趙成堅 全琛宇 霍 娟 徐永莉 姜建萍*

(1.廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，南寧，530023；2.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所，廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室，南寧，530001)

大壁虎(Gekkogecko)，又名蛤蚧，屬爬行綱(Reptilia)，有鱗目(Squamata)，蜥蜴亞目(Lacertilia)，壁虎科(Gekkonidae)動物。作為一味傳統(tǒng)中藥，大壁虎具有調(diào)節(jié)免疫[1-2]、抗腫瘤[2]、平喘[3]、抗炎[4]及抗衰老[5]等作用。同時，大壁虎亦可作為保健品與藥膳等，有補肺益腎、納氣定喘、助陽益精的功效[6]。隨著市場對大壁虎需求量的日益增加，現(xiàn)有野生大壁虎資源已無法滿足需求，人工養(yǎng)殖大壁虎成為了解決大壁虎緊缺的有效途徑。然而，大壁虎人工養(yǎng)殖過程中廣泛出現(xiàn)畸形、生殖困難、疾病發(fā)病率高及發(fā)育不良等問題，嚴重影響?zhàn)B殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。多項研究表明，這些問題可能與大壁虎特有的食性與飲食結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[7]。大壁虎一般只吃活昆蟲，如蝗蟲(Locustamigratoriamanilensis)、黃粉蟲(Tenebriomolitor)、土鱉蟲(Eupolyphagasinensis)及大麥蟲(Zophobasmorio)等。長時間飼喂單一品種的昆蟲易引發(fā)肢體畸形、腸炎等營養(yǎng)代謝類疾病，與腸道菌群失衡密切相關(guān)。同時，每年12月至次年3月為大壁虎的冬眠期，這期間停止攝食，其腸道菌群結(jié)構(gòu)基本不變，是調(diào)節(jié)大壁虎機體生理功能的重要時期。腸道菌群具有促進腸黏膜免疫系統(tǒng)生長發(fā)育和調(diào)控黏膜屏障與免疫功能的雙重作用[8]，孟祥晨等[9]通過比較嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacteriuminfantis，BI)和長雙歧桿菌(B.longum，BL)對正常小白鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)2株菌均對正常BALB/C小白鼠的免疫功能具有正相調(diào)節(jié)作用，并具有良好調(diào)節(jié)腸道菌群能力；葉明等[10]通過移植正常小鼠的糞便菌群至帕金森病小鼠模型，發(fā)現(xiàn)糞菌移植小鼠模型恢復了一定的神經(jīng)保護作用，表明正常平衡的腸道菌群對機體的生理健康起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。目前，對于大壁虎腸道菌群的研究幾無報道，研究多集中于養(yǎng)殖、鑒定等表觀方面。因此，全面深入地探究腸道菌群與飲食結(jié)構(gòu)及健康的關(guān)系，是科學養(yǎng)殖大壁虎的關(guān)鍵。本研究通過16S rDNA高通量測序技術(shù)比較了冬眠期與捕食期的大壁虎胃腸道微生物菌群差異及飼喂不同昆蟲飼料時大壁虎胃腸道微生物菌群的差異，全面分析大壁虎胃腸道微生物的多樣性及其對大壁虎生長發(fā)育周期的影響，旨在為優(yōu)化人工飼養(yǎng)大壁虎的膳食結(jié)構(gòu)及養(yǎng)殖程序提供必要的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為3歲以上(成年)大壁虎，由廣西藥用植物園大壁虎養(yǎng)殖基地提供。大壁虎統(tǒng)一飼養(yǎng)于實驗室養(yǎng)殖籠中，保持良好通風，避免潮濕，相對濕度控制在60%左右，溫度控制在25～30 ℃，健康且外觀無明顯傷痕，平均體重為(65.50±8.30)g，雌雄不限。

1.2 大壁虎的飼養(yǎng)管理及樣品搜集

2018年5月從養(yǎng)殖基地統(tǒng)一飼養(yǎng)的大壁虎中挑選體型相近的健康成年大壁虎25只，稱重后隨機分為5組，每組5只。前4組分別單獨飼喂蝗蟲、黃粉蟲、土鱉蟲和大麥蟲，第5組飼喂等比例混合昆蟲(蝗蟲、黃粉蟲、土鱉蟲、大麥蟲)。將昆蟲置于養(yǎng)殖室內(nèi)的淺盆中，供其自由采食，每日及時清理未吃完的昆蟲及昆蟲殘渣，打掃室內(nèi)環(huán)境衛(wèi)生。飲水中不添加任何藥物。3個月內(nèi)，每周稱量各飼養(yǎng)組大壁虎的體重，并于3個月后收集各組大壁虎的新鮮糞便，送至測序公司進行高通量測序。準備進入冬眠期時，將大壁虎集中轉(zhuǎn)移到養(yǎng)殖箱內(nèi)，溫度控制在20～25 ℃，相對濕度控制在65%～70%。冬眠期收集第5組大壁虎的新鮮糞便，送至測序公司進行高通量測序。

