陳曉茹,黃鈞,周榮清*,張宿義,董異,王超,王小軍,吳重德,金垚

1(四川大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院,四川 成都,610056) 2(四川省瀘州市瀘州老窖股份有限公司,四川 瀘州,646000)

大曲是中國白酒釀造中重要的發(fā)酵劑和粗酶制劑,其發(fā)酵和貯存是釀酒功能菌群定向及相應(yīng)酶系代謝調(diào)控的關(guān)鍵過程[1]。貯存過程是大曲最復(fù)雜、最關(guān)鍵的環(huán)節(jié),大量的微生物、酶系及揮發(fā)性物質(zhì)在外界條件的脅迫作用下,不斷演替而趨于平衡[2],奠定后續(xù)多邊平衡過程的重要基礎(chǔ)。迄今對大曲成熟的判斷主要通過感官經(jīng)驗(yàn),受人為因素影響較大,故大曲貯存過程中微生物及代謝組分動態(tài)規(guī)律的研究是行業(yè)關(guān)注的重點(diǎn)。如HU等[3]揭示了白云邊高溫大曲140 d周期內(nèi)的微生物變化趨勢,耐熱微生物是優(yōu)勢菌,尤其在高溫期,貯存的溫度相對穩(wěn)定,但微生物群落結(jié)構(gòu)變化顯著;GUAN等[4]解析了濃香型大曲貯存過程中微生物的改變,Weissella、Lactobacillus、Pediococcus、Bacillus和Acetobacter是優(yōu)勢細(xì)菌,而Pichia和Thermoascus是優(yōu)勢真菌,相對人工踩曲,機(jī)械大曲的真菌多樣性略高且更穩(wěn)定;FAN等[5]解析了芝麻香型大曲貯存過程群落變遷規(guī)律,Absidia、Trichocomaceae-norank和Rhizopus是優(yōu)勢菌,經(jīng)貯存,群落結(jié)構(gòu)演變?yōu)楦m合白酒的多邊發(fā)酵,不愉快的風(fēng)味物質(zhì)消失,獨(dú)特風(fēng)味物質(zhì)增多。但迄今對大曲貯存過程中微生物互作關(guān)系和理化性質(zhì)、風(fēng)味物質(zhì)與微生物相關(guān)性的研究鮮見報(bào)道。

本研究探究了2種類型大曲貯存過程中微生物群落結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)及揮發(fā)性代謝組分的變化趨勢。2類大曲分別是傳統(tǒng)機(jī)械大曲(B曲)和基于Bacilluslicheniformis的強(qiáng)化大曲(F曲)。應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)研究了優(yōu)勢種屬互作關(guān)系、微生物與理化指標(biāo)、風(fēng)味物質(zhì)的相關(guān)性,旨在解析B曲和F曲貯存過程中群落和代謝組分變化的異同,科學(xué)確定強(qiáng)化曲貯存周期。

1 材料與方法

1.1 樣品制備和收集

大曲的制備：2類大曲,生產(chǎn)于瀘州老窖股份有限公司大曲生產(chǎn)基地,常溫貯存周期為6個(gè)月。強(qiáng)化大曲,接種分離自太空曲的分離株Bacilluslicheniformis菌懸液,按菌懸液∶小麥=1∶100(mL∶g),使其初始接種濃度達(dá)到8×105CFU/g。傳統(tǒng)大曲(自然制曲)作為對照。

樣品收集：每隔30 d,按照文獻(xiàn)[6]的方法分別從曲堆上、中、下層取樣粉碎,混合均勻,每次取200 g,并送至實(shí)驗(yàn)室保藏(-20和-80 ℃)至檢測。從轉(zhuǎn)房30 d(初始成曲)每隔30 d取樣,強(qiáng)化和傳統(tǒng)大曲樣品分別標(biāo)注為F-30～F-180和B-30～B-180。

