桑嘉玘,辜青青,徐玉娟,劉昊澄,彭健,溫靖*,余元善,田文妮,陳樹鵬

1(江西農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院,江西 南昌,330045) 2(廣東省農(nóng)業(yè)科學院 蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,農(nóng)業(yè)部 功能食品重點實驗室,廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室,廣東 廣州,510610) 3(廣東佳寶集團有限公司,廣東 潮州,515638)

柚子,屬于蕓香科柑橘屬,因其酸甜、涼潤的口感且集藥食為一體的特點深受人們喜愛[1]。隨著柚子產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,產(chǎn)生了大量的加工副產(chǎn)品,其中大部分被當作廢棄物處理。研究發(fā)現(xiàn),柚子中含有幾十種對人體有益的生理活性成分,如果能將廢棄物作為功能原料被綜合利用,既可以減少資源浪費,又可以保護環(huán)境[2]。

近年來,由于膳食纖維具有降低血脂和血糖水平,減少心血管和結直腸癌疾病的功效[3],受到了研究人員、食品行業(yè)和消費者的廣泛關注。膳食纖維根據(jù)溶解性不同,劃分為不溶性膳食纖維(insoluble dietary fiber,IDF)和水溶性膳食纖維(soluble dietary fiber,SDF)[4]。與谷物相比,來自柚子皮的膳食纖維的主要優(yōu)勢在于其含有更多的酚類物質[5]。這對于開發(fā)含纖維產(chǎn)品非常重要,因為功能性膳食纖維更有利于人體吸收。與SDF相比,IDF不僅占據(jù)天然纖維的2/3,還在預防和緩解便秘、糖尿病、結腸癌、肥胖、高血壓等有方面發(fā)揮了重要的作用[6-7]。

研究表明,不同的提取方法會影響IDF的結構、功能和理化活性。蔣緯等[8]認為微波法所提取的野木瓜IDF和SDF能夠較好保持其還原能力和抗氧化能力；王曦璠等[9]認為,堿提取法的香菇膳食纖維平均產(chǎn)率高于酶解法；孟怡璠等[10]認為,堿提取法的南瓜膳食纖維的陽離子交換能力和水合性質更強。物理方法在一定程度上不能完全提取出膳食纖維,堿法在提取的過程中會增加環(huán)境的二次污染[11]。因此,亟待開發(fā)高效、綠色的柚皮海綿層IDF提取工藝。

因此,本文采用超聲法、復酶法、酶堿法和超聲輔助復酶法提取柚皮海綿層中的IDF,比較IDF的表觀結構、理化特性和體外抗氧化能力的差異,以期為柚子皮的精深加工及功能性食品添加劑的研制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

將新鮮柚子去皮,留下海綿層,切成均勻的(3±0.5)cm小塊,經(jīng)鼓風干燥機60 ℃完全干燥后,粉碎過80目篩,存于4 ℃冰箱備用。

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉(均為分析純)、α-淀粉酶(4 000 U/g)、糖化酶(100 000 U/g)、中性蛋白酶(100 000 U/g),上海源葉生物科技有限公司；ABTS法和鐵離子還原能力(ferric reducing ability of plasma,FRAP)法總抗氧化能力檢測試劑盒,南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

Mx5百萬分之一電子天平,Mettler Toledo；UV-1800型紫外分光光度計,日本島津公司；PB-10型pH計,Sartorius公司；Infinite M200 PRO酶標儀,瑞士TECAN公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 膳食纖維提取方法

1.3.1.1 復合酶法工藝流程

柚皮海綿層粉末2 g→加入20倍體積水→調(diào)pH 6.0→1.5%混合酶[m(α-淀粉酶)∶m(糖化酶)=1∶1]70 ℃酶解60 min→滅酶10 min→冷卻→調(diào)pH 7.0→1%中性蛋白酶50 ℃酶解60 min→滅酶→5 000 r/min離心10 min→過濾→濾渣→干燥→IDF。

1.3.1.2 酶堿法工藝流程

柚皮海綿層粉末2 g→加入20倍體積水→調(diào)pH 6.0→0.4%混合酶[m(α-淀粉酶)∶m(糖化酶)=1∶1]→60 ℃酶解50 min→滅酶10 min→冷卻至60 ℃→5% NaoH溶液(NaOH濃度1 mol/L)→60 ℃堿解30 min→5 000 r/min離心10 min→過濾→濾渣→干燥→IDF。