1.3 16S rDNA測序分析

凍存糞便樣本送至北京諾禾致源科技股份有限公司(北京)進行16S rDNA測序。采用CTAB法[11]提取黏膜樣本的DNA，檢測其純度與濃度后用無菌水稀釋至1 ng/μL。合格樣品與其特異性引物配置PCR反應體系，設(shè)置對應的PCR反應參數(shù)進行PCR擴增，對其產(chǎn)物進行混樣和純化。使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒(Illumina，美國)進行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit和Q-PCR定量。文庫合格后，使用NovaSeq 6000進行上機測序。下機數(shù)據(jù)根據(jù)Barcode序列和PCR擴增引物序列特異性標記為不同樣本的數(shù)據(jù)，去除Barcode序列和引物序列后使用FLASH軟件(v1.2.7)[12]對各樣本reads進行拼接，得到Raw Tags。Raw Tags經(jīng)過嚴格的過濾后[13-15]，去除低質(zhì)量的Tags和嵌合體序列，得到最終的有效數(shù)據(jù)。

1.4 測序數(shù)據(jù)分析

使用Uparse軟件[16](v7.0.1001)對所有有效標簽(effective tags)進行聚類分析，將一致性達97%的序列聚類成為OTUs，同時篩選OTUs的代表序列，使用Mothur方法與SILVA132[17]的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫[18]對其進行物種注釋。分別統(tǒng)計界、門、綱、目、科、屬、種各分類階元樣本的群落組成，并使用MUSCLE v3.8.31[18]進行快速多序列比對，得到所有OTUs代表序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。最后，對各組數(shù)據(jù)進行均一化處理，再進行Alpha多樣性、Beta多樣性、環(huán)境因子關(guān)聯(lián)分析等。

1.5 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)運用SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析，各比較組樣本的菌群差異比較均采用非參數(shù)檢驗(Mann-WhitneyU秩和檢驗)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同昆蟲飼料對大壁虎的增重效果

飼喂單一品種昆蟲對大壁虎增重效果不盡相同(圖1)。其中，飼喂蝗蟲和土鱉蟲的大壁虎體重變化趨勢相近，飼喂黃粉蟲和大麥蟲的大壁虎體重變化趨勢相近。在單一昆蟲飼料組中，蝗蟲組對大壁虎的增重效果最佳，混合昆蟲飼料組對大壁虎的增重效果優(yōu)于單一昆蟲飼料組。

圖1 飼喂不同昆蟲時大壁虎的體重

2.2 不同昆蟲飼料對大壁虎腸道菌群組成的影響

在屬水平上，蝗蟲組腸道菌群中占比較高的為擬桿菌屬(Bacteroides，20.81%)、未知腸桿菌屬(unidentified Enterobacteriaceae，11.31%)及Parabacteroides菌屬(9.84%)；黃粉蟲組腸道菌群中占比較高的為擬桿菌屬(27.16%)、Parabacteroides菌屬(13.09%)及沙門氏菌屬(Salmonella，9.50%)；土鱉蟲組腸道菌群中占比較高的為擬桿菌屬(28.48%)、Lachnoclostridium菌屬(8.19%)及氏菌屬(6.07%)；大麥蟲組腸道菌群中占比較高的為擬桿菌屬(35.27%)、立克次氏小體屬(Rickettsiella，8.86%)及考拉桿菌屬(Phascolarctobacterium，6.12%)。結(jié)果表明，不同昆蟲飼料會顯著影響大壁虎腸道微生物的菌群結(jié)構(gòu)(圖2)；在結(jié)構(gòu)上，蝗蟲組和土鱉蟲組較接近，黃粉蟲組與大麥蟲組較接近(圖3)。