1.2 藥品與試劑

辛酸甲酯,北京百靈威化學(xué)試劑有限公司；其他化學(xué)試劑,均為分析純,本地化學(xué)商品試劑供應(yīng)商。

1.3 儀器和設(shè)備

Trace 1300-TSQ9000氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國賽默飛世爾公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭,美國Supelco公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 大曲微生物群落組成檢測

按照Fast DNA SPIN提取試劑盒提得基因組DNA,用1%瓊脂糖凝膠電泳測其純度,取3 μL經(jīng)NanoDrop ND—1000分光光度計(jì)測定A260/A280,檢驗(yàn)是否有RNA和蛋白質(zhì)污染。用338F和806R對細(xì)菌的16S rRNA基因高變區(qū)V3～V4區(qū)域和真菌的ITS5和ITS1區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系：25 μL：5×reaction buffer和5×GC buffer 各5 μL,0.25 μL DNA聚合酶(5 U/μL,Q5 High-Fidelity),2 μL dNTPs(2.5 mmol/L),正反引物各1 μL(10 μmol/L),2 μL DNA模板,8.75 μL ddH2O。細(xì)菌擴(kuò)增程序?yàn)?8 ℃預(yù)熱2 min,98 ℃變性15 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,一共25個(gè)循環(huán),最后72 ℃保持5 min。真菌擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)熱3 min,95 ℃變性30 s,61 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,共32個(gè)循環(huán),最后72 ℃保持10 min。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行目的片段純化回收。純化樣品送派森諾生物科技有限公司在2×300 Illumina MiSeq平臺上測序。

原始序列使用QIIME pipeline進(jìn)行處理,依據(jù)CAPORASO等[7]描述的方法去除一些低質(zhì)量序列。最后使用UCLUST把高質(zhì)量的序列聚成不同的操作性分類單元(operational taxonomic units,OTU)[8]。多樣性是指某個(gè)群落或生境內(nèi)部的物種多樣性,Chao1和Observed species指數(shù)用于反映菌群豐度,Shannon和Simpson指數(shù)用于表征菌群多樣性。

1.4.2 理化性質(zhì)的檢測

水分、酸度、液化力、糖化力、發(fā)酵力和酯化力參照QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》進(jìn)行檢測,每種樣品取3組平行樣進(jìn)行檢測。

1.4.3 揮發(fā)性成分的檢測

樣品的前處理：參考DING等[9]的方法稍作修改。稱取樣品1.00 g于25 mL頂空瓶中,加入10 μL的辛酸甲酯(0.007 9 g/100 mL)作為內(nèi)標(biāo)。置于恒溫?cái)嚢杵髦?00 r/min、(60±1) ℃預(yù)熱平衡15 min,吸附提取50 min。結(jié)束后,將DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭插入GC進(jìn)樣口解吸5 min,檢測揮發(fā)性組分。

GC-MS檢測操作條件：40 ℃保持5 min,以4 ℃/min升至100 ℃,再以6 ℃/min升至230 ℃保持10 min,進(jìn)樣口溫度為270 ℃。離子源溫度為300 ℃,質(zhì)譜掃描范圍為m/z35～400。

檢測質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過與標(biāo)準(zhǔn)譜庫(NIST2017)對照進(jìn)行組分鑒定,對匹配度大于800的物質(zhì)予以分析。采用峰面積歸一化法確定揮發(fā)性組分的相對含量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

冗余分析(redundancy analysis,RDA)：使用Canoco 5.0軟件對優(yōu)勢微生物群落與風(fēng)味組分及理化性質(zhì)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。微生物互作關(guān)系分析：使用IBM SPSS Statistics 19軟件對優(yōu)勢微生物屬(相對豐度>0.5%)采用Spearman算法構(gòu)建共發(fā)生網(wǎng)絡(luò),并使用Cytoscape(v3.6.1)進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果與討論