1.3.1.3 超聲法工藝流程

柚皮海綿層粉末2 g→加入20倍體積水→調(diào)pH 6.0→超聲30 min、40 ℃、400 W→5 000 r/min離心10 min→過濾→濾渣→干燥→IDF。

1.3.1.4 超聲輔助復酶法工藝流程

柚皮海綿層粉末2 g→加入20倍體積水→調(diào)pH 6.0→超聲30 min、40 ℃、400 W→1.5%混合酶[m(α-淀粉酶)∶m(糖化酶)=1∶1]70 ℃酶解60 min→滅酶10 min→冷卻→調(diào)pH 7.0→1%中性蛋白酶50 ℃酶解60 min→滅酶→5 000 r/min離心10 min→過濾→濾渣→干燥→IDF。

1.3.2 柚皮海綿層IDF物化性質的測定

1.3.2.1 持水力

參考LI等[12]的研究方法略作修改。將0.5 g樣品與25 mL蒸餾水混合1 h后,于4 000 r/min下離心10 min,除去上清液,稱重沉淀物。持水力計算如公式(1)所示：

(1)

式中：m1,沉淀物減去樣品的質量,g；m,樣品的質量,g。

1.3.2.2 持油力

根據(jù)KUREK等[13]的研究方法略作修改。將0.5 g樣品和25 mL葵花籽油混合1 h后,于5 000 r/min下離心10 min。棄去上清液,稱重殘余物。持油性計算如公式(2)所示：

(2)

式中：m1,樣品濕重,g；m2,樣品干重,g。

1.3.2.3 膨脹性

參考ROBERTSON等[14]的研究方法略作修改。將0.3 g樣品轉入量筒中,記下樣品初始體積。將5 mL的蒸餾水倒入量筒內(nèi),混合24 h,讀取樣品最終的體積。膨脹性計算如公式(3)所示：

(3)

式中：V1,樣品最終的體積,mL；V2,樣品初始的體積,mL；m,樣品的質量,g。

1.3.2.4 陽離子交換能力的測定

參照BENITEZ等[15]的研究方法略作修改。0.5 g樣品和10 mL 0.1 mol/L的HCl溶液混合,放置24 h后過濾,將殘渣與100 mL 15%NaCl溶液混合,用0.1 mol/L的NaOH溶液進行滴定,測定樣品消耗NaOH溶液體積,同時用蒸餾水代替HCl溶液,測定空白樣品消耗NaOH溶液體積。陽離子交換能力計算如公式(4)所示：

(4)

式中：V1,測定樣品消耗NaOH溶液體積,mL；V0,測定空白樣品消耗NaOH溶液體積,mL。

1.3.3 掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM)分析

將微量樣品固定于導電膠帶觀察臺上,用離子濺射的方法進行噴金處理,以5.00 kV的加速電壓于SEM觀察臺上收集并觀察圖像,放大倍數(shù)為800倍。

1.3.4 生物活性化合物溶出的測定

1.3.4.1 總酚、總黃酮的提取

根據(jù)莊遠紅等[16]的研究方法略作修改。取0.5 g樣品,加入10 mL 60%乙醇于室溫下超聲10 min,在4 000 r/min下離心10 min,收集上清液,再加10 mL 60%乙醇重復提取2次,合并上清液并定容至25 mL,于-20 ℃貯存。

1.3.4.2 總黃酮、總酚含量的測定

膳食纖維的黃酮和總酚含量用分光光度儀測定,具體方法見文獻[17-18]。

1.3.5 體外抗氧化性分析

1.3.5.1 ABTS陽離子自由基的清除作用

采用總抗氧化能力檢測試劑盒(ABTS法)測定樣品的自由基清除能力。在室溫條件下取待測樣品溶液10 μL加入20 μL的酶溶液和170 μL ABTS工作液中。室溫孵育6 min后于405 nm處測定吸光度,以蒸餾水作空白對照。

