張獻(xiàn),馮治平,2,張耀,張雪怡,楊麗娟,2*

1(四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院,四川 宜賓,644000) 2(釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(四川輕化工大學(xué)),四川 宜賓,644000)

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate,EC),是發(fā)酵食品和酒精飲料在生產(chǎn)、儲(chǔ)藏過程中生成的對(duì)人體具有潛在致癌性和遺傳毒性的一種微量有害物質(zhì)[1-3]。2007年國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)將其歸為2A類致癌物后,EC問題引起世界各國(guó)的關(guān)注[4]。為保障食品安全,消除發(fā)酵食品和酒類中的EC刻不容緩。

目前針對(duì)由尿素產(chǎn)生酒精飲料EC問題,國(guó)內(nèi)外主要涉及以下4個(gè)研究領(lǐng)域：對(duì)發(fā)酵工藝的優(yōu)化[5-6]、物理吸附[7-8]、代謝工程改造酵母[9-10]以及生物酶法(如脲酶[11-13]),其中生物酶法是目前最理想的一種方法[14]。脲酶能夠消除EC前體物質(zhì)尿素,從而從源頭上控制EC的產(chǎn)生[15],而氨基甲酸乙酯水解酶(urethanase,UH)能將已生成的EC降解成乙醇、氨和二氧化碳[16]。最早報(bào)道的UH是KOBASHI等[17]從Citrobactersp.分離得到的,隨后又在Bacilluslicheniformis和B.thiaminolyticus發(fā)現(xiàn)了UH的活性[18-19]。2006年,AKUTSU-SHIGENO等[20]發(fā)現(xiàn)來自RhodococcusequiTB-60的55 kDa蛋白具有UH活性,獲得其基因序列(GenBank:DD320008.1),并實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)。隨后,李京京等[21]從小鼠腸道中篩選出了一株能降解EC的LysinibacillusfusiformisSC02并通過N端測(cè)序獲得了其編碼UH的基因序列(GenBank:KU353448.1),研究發(fā)現(xiàn)該酶為中性酶,且穩(wěn)定性較差。2019年,MASAKI等[22]在Candidaparapsilosis中獲得了該菌編碼的UH基因序列(GenBank:LC511748.1),研究發(fā)現(xiàn)該菌的UH由4個(gè)大小為60 kDa的亞基組成。

本研究通過對(duì)假絲酵母的UH進(jìn)行亞克隆并實(shí)現(xiàn)異源可溶性表達(dá),研究了其酶學(xué)性質(zhì),研究結(jié)果可為后續(xù)的結(jié)構(gòu)解析、分子改造及應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒

假絲酵母(菌株保藏號(hào)：CCTCC AY 2017001),中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；大腸桿菌EscherichiacoliDH5α、大腸桿菌EscherichiacoliBL21 (DE3)、pET-28a,本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10,酵母粉5,NaCl 10,pH 7.2；配制固體培養(yǎng)基需加入20的瓊脂。

1.1.3 主要試劑

DNA及蛋白質(zhì)Markar,北京全式金生物技術(shù)有限公司；酵母基因提取試劑盒,北京索萊寶科技有限公司；DNA膠回收試劑盒,天根生化科技(北京)有限公司；限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ,寶生物工程(大連)有限公司；蛋白胨、NaCl、酵母粉、氨基甲酸乙酯等常規(guī)試劑均為市售分析純。

1.1.4 儀器與設(shè)備

UV-1800分光光度計(jì),翱藝儀器(上海)有限公司；SCIENTZ-Ⅱ D超聲波破碎儀,寧波新芝生物科技股份有限公司；5340R高速冷凍離心機(jī),德國(guó)Eppendorf儀器公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1cpUH基因克隆與pET-28a-cpUH的構(gòu)建

