黃乃瑩 劉艷華

(東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物與自然保護(hù)地學(xué)院，哈爾濱，150040)

野生動(dòng)物食性研究是掌握動(dòng)物生境需求的核心內(nèi)容，它不僅對(duì)野生動(dòng)物的管理和保護(hù)有著非常重要的意義，還對(duì)理解生物多樣性如何影響生態(tài)系統(tǒng)的功能有著重要作用[1-2]。傳統(tǒng)的食性研究方法有很多種，如直接觀測(cè)法、利用法、胃容物分析法、糞便顯微分析法、籠養(yǎng)飼喂法等，這些方法各有利弊，一些操作可能會(huì)對(duì)野生動(dòng)物資源造成破壞，不利于野生動(dòng)物保護(hù)。糞便顯微分析法可以用于分析珍稀和瀕危物種的食性，但常常受到消化率、辨認(rèn)率等因素的限制[3]。分子糞便學(xué)(molecular scatology)克服了傳統(tǒng)方法的局限性，并且可以在不接觸、不干擾野生動(dòng)物生存活動(dòng)的情況下，利用野生動(dòng)物糞便提取DNA，用PCR擴(kuò)增技術(shù)得到足夠的遺傳信息進(jìn)行食性研究，可以對(duì)理解野生動(dòng)物的食性和取食行為，以及進(jìn)行野生動(dòng)物種群保護(hù)、資源管理、棲息地評(píng)價(jià)等研究提供基礎(chǔ)資料和理論依據(jù)。本研究旨在介紹分子糞便學(xué)在食性研究上的幾種主要方法，同時(shí)闡述國(guó)內(nèi)外分子糞便學(xué)食性研究的進(jìn)展和發(fā)展趨勢(shì)，以期為今后研究者們提供借鑒，促進(jìn)該技術(shù)更好地應(yīng)用與發(fā)展。

1 糞便DNA的研究方法

1.1 采集、保存與運(yùn)輸

采集新鮮的糞便樣本更有利于提取DNA，所以在取樣之前要進(jìn)行詳細(xì)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)。冬季氣溫低，地面被雪覆蓋，有利于追蹤野生動(dòng)物的足跡，更容易收集到新鮮的糞便樣本。采集時(shí)需佩戴一次性PE手套，每次采集均需要更換手套避免交叉污染。不同糞堆分裝并記錄地理信息、時(shí)間、天氣、該區(qū)域植物組成等信息。如果研究食草動(dòng)物，還需建立樣方，采集食草動(dòng)物可取食范圍內(nèi)的所有植物，補(bǔ)充植物數(shù)據(jù)庫(kù)信息。糞便樣本的保存要避免DNA降解和方便運(yùn)輸，主要保存方法有：硅膠干燥法[4]、乙醇保存法[5]和冷凍保存法[6]。乙醇保存法多用體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇或無(wú)水乙醇；冷凍保存法溫度一般為-20 ℃或-80 ℃。運(yùn)輸過(guò)程中保持0 ℃以下。也可根據(jù)實(shí)際需要，綜合使用不同保存方法，保證野外保存的可行性和運(yùn)輸?shù)谋憷浴?/p>

1.2 DNA提取

目前，大多利用試劑盒提取糞便DNA，其中QIAamp DNA Stool Mini Kit使用最多，但是此試劑盒中含有馬鈴薯吸附劑，在進(jìn)行食性分析時(shí)會(huì)造成不必要的誤差[7]。分析食草動(dòng)物食性時(shí)避免采用上述試劑盒，可以使用Zymo ZR Fecal DNA MiniPrep Kit[8]、Maxwell?16 Tissue DNA Purification Kit[9]等。除了試劑盒法，CTAB提取法對(duì)利用糞便提取DNA進(jìn)行食性分析的效果也很好[10]。改進(jìn)后的2CTAB-PCL法則更適合食肉動(dòng)物糞便DNA的提取[11]。

1.3 序列選擇

生命條形碼聯(lián)盟(Consortium for the Barcode of Life，CBOL)建議將葉綠體基因rbcL、matK、trnH-psbA和核基因ITS作為陸地植物通用的DNA條形碼。rbcL片段在物種水平變異小，更為通用。matK、trnH-psbA片段進(jìn)化速率快，通用性差，適合種屬水平的物種鑒別。ITS在物種水平上變異較大，應(yīng)用廣泛[12]。還有學(xué)者提出了其他片段與片段的組合，需結(jié)合具體情況進(jìn)行分析。