2.1 貯存過程群落結(jié)構(gòu)變化規(guī)律

由表1所示,貯存過程中B曲和F曲的群落α-多樣性的變化趨勢類似,兩者的細(xì)菌和真菌豐富度都是交替降升,F曲的細(xì)菌群落豐富度和多樣性顯著高于B曲,真菌的則相反。2種類型大曲貯存過程顯著改變了細(xì)菌群落的豐富度和多樣性,尤其是貯存120 d時(shí)細(xì)菌豐富度顯著增大。貯存過程中B曲的真菌多樣性略減,F曲的則略增。

表1 貯存過程不同大曲微生物群落α-多樣性指數(shù)的差異Table 1 Differences in α-diversity indexes among Daqu samples during storage process

2種類型大曲優(yōu)勢細(xì)菌主要是Firmicutes(厚壁菌門)和Actinobacteria(放線菌門),但經(jīng)貯存后屬水平上的差異顯著擴(kuò)大,可能與Bacillus的起始豐度和來源有關(guān),B曲主要來源于環(huán)境及原料[10],而F曲則是接種B.licheniformis使Bacillus豐度增高,改變了群落結(jié)構(gòu)。

細(xì)菌屬水平上共有435個(gè)OTU,其中豐度>0.5%的有9種(圖1-a)。B曲中優(yōu)勢細(xì)菌屬包括魏氏斯菌屬(Weissella)和刺糖多孢菌屬(Saccharopolyspora),Weissella在30 d的相對豐度是38.94%,貯存至120 d則增至54.47%,而在180 d又降至41.89%。Saccharopolyspora相對豐度從30 d(29.87%)到90 d(12.46%)持續(xù)下降,而在180 d增高到22.00%。Kroppenstedtia在30和90 d檢測到的相對豐度分別為10.16%和8.72%,但在其余幾個(gè)跟蹤點(diǎn)豐度<1.00%。F曲經(jīng)貯存后,Bacillus相對豐度從19.96%非單調(diào)增至48.42%,Bacillus能分泌淀粉酶、糖化酶等多種水解酶[11]。Thermoactinomyces非單調(diào)減至9.17%,但始終高于B曲(1.09%～3.30%),該菌屬能分泌多種高溫蛋白酶,且能形成各類風(fēng)味物質(zhì)[12],Staphylococcus在整個(gè)貯存過程中從14.10%減少至1.76%。

a-細(xì)菌；b-真菌圖1 從屬水平分析不同大曲貯存過程的細(xì)菌和真菌組成Fig.1 Bacterial and fungal community at genus level of different Daqu during storage

2種類型大曲中共檢出92個(gè)真菌屬OTU,相對豐度>0.5%的真菌屬共有10種,如圖1-b所示。優(yōu)勢真菌包括Ascomycota(子囊菌門)和Mucoromycota(毛霉門)。貯存后,B曲的優(yōu)勢真菌中,Pichia相對豐度從48.67%降至19.06%,Thermoascus和Thermomyces非單調(diào)遞增至47.58%和16.44%(180 d),Rhizomucor相對豐度從22.78%逐漸降至6.99%,Aspergillus在貯存前期較穩(wěn)定4.01%～4.75%,從90至180 d非單調(diào)增至8.03%。F曲的優(yōu)勢真菌為Thermomyces(71.87%～87.28%)和Thermoascus(6.73%～18.50%),它們均能高效降解碳水化合物[13],與F曲升溫快有關(guān)。此外,2種類型大曲均在60～120 d時(shí)檢出了曾多在高溫大曲中常見的節(jié)擔(dān)菌屬(Wallemia)[14],但相對豐度僅為0.5%～1.5%。隨著貯存時(shí)間的推移,微生物結(jié)構(gòu)逐漸達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài),這也印證了大曲貯存的重要性。