根據(jù)GenBank公布的假絲酵母氨基甲酸乙酯水解酶(LC511748.1)基因序列設(shè)計(jì)特異性引物。

以假絲酵母基因組為模板,PCR擴(kuò)增cpUH基因。PCR程序測(cè)定：94 ℃預(yù)變性3 min,94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,72 ℃延伸10 min,其中變性、退火及延伸循環(huán)30次。純化PCR產(chǎn)物,連接到pET-28a上構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-cpUH,并轉(zhuǎn)化E.coliDH5α,通過雙酶切鑒定重組子,陽性質(zhì)粒送擎科生物公司測(cè)序。

1.2.2 重組cpUH的誘導(dǎo)表達(dá)

將pET-28a-cpUH質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coliBL21 (DE3)中,過夜培養(yǎng)并活化E.coliBL21/pET-28a-cpUH。以2%的接種量,將培養(yǎng)好的E.coliBL21/pET-28a-cpUH種子液接到新鮮LB培養(yǎng)基(含50 μg/mL Kana)。37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)2～3 h,檢測(cè)菌液OD600。在對(duì)數(shù)期(OD600為0.6～0.8)時(shí),加入0.25 mmol/L IPTG,于25 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)8 h。

1.2.3 親和色譜純化cpUH蛋白

在4 ℃、7 000 r/min下收集培養(yǎng)好的重組菌E.coliBL21/pET-28a-cpUH菌液。用20 mmol/L PBS (pH 7.4) 洗滌菌體2 次后,重懸菌體并置于冰浴中進(jìn)行超聲破碎。將破碎后的菌液于4 ℃、7 000 r/min條件下離心30 min,收集上清液(即cpUH粗酶液)。純化前先用鎳柱平衡緩沖液(含250 mmol/L NaCl,5 mmol/L 咪唑的20 mmol/L、pH 7.4的PBS緩沖液)進(jìn)行鎳柱的平衡,然后使用洗脫緩沖液(含有10～250 mmol/L的咪唑)進(jìn)行梯度洗脫,最后使用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)法測(cè)定蛋白濃度。

1.2.4 酶活力測(cè)定方法

1.2.4.1 酶活力測(cè)定步驟

(1)

式中：ΔOD625,測(cè)定反應(yīng)后與空白樣品吸光度之差；n,酶活力測(cè)定液稀釋倍數(shù)；k,標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的倒數(shù)；15,酶作用的時(shí)間,min。

1.2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1.2.5 cpUH的酶學(xué)性質(zhì)

1.2.5.1 酶的最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性

將經(jīng)鎳柱純化得到的酶液與底物EC分別在25、30、35、40、45、50、55、60 ℃的溫度下反應(yīng),以相對(duì)酶活力確定該酶的最適反應(yīng)溫度。將鎳柱純化后的酶液在上述不同溫度條件下保溫8 h,中間每隔2 h測(cè)定1次酶活力,以該酶在各溫度的初始酶活力為100%,計(jì)算該酶的相對(duì)酶活力。

1.2.5.2 酶的最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性

將純化后的酶液與底物EC在不同pH(3、4、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、10)的緩沖液中進(jìn)行反應(yīng),反應(yīng)結(jié)束后測(cè)定cpUH在不同pH條件下的酶活力,確定該酶的最適反應(yīng)pH。將純化后的酶液保存在不同pH(5、6、7、8、9)緩沖液中,在4 ℃冰箱中放置8 h,每隔2 h檢測(cè)1次酶活力,以各pH的初始酶活力為100%,計(jì)算各時(shí)間段所對(duì)應(yīng)的相對(duì)酶活力。

1.2.5.3 酶對(duì)NaCl 和乙醇的耐受性檢測(cè)

配制不同NaCl濃度的緩沖液,將鎳柱純化得到的酶液保存于各緩沖液中,4 ℃保存2 h,測(cè)定相應(yīng)條件下的酶活力。計(jì)算該酶在不同NaCl濃度條件下的酶活力,其中以NaCl濃度為0時(shí)所測(cè)酶活力為100%,確定NaCl濃度對(duì)其酶活力穩(wěn)定性的影響。配制含有不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇緩沖液,將純化得到的酶液保存于各緩沖液中,4 ℃保存4 h,測(cè)定相應(yīng)條件下的酶活力。計(jì)算該酶在不同體積分?jǐn)?shù)乙醇條件下所對(duì)應(yīng)的酶活力,并以乙醇體積分?jǐn)?shù)為0時(shí)所測(cè)酶活力為100%,確定乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)酶活力穩(wěn)定性的影響。

