田詩宇,范婉寧,王芳

1(北京農(nóng)學院 食品科學與工程學院, 食品質(zhì)量與安全北京實驗室,農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及 農(nóng)殘安全檢測與控制北京市重點實驗室,北京,102206) 2(魯東大學 食品工程學院,山東 煙臺,264025)

風味是評價干酪品質(zhì)最重要的指標之一[1]。輔助發(fā)酵劑是一類可以提高干酪風味或加快干酪成熟的微生物制劑[2],對于改善干酪的風味具有重要意義[3]。目前常見的輔助發(fā)酵劑多為非發(fā)酵劑乳酸菌[4]。某些酵母菌可以作為輔助發(fā)酵劑對成熟過程中干酪的風味形成產(chǎn)生積極影響[5-7],如乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)、發(fā)酵畢赤酵母(Pichiafermentans)、漢遜德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)等。

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)是藍紋干酪、卡門貝爾干酪等干酪中較為常見的酵母菌[8]。HANSEN等[9]將釀酒酵母FB7用于藍紋干酪中,發(fā)現(xiàn)釀酒酵母FB7能夠促進青霉菌的生長、加速成熟過程中蛋白質(zhì)的分解、改善干酪的風味。S?RENSEN等[10]在干酪模型中添加釀酒酵母D7能夠顯著增加干酪中酯類化合物的含量。

切達干酪是世界上銷量最大的干酪品種之一,成熟期長,是研究外源物質(zhì)對干酪成熟過程中風味影響的最佳模型之一[11]。在前期研究中,我們采用單因素和正交實驗,以感官評價和干酪產(chǎn)量為主要評定指標,優(yōu)化了添加釀酒酵母的切達干酪的加工工藝。在此基礎(chǔ)上,本研究選定了3種加工工藝制作添加釀酒酵母的切達干酪,并通過頂空固相微萃取和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)確定產(chǎn)品中揮發(fā)性風味化合物的組成,通過感官評價方法評定消費者對產(chǎn)品的接受度,通過聚類分析探究干酪的揮發(fā)性風味化合物與成熟期之間的關(guān)系,為新型風味干酪的開發(fā)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛋白質(zhì)含量為2.97%～3.05%,脂肪含量為3.71%～3.94%,抗生素檢測為陰性的新鮮牛乳,蒙牛乳業(yè)(北京)有限責任公司；蔗糖,廣州福正東海食品有限公司；活性干釀酒酵母,安琪酵母股份有限公司；CHY-MAX powder Extra NB凝乳酶、R-704直投式干酪發(fā)酵劑,科漢森(中國)有限公司。

CaCl2、NaCl等均為分析純,北京化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

DK-8B水浴鍋,中國精宏實驗設(shè)備有限公司；干酪槽和干酪壓榨器,實驗室自制；DSHZ-300A水浴恒溫振蕩器,蘇州培英實驗設(shè)備有限公司；ME204分析天平,梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司；CJ78-1磁力攪拌器,常州市金壇大地自動化儀器廠；PHB-4精密酸度計,上海儀電科學儀器有限公司；7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)機,美國Agilent公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 干酪制作工藝

添加蔗糖的原料乳于90 ℃加熱滅菌15 min,然后冷卻至23 ℃,接種0.2 g/L釀酒酵母發(fā)酵72 h。酒精發(fā)酵結(jié)束后升溫至32 ℃,接種干酪發(fā)酵劑發(fā)酵30 min,加入CaCl2和凝乳酶進行凝乳,到達凝乳終點后用干酪刀切割凝塊排出乳清,以5 min/℃的速度勻速升溫至39 ℃并進行堆疊。當pH下降至5.5時將凝塊進行鹽漬、壓榨,壓榨壓力為120 kg,時間為12 h,真空包裝,并在4 ℃下成熟90 d,分別于第1、30、60、90天取樣分析。

KY組(正交實驗中以感官評分為指標優(yōu)化得到的理論最優(yōu)干酪)：蔗糖添加量50 g/L,干酪發(fā)酵劑添加量0.02 g/L,凝乳酶添加量0.1 g/L；KH組(正交實驗中感官評分最高的干酪)：蔗糖添加量50 g/L,干酪發(fā)酵劑添加量0.02 g/L,凝乳酶添加量0.2 g/L；KC組(正交實驗中產(chǎn)量最高的干酪)：蔗糖添加量40 g/L,干酪發(fā)酵劑添加量0.02 g/L,凝乳酶添加量0.1 g/L。