2 分子食性分析方法

2.1 DNA條形碼(DNA barcoding)

DNA條形碼是利用一段標(biāo)準(zhǔn)化的DNA序列作為標(biāo)簽，以快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行物種鑒定?！癉NA barcoding”一詞最早在1993年被使用[13]，但在2003年Hebert等[14-15]的論文發(fā)表后才得到重視。Hebert等提出利用線粒體基因細(xì)胞色素c氧化酶亞基Ⅰ的基因片段可以作為全球動(dòng)物生物鑒定系統(tǒng)的核心，并且從門、目、種等分類水平上進(jìn)行試驗(yàn)和分析，證明其具有良好的識(shí)別能力。將其中一段長(zhǎng)約650 bp的DNA序列作為動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼，得到廣泛認(rèn)可和應(yīng)用。此后，植物學(xué)研究中也使用了DNA條形碼，使從糞便中分離出的DNA確定食草動(dòng)物的飲食結(jié)構(gòu)成為可能。

當(dāng)然，DNA條形碼技術(shù)也存在一定缺陷。首先，理想的DNA條形碼標(biāo)記應(yīng)該是可變的、標(biāo)準(zhǔn)化的、系統(tǒng)發(fā)育信息豐富的、極其穩(wěn)定和短小的，然而這樣一個(gè)理想的DNA條形碼還沒(méi)有被發(fā)現(xiàn)。其次，由于DNA條形碼上的遺傳信息有限，且DNA條形碼的原理是利用種內(nèi)特異性和種間變異性來(lái)完成物種鑒定，在利用動(dòng)物糞便進(jìn)行食性分析時(shí)，往往會(huì)因?yàn)閯?dòng)物取食近緣植物而導(dǎo)致分析存在偏差。再次，DNA條形碼技術(shù)也常因價(jià)格昂貴而不被研究人員選擇。

2.2 DNA宏條形碼(DNA metabarcoding)

二代測(cè)序技術(shù)(next-generation-sequencing，NGS)的發(fā)展，克服了Sanger測(cè)序法不能對(duì)多種不同個(gè)體和物種混合樣品進(jìn)行快速有效分類、評(píng)估的問(wèn)題。DNA宏條形碼技術(shù)就是在此基礎(chǔ)上產(chǎn)生的，主要是利用高通量測(cè)序技術(shù)大量獲得混合樣本中多種條形碼基因擴(kuò)增子序列，并通過(guò)生物信息學(xué)手段分析鑒定[16]。此方法可利用混合樣本自動(dòng)識(shí)別出多個(gè)物種，提高了食性分析的分辨率和物種鑒定水平，大大減少了采樣的工作量[17]。

2.3 DNA微型條形碼(DNA mini-barcoding)

陳舊樣本或經(jīng)過(guò)其他處理的DNA降解樣本，很難擴(kuò)增出完整的DNA條形碼，DNA微型條形碼則解決了這一問(wèn)題。DNA微型條形碼是在DNA條形碼的基礎(chǔ)上進(jìn)行的補(bǔ)充和完善，它與傳統(tǒng)DNA條形碼相比較短，一般為長(zhǎng)度100～200 bp的DNA序列，在易降解的DNA樣本中也可以獲得[18]。

3 分子糞便學(xué)的應(yīng)用

Taberlet等[19]在2007年提出利用葉綠體trnL(UAA)內(nèi)含子，特別是其P6環(huán)，來(lái)研究食草動(dòng)物的食性。由于其引物高度保守，擴(kuò)增系統(tǒng)非常穩(wěn)定可廣泛應(yīng)用到基于糞便的食性分析。目前，DNA條形碼技術(shù)已經(jīng)成功地從食草動(dòng)物的糞便中識(shí)別出各種食草動(dòng)物的食性偏好。例如，Buglione等[20]從22份糞便樣本中利用CTAB法提取糞便DNA，并采用DNA條形碼(植物ITS1區(qū)域)和二代測(cè)序技術(shù)成功地分析了科西嘉島野兔(Lepuscorsicanus)的食性，用同種方法比較了當(dāng)?shù)馗?jìng)爭(zhēng)種——?dú)W洲野兔(L.europaeus)的食性，有效地評(píng)估了科西嘉島野兔和歐洲野兔的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，為了解當(dāng)?shù)貫l危物種的食性組成、了解其在生物群落中的作用提供了關(guān)鍵資料；Kowalczyk等[21]在2012年利用植物條形碼trnL區(qū)域?qū)W洲野牛(Bisonbonasus)的食性進(jìn)行了準(zhǔn)確分析，為當(dāng)?shù)匾吧鷦?dòng)物保護(hù)和森林管理提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)；Baamrane等[22]在春、夏、秋3個(gè)季節(jié)共采集糞便樣本60份，利用DNeasy Blood & Tissue Kit試劑盒進(jìn)行糞便DNA的提取，用植物條形碼trnL對(duì)鹿瞪羚摩洛哥亞種(Gazelladorcasmassaesyla)的食性做出了準(zhǔn)確評(píng)估。Erickson等[8]在對(duì)白尾鹿(Odocoileusvirginianus)的食性研究中利用了植物rbcL基因的微型條形碼，準(zhǔn)確率接近全長(zhǎng)DNA條形碼的90%，顯示出了較高的物種鑒定水平，但也需要更多對(duì)比試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證結(jié)果的可靠性。邵昕寧等[5]在利用宏條形碼技術(shù)從不同糞便樣本中成功分析出了7種食肉動(dòng)物的食性組成，其中包括豹貓(Prionailurusbengalensis)、赤狐(Vulpesvulpes)、狼(Canislupus)、狗(Canislupusfamiliaris)、棕熊(Ursusarctos)、豹(Pantherapardus)和雪豹(P.unica)。上述研究不僅對(duì)了解動(dòng)物食性有巨大幫助，還有助于了解研究地區(qū)的生態(tài)系統(tǒng)食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)及功能，這對(duì)于生物多樣性保護(hù)有重要意義，同時(shí)也為使用糞便DNA進(jìn)行食性分析提供了有利借鑒。