圖2 飼喂不同昆蟲時大壁虎腸道菌群屬水平豐度前10的菌類

圖3 飼喂不同昆蟲時大壁虎腸道菌群門水平結(jié)構(gòu)相似度聚類

2.3 冬眠期與捕食期大壁虎腸道菌群結(jié)構(gòu)組成

在屬水平上，冬眠期腸道菌群中占比最高的為擬桿菌屬(9.86%)，其次為考拉桿菌屬(7.08%)及Akkermansia菌屬(8.54%)；捕食期腸道菌群中占比最高的為擬桿菌屬(14.49%)，其次為考拉桿菌屬(8.19%)及Parabacteroides菌屬(8.74%)。二者結(jié)構(gòu)相似度很高(圖4)。

圖4 冬眠期與捕食期大壁虎腸道菌群屬水平豐度前10的菌類

2.4 樣品復雜度

QIIME軟件計算樣品復雜度指數(shù)(Observed-species，Chao1，Shannon，Simpson，ACE，Goods-coverage，PD whole tree)計算結(jié)果顯示：冬眠期大壁虎腸道菌群的物種總數(shù)高于捕食期，且群落多樣性高(圖5)。其中，由于PD whole tree是一個兼顧考慮進化距離的多樣性評估指數(shù)，在計算時會考慮到各菌群直接的一個進化關(guān)系，可能是因為捕食期攝入飼料會改變腸道菌群的結(jié)構(gòu)，而這種動態(tài)變化的過程中，各菌群之間存在一定的相互作用關(guān)系，所以該指數(shù)高。

圖5 不同時期大壁虎腸道菌群樣品復雜度

2.5 大壁虎腸道菌群Beta多樣性

Beta多樣性指數(shù)結(jié)果顯示，冬眠組樣品的組內(nèi)差異顯著小于捕食組樣品，這表明冬眠期大壁虎腸道菌群更為穩(wěn)定(圖6)。

圖6 大壁虎腸道菌群Beta多樣性

2.6 大壁虎腸道菌群組間物種門水平差異

經(jīng)組間的t-test檢驗，在門水平上，冬眠期與捕食期差異顯著(P<0.05)的菌種主要為疣微菌門(Verrucomicrobia)、放線菌門(Actinobacteria)、藍藻門(Cyanophyta)及Saccharibacteria門(圖7)。

圖7 大壁虎腸道菌群組間物種門水平差異

3 討論

大壁虎因其特殊的食性，幾乎只吃活昆蟲，因此人工飼養(yǎng)時需飼喂活昆蟲。本研究通過比較蝗蟲、黃粉蟲、土鱉蟲及大麥蟲等大壁虎喜食的常見飼料，發(fā)現(xiàn)飼喂蝗蟲和土鱉蟲的大壁虎生長速度相近，飼喂黃粉蟲和大麥蟲的大壁虎生長速度相近，這與它們的腸道菌群結(jié)構(gòu)相近有關(guān)，而飼喂蝗蟲的大壁虎生長最快。相較于單一飼喂一種昆蟲的大壁虎，飼喂混合昆蟲的大壁虎生長速度較快。前期研究表明，飼喂單一昆蟲易致畸，飼喂混合昆蟲不僅可以提高大壁虎的生長速度，還可以降低畸形的概率。

