝、腎等嚴(yán)重原發(fā)性疾病者；入組前行放化療者。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)執(zhí)行。

1.2方法

1.2.1OPN、Pyk2、p-AKT檢測(cè)方法：OPN、Pyk2、p-AKT均應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)，兔抗人OPN多克隆抗體和DAB顯色劑試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)、兔抗人Pyk2單克隆抗體(美國(guó)vitrogen公司)、兔抗人p-AKT多克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司)。①操作步驟：將組織石蠟切片脫蠟、水化后行枸櫞酸溶液微波修復(fù)，使用3%過氧化氫溶液在室溫封閉內(nèi)源性過氧化物10 min，3%小牛血清蛋白、37 ℃封閉1 h。滴加OPN、Pyk2、p-AKT一抗，4 ℃過夜，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，已知陽性標(biāo)本作為陽性對(duì)照。滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗IgG-HRP，在37 ℃封閉30 min，DAB使用重氮氨基苯顯色2～5 min，以蘇木素進(jìn)行輕度襯染，隨后進(jìn)行水洗、脫水、使用中性樹膠進(jìn)行封片，以光學(xué)顯微鏡觀察。②結(jié)果判讀：Pyk2、p-AKT蛋白著色為粗細(xì)不均勻的棕黃色顆粒，定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)，記為Pyk2、p-AKT表達(dá)陽性。細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)明顯的棕黃色顆粒記為OPN表達(dá)陽性。在高倍鏡(×400)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)，總共計(jì)數(shù)5個(gè)視野，取平均值。使用半定量積分法對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀：0分為無陽性細(xì)胞；1分為陽性細(xì)胞數(shù)≤25%；2分為陽性細(xì)胞數(shù)25%～50%，3分為陽性細(xì)胞數(shù)50%～75%，4分為陽性細(xì)胞數(shù)>75%。以細(xì)胞著色程度進(jìn)行評(píng)分：細(xì)胞無著色記0分；細(xì)胞著色為淡黃色記1分；細(xì)胞著色為棕黃色記2分；細(xì)胞著色為棕褐色記3分。根據(jù)兩項(xiàng)得分之和計(jì)算結(jié)果，得分<3分為陰性，≥3分則為陽性，得分越高，陽性表達(dá)越高。

1.2.2隨訪：在術(shù)后隨訪13個(gè)月了解患者預(yù)后情況，根據(jù)生存情況分為生存組和死亡組。

1.3觀察指標(biāo) 比較不同組織中OPN、Pyk2、p-AKT表達(dá)情況，分析OPN、Pyk2、p-AKT與舌鱗狀細(xì)胞癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，并分析影響舌鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后生存的危險(xiǎn)因素。

2 結(jié)果

2.1不同組織中OPN、Pyk2、p-AKT表達(dá)情況 舌癌組OPN、Pyk2、p-AKT表達(dá)陽性率均明顯高于對(duì)照組(P<0.01)。見表1。

表1 舌鱗狀細(xì)胞癌和癌旁正常組織兩組OPN、Pyk2、p-AKT表達(dá)情況[例(%)]

2.2OPN、Pyk2、p-AKT與舌鱗狀細(xì)胞癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 不同性別、年齡、腫瘤直徑舌鱗狀細(xì)胞癌患者OPN、Pyk2、p-AKT表達(dá)情況比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Ⅲ～Ⅳ期、高分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移舌鱗狀細(xì)胞癌患者OPN、Pyk2、p-AKT表達(dá)陽性率分別高于Ⅰ～Ⅱ期、低-中分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(P<0.05，P<0.01)。見表2。

表2 OPN、Pyk2、p-AKT與舌鱗狀細(xì)胞癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)

2.3單因素分析 隨訪13個(gè)月后，103例中生存81例(78.64%)，死亡22例(21.36%)。Ⅲ～Ⅳ期、高分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及OPN、Pyk2、p-AKT表達(dá)陽性舌鱗狀細(xì)胞癌患者病死率分別高于Ⅰ～Ⅱ期、低-中分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及OPN、Pyk2、p-AKT表達(dá)陰性患者(P<0.05，P<0.01)。不同性別、年齡、腫瘤直徑舌鱗狀細(xì)胞癌患者的病死率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 影響舌鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后生存的單因素分析(例)