1.3.2 頂空固相微萃取和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

稱取5 g切碎的干酪樣品于20 mL頂空玻璃瓶中,密封并在50 ℃平衡10 min。插入頂空微萃取針吸附40 min,將吸附后萃取頭插入氣質(zhì)聯(lián)用儀進樣口,250 ℃下解吸5 min。色譜條件：DB-WAX毛細管柱(30.0 m×250 μm×0.25 μm),起始溫度35 ℃保持2 min,3 ℃/min升溫至150 ℃,再以10 ℃/min升溫至230 ℃保持5 min,載氣為He,流速為1.2 mL/min。質(zhì)譜條件：電離方式為電子電離(electronic ionization,EI),電子能量70 eV,掃描范圍為12～550 amu,離子源溫度為230 ℃,四極桿溫度為150 ℃,界面溫度為280 ℃。

1.3.3 感官評價

參照BIAGIOTTI等[12]的方法。由10名來自北京農(nóng)學院食品科學與工程學院具有干酪品嘗經(jīng)驗的品鑒員(5男5女,年齡20～35歲)對成熟1和90 d的干酪樣品進行感官評價,從外觀(25分)、口感(25分)、氣味(25分)、滋味(25分)4個方面進行打分,總分100分,以10人平均分作為干酪感官得分的最終值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有樣品均重復測定3次。方差分析借助SPSS 23.0完成；圖表借助Origin 2018完成；熱圖借助Heml完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 揮發(fā)性風味化合物

表1～表3分別是KY、KH、KC三組干酪成熟1、30、60、90 d揮發(fā)性風味化合物的變化。3組干酪成熟過程中揮發(fā)性風味化合物的種類和含量發(fā)生顯著性變化(P<0.05)。隨著干酪成熟時間的延長,3組干酪的揮發(fā)性風味化合物的種類都呈現(xiàn)增加趨勢：KY、KH、KC三組干酪在成熟1 d分別檢測到揮發(fā)性風味化合物13、13、14種,在成熟90 d分別檢測到揮發(fā)性風味化合物19、21、23種。3組干酪成熟過程中,KY、KH兩組揮發(fā)性風味化合物的含量基本呈現(xiàn)增加趨勢(P<0.05),而KC組則基本呈現(xiàn)降低趨勢(P<0.05)。在同一成熟時間,3組干酪中揮發(fā)性風味化合物的種類和含量存在顯著性差異(P<0.05)。在3組干酪中都含有且含量較高的揮發(fā)性風味化合物包括乙醇、異戊醇、苯乙醇、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙基9-癸烯酸酯、苯乙烯等。3組干酪中不同種類風味物質(zhì)的分布有一定的相似性,含量最高的是醇類和酯類。KY、KH兩組揮發(fā)性風味化合物的種類和含量與KC組差異顯著(P<0.05),揮發(fā)性風味化合物的含量顯著高于KC組(P<0.05)。

醇類化合物主要通過乳糖代謝、氨基酸代謝等生化反應(yīng)生成[13]。與傳統(tǒng)工藝制作的干酪不同,3組干酪的加工過程中添加了釀酒酵母,因此釀酒酵母的無氧代謝也是醇類化合物的重要生成途徑。3組干酪在所有成熟期內(nèi)均檢測到乙醇、異戊醇和苯乙醇,其中乙醇與酒的氣味有關(guān)；異戊醇被認為是干酪的主要香氣之一,提供了一種甜味,與水果味和果渣味有關(guān)[14]；苯乙醇是苯丙氨酸在酵母菌的代謝作用下形成的,與玫瑰香氣有關(guān)[15]。隨著干酪成熟時間的延長,KY、KH兩組中乙醇、異戊醇和苯乙醇含量顯著增加(P<0.05)；KC組中乙醇和苯乙醇含量顯著降低(P<0.05),異戊醇則呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。3組干酪的加工工藝顯示KY、KH兩組中蔗糖添加量高于KC組,導致前兩者中釀酒酵母的數(shù)量高于KC組(結(jié)果未顯示),可能是成熟90 d時KY、KH兩組中醇類化合物含量顯著高于KC組的主要原因。

表1 KY組干酪成熟過程中揮發(fā)性風味化合物的變化(峰面積×106)Table 1 Changes in volatile flavor substances of KY during ripening (peak area×106)

表2 KH組干酪成熟過程中揮發(fā)性風味化合物的變化(峰面積×106)Table 2 Changes in volatile flavor substances of KH during ripening (peak area×106)