近年來，高通量測序技術(shù)因其高準確性與高靈敏度的優(yōu)勢，已成為研究腸道微生物的重要手段之一。通過該技術(shù)，可較深入地分析樣品中微生物的多樣性及全面性。本研究通過比較分別飼喂蝗蟲、黃粉蟲、土鱉蟲及大麥蟲的大壁虎糞便樣品，發(fā)現(xiàn)飼喂不同類型的昆蟲使大壁虎的腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，結(jié)合不同飼料導致生長速度不同的結(jié)果，可知這些變化的菌群是調(diào)節(jié)大壁虎生長速度的重要因素。對各組糞樣的生物學分析結(jié)果顯示，豐度最高的菌群為擬桿菌屬，其在各組中的占比分別為20.81%(蝗蟲組)、27.16%(黃粉蟲組)、28.48%(土鱉蟲組)及35.27%(大麥蟲組)?；旌巷曃?種昆蟲后，擬桿菌屬的占比為14.49%，此時該組大壁虎生長速度遠快于單一飼料組，可見擬桿菌屬在腸道菌群中的占比與大壁虎生長速度存在一定的關(guān)聯(lián)。擬桿菌屬正常寄居于人和動物的腸道、口腔、上呼吸道和生殖道，當菌群失調(diào)時，可導致內(nèi)源性感染，如肝膿腫、轉(zhuǎn)移性膿腫、腹膜炎、尿路感染等[19-20]。朱萬英等[21]通過比較肥胖兒童與正常兒童的腸道擬桿菌屬相似性及多樣性差別，發(fā)現(xiàn)肥胖兒童腸道擬桿菌屬的多樣性及相似性降低，表明擬桿菌屬與機體生長存在一定的關(guān)聯(lián)。郭慧等[22]通過添加水解單寧改善對蝦生長速度，添加組對蝦腸道菌群中擬桿菌門的比例降低。本試驗結(jié)果與上述研究結(jié)果類似，表明擬桿菌屬確實與機體生長相關(guān)。張廣文等[23]使用大豆異黃酮對骨質(zhì)疏松大鼠模型進行了治療，發(fā)現(xiàn)大豆異黃酮可通過改善大鼠腸道菌群來改善骨質(zhì)疏松，其中，治療組腸道中擬桿菌屬水平顯著降低，表明擬桿菌屬水平與骨健康相關(guān)，降低其豐度可維持機體正常骨生長，避免畸形。陳弋等[24]比較了嶺南濕熱癥小鼠與健康小鼠的腸道菌群，發(fā)現(xiàn)濕熱癥小鼠的腸道中擬桿菌屬豐度呈特征性增多(P<0.05)。宋軍民等[25]比較了炎癥性腸病患者腸道菌群變化，發(fā)現(xiàn)炎癥性腸病患者的腸道中擬桿菌屬數(shù)量明顯增加。潘勇[26]比較了大腸癌患者與大腸腺瘤患者的腸道菌群，發(fā)現(xiàn)大腸癌組患者的擬桿菌屬水平均明顯高于大腸腺瘤組和對照組(P<0.05)。這些研究表明擬桿菌屬水平與疾病呈明顯正相關(guān)。因此，通過改變飼料的組成，來調(diào)節(jié)大壁虎腸道中擬桿菌屬的水平，可提高大壁虎的生長速度，并預防疾病。

蝗蟲組大壁虎腸道中豐度第2高的優(yōu)勢菌群Parabacteroides菌屬(13.09%)也與大壁虎的生長密切相關(guān)。Wang等[27]揭示腸道共生菌Parabacteroidesdistasonis的含量與肥胖、非酒精性脂肪肝、糖尿病等疾病狀態(tài)呈顯著負相關(guān)，提示其可能在糖脂代謝方面發(fā)揮正向調(diào)節(jié)作用。土鱉蟲組中的豐度第2高的Lachnoclostridium菌屬(8.19%)與疾病相關(guān)。汪群[28]發(fā)現(xiàn)腹瀉仔豬糞便中Lachnoclostridium菌屬的相對豐度顯著低于健康仔豬，表明其與仔豬腹瀉密切相關(guān)。這些大壁虎胃腸道的優(yōu)勢菌群與宿主的健康密切相關(guān)，其含量的改變可明顯影響宿主的健康。因此，通過不同昆蟲飼料的搭配來調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，是有效提高養(yǎng)殖效率的手段。

通過比較捕食期和冬眠期的大壁虎糞便樣品，發(fā)現(xiàn)其菌群結(jié)構(gòu)較為相似，其最主要的差異菌群為放線菌門(P<0.01)。放線菌多寄居于人和動物口腔、上呼吸道、消化道及泌尿生殖道，當機體抵抗力降低、口腔衛(wèi)生不良、拔牙或口腔黏膜受損時，可致內(nèi)源性感染，引起放線菌病。冬眠組大壁虎腸道中放線菌顯著增加，在冬眠期大壁虎患放線菌病的概率大大提高，需注意提高大壁虎的抵抗力，同時注意通風保暖。

綜上所述，本研究證明飼喂不同的昆蟲會顯著影響大壁虎生長速度，混合昆蟲飼料較單一昆蟲飼料有促生長及防畸形的作用。不同昆蟲飼料可通過調(diào)節(jié)大壁虎腸道中擬桿菌屬的水平來調(diào)節(jié)大壁虎生長速度與預防疾病。通過調(diào)節(jié)膳食結(jié)構(gòu)，使擬桿菌屬、Parabacteroides菌屬、Lachnoclostridium菌屬等參與調(diào)節(jié)大壁虎生長與健康的優(yōu)勢菌群占比趨于穩(wěn)定，可有效提高大壁虎的養(yǎng)殖效率。