2.2 不同大曲中微生物網(wǎng)絡(luò)關(guān)系分析

如圖2所示,9個(gè)細(xì)菌屬和10個(gè)真菌屬構(gòu)建了90對微生物互作關(guān)系,B曲和F曲分別有48和44對正相關(guān)關(guān)系。B曲豐度較高的Weissella與Rhizomucor、Pichia和Lichtheimia呈負(fù)相關(guān),而與Aspergillus、Rhizopus和Thermomyces呈正相關(guān)。Saccharopolyspora與多數(shù)微生物呈負(fù)相關(guān),另外,Lactobacillus與Pichia、Rhizomucor、Wallemia和Lichtheimia呈正相關(guān),而與Aspergillus和Rhizopus呈負(fù)相關(guān)。F曲的群落互作關(guān)系與B曲差異較大,Weissella與Wallemia和Pichia轉(zhuǎn)為正相關(guān),Lactobacillus僅與Lichtheimia呈較強(qiáng)正相關(guān),Bacillus與多數(shù)真菌屬(Thermomyces、Aspergillus、Pichia和Thermoascus)呈正相關(guān),這可能有利于酯類物質(zhì)的生成[15]。另外,Rhizomucor和Lichtheimia與Wallemia、Lactobacillus和Thermoactinomyces呈正相關(guān),這類絲狀真菌具有較強(qiáng)次級產(chǎn)物代謝能力[16]。Thermoactinomyces在F曲中豐度更高,其能夠分泌水解酶,加速底物降解,且與Rhizopus、Wallemia、Lichtheimia和Hyphopichia呈正相關(guān),這有利于大曲成熟進(jìn)程[17]。2種大曲中Saccharopolyspora與多數(shù)優(yōu)勢種屬呈負(fù)相關(guān)但F曲中強(qiáng)度減弱。綜上,接種B.licheniformis后使微生物互作關(guān)系改變,進(jìn)而使有益的風(fēng)味物質(zhì)積累。

a-傳統(tǒng)大曲；b-強(qiáng)化大曲圖2 傳統(tǒng)大曲和強(qiáng)化大曲在貯存過程中微生物的主要關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Relationship network analysis of microorganisms in traditional and fortified Daqu during storage

2.3 大曲貯存過程中理化性質(zhì)變化

進(jìn)一步分析2種類型大曲貯存過程理化性質(zhì)的變化結(jié)果如表2所示。貯存過程中,2種類型大曲的酸度均非單調(diào)減,且在120 d達(dá)到峰值,B曲和F曲分別為(0.89±0.00)和(0.94±0.01)mmol/10 g,貯存至180 d又分別降至(0.54±0.01)和(0.67±0.02)mmol/10 g,其變化趨勢與貯存過程中乳酸菌類豐度變化規(guī)律是一致的。F曲的發(fā)酵力隨貯存時(shí)間先增后降,且顯著高于B曲,同時(shí)酸度和發(fā)酵力呈反比例關(guān)系,在90～120 d時(shí)發(fā)酵性能最高。F曲糖化力[(654.87±2.39)～(822.96±3.05)U]和液化力[(0.70±0.01)～(1.09±0.00)U]顯著高于B曲[(505.27±1.65)～(737.39±1.65)U和(0.61±0.00)～(0.92±0.00)U],且變化趨勢均先增后降,這可能與F曲有更高豐度的Bacillus有關(guān)[11]。此外,F曲的酯化力始終低于B曲,可能與F曲中Aspergillus豐度更低有關(guān)[18]。

表2 貯存過程不同大曲理化性質(zhì)變化Table 2 Differences in physicochemical properties among Daqu samples during storage