2.4多因素Logistic回歸分析 將上述單因素分析中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的影響因素納入多因素Logistic回歸分析，影響因素賦值：臨床分期(Ⅰ～Ⅱ期=0，Ⅲ～Ⅳ期=1)、病理分化程度(低-中分化=0，高分化=1)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(否=0，是=1)、OPN表達(dá)(陰性=0，陽性=1)、Pyk2表達(dá)(陰性=0，陽性=1)、p-AKT表達(dá)(陰性=0，陽性=1)。Ⅲ～Ⅳ期、高分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及OPN、Pyk2、p-AKT表達(dá)陽性是影響舌鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.01)。見表4。

表4 影響舌鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后生存的多因素Logistic回歸分析

3 討論

OPN是與惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)的磷酸化蛋白提取物，是骨骼、牙齒礦化細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分[5]。近年來有研究表明，在許多腫瘤中可發(fā)現(xiàn)OPN表達(dá)明顯上調(diào)，而且OPN表達(dá)與腫瘤生物學(xué)行為及預(yù)后存在著密切的聯(lián)系[6]。有研究顯示，在大腸癌、胃癌、卵巢癌、食管癌等癌細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)OPN表達(dá)明顯上調(diào)，且OPN表達(dá)與患者病理學(xué)分期存在一定的聯(lián)系[7-8]。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，OPN在乳腺癌中表達(dá)明顯升高，而且OPN表達(dá)陽性患者的預(yù)后生存時(shí)間明顯短于OPN表達(dá)陰性患者，提示OPN表達(dá)與患者預(yù)后存在顯著相關(guān)性[9-10]。國(guó)外研究也發(fā)現(xiàn)，在多種上皮性惡性腫瘤組織中OPN表達(dá)明顯高于周圍正常組織，在患者外周血液中的含量也明顯升高，可為腫瘤診斷與篩查提供參考[11]。本研究結(jié)果顯示，舌鱗狀細(xì)胞癌組織中OPN表達(dá)陽性率明顯高于癌旁正常組織，其表達(dá)與臨床分期、病理分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)，說明OPN在舌癌發(fā)生、發(fā)展及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用。

Pyk2參與腫瘤細(xì)胞遷移、凋亡，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用也逐漸凸顯[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)，Pyk2主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，在癌組織中陽性率高于癌旁正常組織。其他研究也發(fā)現(xiàn)，Pyk2在頭頸部鱗癌、前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)也明顯增加[14-15]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Pyk2表達(dá)與臨床分期、病理分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況顯著相關(guān)，說明Pyk2可能參與了舌鱗狀細(xì)胞癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，與以往研究結(jié)果相符[16]。

AKT作為高度保守的蛋白激酶，在生理情況下處于低活性或失活狀態(tài)，如受到某些因素刺激，可導(dǎo)致AKT磷酸化而被激活[17]。p-AKT對(duì)細(xì)胞增殖、分化等具有重要的調(diào)控作用，在口腔癌、直腸癌、食管癌等惡性腫瘤中呈高表達(dá)，且可衡量磷脂酰肌醇-3-激酶活性[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn)，p-AKT表達(dá)在癌組織中明顯升高，且隨著惡性程度升高，其陽性程度越高，還與癌組織轉(zhuǎn)移有關(guān)，與以往研究結(jié)果一致[20-21]，提示p-AKT參與舌鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生與發(fā)展。另外本研究還發(fā)現(xiàn)，OPN、Pyk2、p-AKT表達(dá)陽性均為影響舌鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，三者表達(dá)陽性程度越高，患者病死率越高，提示OPN、Pyk2、p-AKT可能是反映舌鱗狀細(xì)胞癌生物學(xué)行為和預(yù)后的重要標(biāo)志物。如針對(duì)OPN、Pyk2、p-AKT作為靶點(diǎn)進(jìn)行藥物研發(fā)，或許可提高舌鱗狀細(xì)胞癌患者的綜合治療效果[22]。

綜上所述，OPN、Pyk2、p-AKT在舌鱗狀細(xì)胞癌組織中表達(dá)均明顯上調(diào)，在疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，且與癌細(xì)胞浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，還可為舌鱗狀細(xì)胞癌預(yù)后評(píng)估提供參考。