續(xù)表2

表3 KC組干酪成熟過程中揮發(fā)性風味化合物的變化(峰面積×106)Table 3 Changes in volatile flavor substances of KC during ripening (peak area×106)

酸類化合物主要來源于干酪成熟過程中的脂肪降解、蛋白質(zhì)水解和乳糖發(fā)酵。3組干酪中都存在的酸類化合物包括辛酸、正癸酸和棕櫚酸,且都存在于成熟后期。辛酸與微弱的水果酸、油脂酸敗的氣味有關(guān),僅存在于KH組中的己酸與羊乳氣息、腐臭味、汗氣和油脂味有關(guān)[16],對干酪的風味有不利影響。

酮類化合物多由不飽和脂肪酸氧化、熱降解、氨基酸降解和微生物代謝產(chǎn)生。干酪中酮類化合物的含量較低,但是它們具有較低的感知閾值和典型的氣味,是干酪揮發(fā)性風味化合物的來源之一。在3組干酪的不同成熟期均能檢測到2-壬酮,2-壬酮是3種干酪中含量最高的酮類化合物,與干酪的花香味、水果味、桃子味有關(guān)。在成熟過程中,KY、KH兩組中2-壬酮含量顯著增加(P<0.05),KC組中2-壬酮含量顯著降低(P<0.05)。除此之外,在3組干酪成熟后期還檢測到少量的2-十一烷酮和2-十三烷酮,其中2-十一烷酮與脂肪和黃油的香味有關(guān),2-十三烷酮與蠟香、脂香、乳品和椰子香氣有關(guān),3種酮類物質(zhì)均賦予干酪積極的風味。

酯類化合物主要由酸和醇的酯化反應(yīng)及氨基酸代謝產(chǎn)生。酯類化合物與干酪的花香味、水果味和甜味有關(guān),還可以削弱脂肪酸產(chǎn)生的刺激味和苦味[17],對干酪風味具有重要作用。在3組干酪不同成熟期均檢測到的酯類化合物有乙酸異戊酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯和乙基9-癸烯酸酯,主要以乙酯類為主,乙酯類對干酪香氣影響最大。已有研究報道切達干酪中關(guān)鍵的酯包括己酸乙酯和辛酸乙酯[18]。己酸乙酯與橘子風味有關(guān)[19],對干酪的風味有積極影響。辛酸乙酯可以使干酪散發(fā)出一種令人愉快的、新鮮的、類似丁香的甜味。在成熟過程中,KY、KH兩組中己酸乙酯和辛酸乙酯的含量均顯著增加(P<0.05),而KC組中這兩種物質(zhì)的含量則顯著降低(P<0.05)。在KY、KH兩組中,隨著成熟時間的增加,酯類化合物的含量也顯著增加(P<0.05)。研究表明乙醇可能是一些干酪中酯合成的限制因素[20-21],因此高濃度的乙醇會增加干酪中酯類化合物的含量。這與本研究中具有高濃度乙醇的KY、KH兩組中酯類化合物含量高的結(jié)果是一致的。相似的現(xiàn)象在其他研究中也有報道[10]。

除了種類和含量較多的醇類、酸類、酮類和酯類以外,干酪中還檢測出苯乙烯和苯乙醛。在3組干酪中均檢測出的苯乙烯具有橡膠味,對干酪的風味有消極影響。醛是干酪中不穩(wěn)定的中間化合物,性質(zhì)較為活潑,很容易進一步轉(zhuǎn)化為醇或酯[22],在KC、KY兩組檢測到少量苯乙醛的存在,苯乙醛呈強烈的風信子香氣,在低濃度時與杏仁味、櫻桃味有關(guān),對切達干酪的風味具有很好的修飾作用。