1.3.5.2 FRAP的測定

采用總抗氧化能力檢測試劑盒(FRAP法)測定樣品的FRAP。在室溫條件下取待測樣品溶液5 μL加入180 μL FRAP工作液中。37 ℃孵育5 min后于593 nm處測定吸光度,以蒸餾水作空白對照。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每組實驗做3個平行,計算平均值和標準偏差,數(shù)據(jù)以平均值±SD的形式表示；采用Origin 20.0,SPSS 16.0等軟件對數(shù)據(jù)進行繪圖以及ANOVA差異性分析。

2 結果與分析

2.1 理化性質分析

持水性與膨脹性可以反映膳食纖維水合性質優(yōu)劣的重要指標,其與IDF的表面積、質量分數(shù)和分子間的結構有關[10]。4種不同方法提取的柚皮海綿層IDF的水合性質如圖1所示。在持水性方面,樣品的持水性值為9.85～12.70 g/g,以酶堿法(12.70 g/g)最佳,超聲輔助復酶法(10.64 g/g)和超聲法(10.52 g/g)次之,復酶法(9.85 g/g)最差；膨脹性上,4種提取方法的柚皮海綿層IDF具有顯著性差異(P<0.05)。超聲輔助復酶法>酶堿法>復酶法>超聲法。酶堿法和超聲輔助復酶法提取IDF水合性質較好,可能與堿和超聲對纖維結構的破壞有關?？傊?高持水性和膨脹性的膳食纖維更有利于食物的膨脹,增加人體的飽腹感。

膳食纖維分子表面的活性基團不僅可以吸附人體的油脂,還可以在烘焙中防止脂肪流失。持油性又與水膠體的表面性質和分子間空隙的結合度有關。如圖1所示,超聲輔助復酶法提取IDF持油性含量最高(8.92 g/g),復酶法(5.78 g/g)和酶堿法(4.97 g/g)次之,超聲法(3.24 g/g)最低。

超聲輔助復酶法的IDF持油性和膨脹性都優(yōu)于其他3個樣品,這可能是該方法下IDF的結構更松散。酶堿法提取的IDF持水性高,但是由于強堿在某種程度上破壞了IDF的結構,使其持油性較差。

圖1 不同提取方法的IDF的持水性、持油性、膨脹性Fig.1 The water-holding,oil-holding and expansion of IDF in different extracted methods注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 陽離子交換能力

膳食纖維分子結構中存在氨基、羥基等活性基團。這些基團與Zn2+、Cu2+等離子進行交換時,可以改變?nèi)梭w消化道的pH和滲透壓,降低Na+/K+比值,產(chǎn)生降血壓作用[19]。由圖2可知,4種提取方法下的陽離子交換能力由大到小依次為：酶堿法>超聲輔助復酶法>復酶法>超聲法,其中酶堿法與復酶法、超聲法存在顯著性差異(P<0.05)。酶堿法和超聲輔助復酶法提取的IDF的陽離子交換能力高,其原因可能與蛋白質、淀粉的清除率有關。

2.3 SEM分析

本研究采用SEM研究不同提取方法下的IDF的顯微結構。由圖3可知,4種IDF顆粒表面有皺褶,呈疏松的海綿狀且網(wǎng)眼較大,沒有球形顆粒結構,說明4種IDF產(chǎn)品中不含淀粉等雜質[20]。酶堿法表面孔隙比復酶法多,這可能是因為氫氧化鈉在提取過程中使IDF的微觀結構和粒徑大小發(fā)生改變,導致聚合度下降；復酶法的結構比超聲法更平坦,可能是超聲波的空化作用使膳食纖維的結構完整性被破壞,呈現(xiàn)帶有裂縫的片狀結構[3]。超聲輔助復酶法的孔隙比酶堿法更致密、更規(guī)則,可能是超聲波與酶結合,使IDF的結構更為疏松,提高IDF理化特性,使其發(fā)揮更好的生理功能。復酶法、酶堿法和超聲法均影響了IDF的微觀結構。空間結構較松散的IDF與其持水性和膨脹性等理化指標有相關關系。因此,SEM結果表明,提取方法可能會改變柚皮海綿層膳食纖維樣品的功能特性。

a-超聲法；b-復酶法；c-酶堿法；d-超聲輔助復酶法圖3 不同提取方法下IDF的SEM圖Fig.3 The SEM of IDF under different extraction methods