2.4 揮發(fā)性組分的動態(tài)變化規(guī)律

貯存過程中,從大曲樣品中共檢出了89種揮發(fā)性成分。其中F曲檢出74種,而B曲檢出48種,可分為酯、醇、酸、醛、酮、吡嗪、烷烴、酚和其他類(圖3)。B曲中揮發(fā)性組分的含量在(4 888.22±298.83)～(9 804.45±354.37)μg/kg,高于F曲[(2 552.34±364.33)～(6 384.41±840.76)μg/kg]。貯存過程中揮發(fā)性含量變化趨勢均是先增再降后保持穩(wěn)定,B曲貯存60 d后,其總含量達(dá)到峰值,為(6 384.09±84.07)μg/kg,而F曲在90 d才達(dá)到峰值,其含量是(9 804.45±35.44)μg/kg(圖3)。酯類始終是大曲優(yōu)勢組分,醇類在B曲中優(yōu)勢為十六醇(11.18～60.80 μg/kg),而F曲中主要是2,3-丁二醇(24.06～102.80 μg/kg)和苯乙醇(12.07～81.84 μg/kg),其中賦予大曲玫瑰香味的苯乙醇可由真菌代謝產(chǎn)生[19],且被認(rèn)為是小分子信號物質(zhì)參與微生物群落定向進(jìn)化的調(diào)控[20]。另外,F曲中的吡嗪類總含量先增后降[(813.35±33.11)～(1 418.14±75.58)μg/kg],尤其是主要成分四甲基吡嗪高于B曲,該物質(zhì)是中國白酒中的重要香氣化合物[21],也賦予了人體有益健康的功能。

圖3 大曲貯存過程中揮發(fā)性物質(zhì)含量變化Fig.3 Change in flavor components of Daqu during storage

貯存后,F曲中有更多種類的酯類,且均隨貯存過程非單調(diào)增,而B曲中的非單調(diào)減,2種大曲的酸類種類均增加,僅在120 d后的F曲中檢出6,9,12-十八碳三烯酸、3-甲基丁酸和2-甲基-2-戊烯酸。另外F曲中的吡嗪種類隨貯存時(shí)間增加(180 d有8種),僅在后期檢出了2,5-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基-6-乙基吡嗪和2-乙烯基-6-甲基-吡嗪,而B曲中僅在60 d前檢出了2種吡嗪(三甲基吡嗪、四甲基吡嗪),可能是由于接入的B.licheniformis能代謝產(chǎn)生更多且更穩(wěn)定的吡嗪。由此可見,接種B.licheniformis制成的強(qiáng)化大曲,經(jīng)貯存后對揮發(fā)性總含量和種類的形成有積極作用。

2.5 微生物與理化性質(zhì)及揮發(fā)代謝成分的相關(guān)性分析

通過RDA揭示微生物與理化性質(zhì)和揮發(fā)性成分關(guān)系結(jié)果如圖4所示。貯存過程中,B曲中霉菌屬和嗜熱真菌屬降解底物的能力較高,使得酸度與Aspergillus和Thermomyces等呈正相關(guān)(圖4-a),而F曲中Bacillus和Thermomyces的豐度提高,能分泌更多的水解酶類[11],因此強(qiáng)化后酸度和液化力與Bacillus和Thermomyces呈正相關(guān)(圖4-b)。2種類型大曲酯化力均與Pichia、Rhizomucor和Thermoactinomyces呈正相關(guān),不同的是B曲中Bacillus與糖化力和發(fā)酵力呈正相關(guān)而在F曲中為負(fù)相關(guān)。2種大曲中酯類物質(zhì)均與Saccharopolyspora、Pseudonocardiaceae和Pichia呈正相關(guān),與曾報(bào)道Pichia有較強(qiáng)的產(chǎn)酯能力[22]一致。B曲中為主的十六醇與Weissella和Aspergillus密切相關(guān),而F曲中2,3-丁二醇、苯乙醇與Saccharopolyspora、Bacillus和Thermomyces呈正相關(guān)。吡嗪類(三甲基吡嗪、四甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪和2-乙基-3,5-二甲基吡嗪)作為F曲的特征性物質(zhì)與Bacillus、Thermomyces顯著正相關(guān)。Saccharopolyspora在F曲中豐度較低(3.14%～7.11%),但與多數(shù)揮發(fā)性成分呈正相關(guān),這可能與Saccharopolyspora能產(chǎn)生活性成分促進(jìn)揮發(fā)性物質(zhì)形成有關(guān)[23]。總體而言,B.licheniformis強(qiáng)化后改變菌群互作關(guān)系而使理化性質(zhì)發(fā)生改變,同時(shí)對揮發(fā)性組分有正面的影響。