2.2 揮發(fā)性風味化合物聚類分析

圖1為3組干酪成熟過程中揮發(fā)性風味化合物聚類分析熱圖。3組干酪中揮發(fā)性風味化合物的聚類情況在成熟前期和后期具有顯著差異。

Alcohol 1-乙醇；Alcohol 2-異戊醇；Alcohol 3-正辛醇；Alcohol 4-苯乙醇；Acid 1-庚酸；Acid 2-己酸；Acid 3-辛酸；Acid 4-正壬酸；Acid 5-正癸酸；Acid 6-棕櫚酸；Acid 7-硬脂酸；Ketone 1-2-壬酮；Ketone 2-2-十一烷酮；Ketone 3- 2-十三烷酮；Ester 1-乙酸乙酯；Ester 2-甲酸異戊酯；Ester 3-丁酸乙酯；Ester 4-乙酸異戊酯；Ester 5-己酸乙酯；Ester 6-庚酸乙酯；Ester 7-辛酸甲酯；Ester 8-辛酸乙酯；Ester 9-壬酸乙酯；Ester 10-乙基9-癸烯酸酯；Ester 11-辛酸異丁酯；Ester 12-癸酸乙酯；Ester 13-月桂酸異戊酯；Ester 14-辛酸異戊酯；Ester 15-月桂酸乙酯；Ester 16-癸酸異戊酯；Ester 17-十三酸乙酯；Ester 18-十四酸乙酯；Ester 19-十六酸乙酯；Alkene 1-苯乙烯；Aldehyde 1-苯乙醛；KY1、KY30、KY60、KY90：KY組成熟1、30、60、90 d樣品；KH1、KH30、KH60、KH90：KH組成熟1、30、60、90 d樣品；KC1、KC30、KC60、KC90：KC組成熟1、30、60、90 d樣品圖1 干酪成熟過程中揮發(fā)性風味化合物聚類分析熱圖Fig.1 Heat map of cluster analysis of volatile flavor compounds in cheeses during ripening

在成熟前期,KY1(KY組成熟1 d)和KY30可歸為一類；KC1和KC30可歸為一類,二者又可與KH1歸為一類,并進一步與KH30歸為一類,表明成熟前期KY組與KH、KC兩組的揮發(fā)性風味化合物存在顯著差異。在成熟后期,KY60和KY90可歸為一類,二者又可與KH60歸為一類,并進一步與KH90歸為一類；KC60與成熟前期的KC組的揮發(fā)性風味化合物較為相似,而KC90與其他各組差異較大,表明隨著成熟過程的進行,KY組與KH組中揮發(fā)性風味化合物更為接近,KC組與其他兩組差異顯著。對3組干酪成熟過程中揮發(fā)性風味化合物進行聚類分析可知,己酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯和乙酸異戊酯這些含量較高的酯類化合物可與乙醇歸為一類,這與先前的結(jié)果一致,表明乙醇可能是一些干酪中酯合成的限制因素[20-21]。

2.3 感官評價

圖2為3組干酪在成熟1 d和90 d的感官評價雷達圖。成熟1 d時,KY組感官評價總分為82.76,KH組感官評價總分為75.55,KC組感官評價總分為75.64。隨著成熟時間的延長,3組干酪的感官評價總分和各感官指標得分均呈現(xiàn)出下降的趨勢,其中口感評分下降最顯著(P<0.05)。成熟90 d時,KY組感官評價總分為73.51,KH組感官評價總分為67.10,KC組感官評價總分為66.24。

圖2 干酪成熟1 d和90 d的感官評價雷達圖Fig.2 Radar charts of sensory evaluation at day 1 and day 90 of cheeses ripening

干酪的風味形成是一個較為漫長的過程。成熟1 d時,3組干酪滋氣味濃郁,尤其是KC組中酒香味十分突出,這與本研究中KC組具有最高的乙醇含量的結(jié)果是一致的。但KC組由于乙醇含量較高導致酒香味過重,以至掩蓋了干酪特有的乳脂味,因此KC組感官評分低于其他兩組。而KY組由于酒香味與乳脂味較為均衡,因此感官評分最高,與KH組相比差異顯著(P<0.05)。成熟90 d時,3組干酪酒香味均有所下降,而水果味顯著增加。有研究表明,乙醇可以通過酯化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為酯,而過量的酯類物質(zhì)會導致干酪的果味缺陷[20],3組干酪的氣味和滋味評分較成熟1 d時均有所降低。除此之外,隨著干酪成熟時間的增加,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得脆弱,導致3組干酪的口感評分顯著降低。

3 結(jié)論

3組干酪在成熟過程中揮發(fā)性風味化合物的種類均有所增加,KY、KH兩組干酪揮發(fā)性風味化合物的含量顯著增加,尤其是乙醇、己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯。3組干酪揮發(fā)性風味化合物在成熟前期和后期差異顯著,其中KY組干酪在成熟前期感官評分較高,酒香味與乳脂味較為均衡,成熟后期由于酯類化合物過量累積及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得脆弱導致感官評分較低。綜上所述,釀酒酵母能夠促進KY組切達干酪風味的形成,短成熟期內(nèi)具有最佳食用品質(zhì)。