2.4 柚皮海綿層IDF生物活性物質溶出量

有研究發(fā)現(xiàn),膳食纖維的抗氧化性、降血糖、減肥、減少慢性胃腸道紊亂等功效與其中含有的酚類和黃酮類密切相關。黃酮類和酚類化合物分別是通過自由基和細胞的氧化能力來實現(xiàn)抗氧化作用[21-22]。如圖4所示,4種方法提取的柚皮海綿層IDF黃酮含量為4.04～6.62 mg/g,其中復酶法、酶堿法和超聲輔助復酶法提取的黃酮含量沒有顯著性差異(P>0.05),而超聲法下IDF黃酮含量(4.04 mg/g)最少。4種方法提取柚皮海綿層的IDF總酚含量為2.34～2.80 mg/g,酶堿法和超聲輔助復酶法提取IDF的總酚含量高于復酶法和超聲法提取IDF的總酚含量。由以上結果可知,總酚和總黃酮含量因提取方法的不同而有所差異,酶堿法和超聲輔助復酶法提取的生物活性物質高可能與其有效去除原料中淀粉、蛋白質等物質有關[23]。

圖4 不同提取方法的IDF的總酚和總黃酮含量測定Fig.4 The total phenols and total flavones of IDF in different extraction methods

2.5 不同提取方法對IDF抗氧化活性的影響

本文通過測定FRAP和ABTS陽離子自由基清除能力,分析了4種提取方式下IDF體外抗氧化活性的差異。由圖5可知,4種IDF的FRAP為20.52～29.84 mmol/L,其中酶堿法(29.84 mmo/L)最高,超聲輔助復酶法(24.38 mmo/L)和復酶法(22.57 mmol/L)次之,超聲法(20.52 mmol/L)最低；超聲輔助復酶法的ABTS陽離子自由基清除能力(42.98 mmol/L)顯著高于其他3種提取方法(P<0.05)。2種抗氧化方法所測出4種IDF抗氧化順序存在一定的差異,可能與其自由基和反應離子有關。

雖然2種抗氧化能力所測結果存在差異,但不影響柚皮海綿層IDF抗氧化能力的總體趨勢,即酶堿法和超聲輔助復酶法>復酶法和超聲法。酶堿法和超聲輔助復酶法有較強的抗氧化能力,這可能是因為這2種提取方法下的IDF結構疏松,空隙較大,更有利于提供電子和氫原子,這與之前的研究具有一致性[24]。

圖5 不同提取方法下IDF的FRAP和ABTS 陽離子自由基清除能力Fig.5 The FRAP and ABTS cationic free radical scavenging ability of IDF in different extraction methods

2.6 IDF抗氧化活性與總酚、黃酮之間的相關性

酚類物質是膳食纖維中主要活性成分,是膳食纖維品質及生物學活性評價的主要指標,柚皮抗氧化活性與總酚含量密切相關[25]。結果如表1所示,2種抗氧化能力均與總酚含量呈顯著正相關(P<0.05)；與黃酮呈正相關,相關性不顯著(P>0.05)；且不同提取方法下IDF的抗氧化活性與總酚的含量趨勢相同,即抗氧化能力隨著總酚含量的多少而變化。

表1 抗氧化能力與多酚、黃酮類物質相關性Table 1 Correlation of antioxidant capacity with polyphenols and flavonoids

3 結論

本文對比研究了超聲法、復酶法、酶堿法和超聲輔助復酶法4種提取方法對柚皮海綿層IDF的理化性質、功能和結構的差異。在理化性質方面,超聲波輔助復酶法提取IDF的持油性(8.92 g/g)和膨脹性(16.89 mL/g)含量最高,而酶堿法提取IDF以持水性(12.70 g/g)含量和陽離子交換能力最高。結構上,超聲輔助復酶法提取的IDF表面的空隙更小、更緊密。提取方式不僅影響IDF的結構表征,還會影響其功能特性。酶堿法提取的柚皮海綿層中IDF的總酚含量(2.80 g/g)和FRAP(39.18 mmol/L)最高；超聲輔助復酶法以黃酮含量(6.62 mg/g)和ABTS陽離子自由基清除能力(42.98 mmo/L)最高。因此,超聲輔助復酶法可作為一種綠色的提取膳食纖維的工藝,對功能性膳食纖維的開發(fā)和柚皮產(chǎn)業(yè)的附加值利用提供科學依據(jù)。