a-B曲；b-F曲圖4 傳統(tǒng)大曲和強(qiáng)化大曲微生物與理化及風(fēng)味的關(guān)聯(lián)性分析Fig.4 Correlation analysis of microorganism and flavor in different Daqu

2.6 應(yīng)用PICRUSt2預(yù)測大曲菌群的功能

基于PICRUSt2預(yù)測2種類型大曲菌群代謝途徑中關(guān)鍵酶的差異如圖5所示。這些關(guān)鍵酶主要涉及糖化、醇代謝和四甲基吡嗪的合成的代謝途徑。B.licheniformis的介入上調(diào)了與碳水化合物代謝有關(guān)的水解酶類活力,包括α-淀粉酶、纖維素酶、磷酸葡萄糖激酶及1,6-葡萄糖苷酶等。這些酶活力的上調(diào)有益淀粉、纖維素等大分子的降解。其降解產(chǎn)物經(jīng)糖酵解途徑(Embden-Meyerhof pathway,EMP)、三羧酸循環(huán)及脂肪酸代謝等途徑被轉(zhuǎn)化為各種風(fēng)味成分。細(xì)菌群落經(jīng)EMP將其碳水化合物水解物轉(zhuǎn)化為醇類的能力強(qiáng)于真菌群落,而苯丙氨酸經(jīng)芳香醇脫氫酶催化產(chǎn)物之一的苯乙醇則受真菌的調(diào)控更強(qiáng)[24]。F曲中乙酰乳酸合成酶和谷氨酰胺酶豐度顯著上調(diào),使得EMP產(chǎn)生的丙酮酸通過乙酰乳酸合成酶的酶促作用形成α-乙酰乳酸,再經(jīng)α-乙酰乳酸脫羧酶催化轉(zhuǎn)化為乙偶姻,隨之與氨基酸的含氮化代謝物合成四甲基吡嗪[25]。因2,3-丁二醇和乙偶姻可在丁二醇脫氫酶催化下相互轉(zhuǎn)化,使得F曲中2,3-丁二醇的含量增高,進(jìn)而調(diào)控乙偶姻和四甲基吡嗪含量[26]。

圖5 熱圖分析大曲代謝途徑關(guān)鍵酶的差異性Fig.5 Difference of key enzymes in Daqu metabolic pathway analyzed by heat map

3 結(jié)論

貯存后,F曲的細(xì)菌群落的豐富度和多樣性與B曲的差異增大。強(qiáng)化后,F曲的Bacillus豐度提高到48.42%(180 d),其優(yōu)勢真菌為Thermoascus和Thermomyces；B曲優(yōu)勢細(xì)菌為Weissella(41.89%),優(yōu)勢真菌是Pichia。接種B.licheniformis使貯存過程中Weissella與Wallemia和Pichia的關(guān)系轉(zhuǎn)為正相關(guān)。同時(shí)顯著提高了水解力和發(fā)酵力,且貯存后提高揮發(fā)性成分含量,尤其是四甲基吡嗪的含量顯著提高。F曲吡嗪類含量增高與其Bacillus和Thermomyces的豐度增高有關(guān)?；赑ICRUSt2預(yù)測佐證了B.licheniformis的介入上調(diào)了與碳水化合物代謝有關(guān)的水解酶類活力,其降解物經(jīng)EMP產(chǎn)生的丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙偶姻,隨之與氨基酸的含氮化代謝物合成四甲基吡嗪的貢獻(xiàn)。