4 結(jié)論與討論

隨著技術(shù)方法的不斷革新和條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)的豐富，分子生物學(xué)在食性研究領(lǐng)域的關(guān)注度持續(xù)上升。但國(guó)內(nèi)關(guān)注時(shí)間較短，發(fā)文量較少，利用糞便作為研究樣本的文獻(xiàn)更是寥寥無(wú)幾[23]。在國(guó)內(nèi)，DNA條形碼在魚類和昆蟲上應(yīng)用較多，在食性分析、構(gòu)建食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)上有很好的表現(xiàn)，但樣本均為胃容物[24]。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)野生動(dòng)物的食性研究大多仍選擇糞便顯微分析法，但分子糞便學(xué)在食性研究中比傳統(tǒng)方法更為準(zhǔn)確和客觀。分子糞便學(xué)研究野生動(dòng)物食性常受到樣本質(zhì)量的制約，但是隨著測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，這種問(wèn)題也在逐步解決。Mini-DNA條形碼的提出在一定程度上對(duì)條形碼技術(shù)進(jìn)行了完善和補(bǔ)充，因?yàn)樗cDNA條形碼相比需要的序列更短，更容易從已降解的糞便樣本中得到。在高通測(cè)序技術(shù)上產(chǎn)生的DNA宏條形碼技術(shù)解決了另一問(wèn)題，即對(duì)多種不同個(gè)體和物種混合樣品進(jìn)行快速有效分類以及評(píng)估。注重糞便樣本的采集與保存、對(duì)糞便樣本重復(fù)提取等也可以提高結(jié)果的準(zhǔn)確率。也可結(jié)合試驗(yàn)地點(diǎn)的植被情況，選擇植物條形碼序列，建立當(dāng)?shù)刂参顳NA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)近緣種植物進(jìn)行區(qū)分[7]。

可以預(yù)見，未來(lái)會(huì)更注重大規(guī)模多重引物PCR技術(shù)的應(yīng)用，因?yàn)槎嘀豍CR技術(shù)不僅可以擴(kuò)增出同一模板不同區(qū)域的多個(gè)目的DNA片段，還可以同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)DNA模板的不同DNA片段，達(dá)到節(jié)約樣品、減少試驗(yàn)次數(shù)、降低試驗(yàn)污染的目的，同時(shí)節(jié)約了時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本[25-26]。由于非損傷性取樣的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)以及分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，未來(lái)野生動(dòng)物的食性分析中分子糞便學(xué)將占據(jù)極大優(yōu)勢(shì)。分子糞便學(xué)在食草動(dòng)物的食性鑒定中有巨大潛力，如果找到準(zhǔn)確區(qū)分牧草類型的標(biāo)準(zhǔn)植物條形碼，不僅對(duì)野生動(dòng)物夏季食性研究帶來(lái)巨大幫助，還可以通過(guò)檢測(cè)放牧動(dòng)物的食性數(shù)據(jù)來(lái)預(yù)估動(dòng)物產(chǎn)能，從而獲得更大的經(jīng)濟(jì)收益[27]。這不僅是一個(gè)用于森林及其養(yǎng)護(hù)管理的有效工具，還是一種加強(qiáng)生態(tài)研究、重點(diǎn)關(guān)注食草動(dòng)物對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的影響及其可能的食物生態(tài)位重疊的方式，還可以監(jiān)測(cè)城市周邊小型野生動(dòng)物對(duì)城市周邊生態(tài)系統(tǒng)的影響[28]。總之，分子糞便學(xué)技術(shù)前景廣闊，隨著技術(shù)水平的不斷提高，此方法將會(huì)越來(lái)越準(zhǔn)確高效，并能更好地應(yīng)用到野生動(dòng)物的食性分析中。