1.2.5.4 金屬離子、EDTA對(duì)酶活力的影響

將純化得到的酶液與終濃度為1 mmol/L 的金屬離子(Fe3+、Mn2+、Zn2+、Ca2+、Co2+、Mg2+、Cu2+)或EDTA的緩沖液混合,4 ℃保存30 min,測(cè)定酶活力。確定金屬離子及EDTA對(duì)酶活力的影響。

1.2.5.5 酶的底物特異性檢測(cè)

在最適溫度和最適pH條件下,將純化得到的酶液分別與質(zhì)量濃度為30 g/L氨基甲酸甲酯、EC、氨基甲酸丁酯、乙酰胺、L-谷氨酰胺、苯甲酰胺反應(yīng),測(cè)定相應(yīng)酶活力,以酶對(duì)EC的酶活力為100%。

1.2.5.6 動(dòng)力學(xué)參數(shù)的確定

測(cè)定cpUH在不同EC濃度體系(5、10、20、80、200、500 mmol/L)中的反應(yīng)速度,根據(jù)底物濃度與反應(yīng)初速度之間的關(guān)系,利用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法確定動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km與Vmax。

2 結(jié)果與分析

2.1 cpUH基因的克隆與表達(dá)

以假絲酵母基因組為模板,PCR擴(kuò)增cpUH基因,約在1 650 bp處出現(xiàn)特異性條帶(圖1-a)。PCR產(chǎn)物連入pET-28a載體,經(jīng)雙酶切釋放約1 650 bp的目的條帶(圖1-b),測(cè)序結(jié)果與GenBank公布序列一致,cpUH開放閱讀框?yàn)? 656 bp,編碼551個(gè)氨基酸殘基,分子質(zhì)量約為61.65 kDa。

a-cpUH PCR產(chǎn)物；b-重組子(pET-28a-cpUH)酶切鑒定圖1 假絲酵母cpUH的基因克隆與酶切鑒定Fig.1 Gene cloning and enzyme digestion identification of C.parapsilosis cpUH

pET-28a-cpUH轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3),經(jīng)0.25 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后,SDS-PAGE電泳檢測(cè),在約60 kDa位置出現(xiàn)目的條帶(圖2)。

Marker-蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)記； 1-含有質(zhì)粒pET-28a的大腸桿菌的超聲上清液； 2-IPTG誘導(dǎo)的攜帶質(zhì)粒pET-28a-cpUH的大腸桿菌粗蛋白； 3-IPTG誘導(dǎo)含有質(zhì)粒pET-28a-cpUH的大腸桿菌超聲上清液圖2 重組cpUH誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of induced expression of recombinant cpUH

2.2 親和色譜分離純化重組cpUH

粗酶液經(jīng)過Ni2+-NTA親和色譜分離純化獲得電泳級(jí)cpUH,SDS-PAGE電泳檢測(cè)(圖3),約為60 kDa。經(jīng)過純化后,酶比活力為3.10 U/mg,純化倍數(shù)約為28.58倍(表1)。

2.3 酶反應(yīng)的最適溫度及其穩(wěn)定性

酶的最適反應(yīng)溫度如圖4-a所示,cpUH在溫度為25～60 ℃內(nèi),隨著溫度的上升,其酶活力呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。溫度為40 ℃時(shí),酶活力達(dá)到最高；溫度>45 ℃時(shí),酶活力急劇下降。

Marker-蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)記； 1-IPTG誘導(dǎo)的攜帶質(zhì)粒pET-28a-cpUH 的大腸桿菌粗蛋白； 2-通過Ni2+-NTA親和層析純化后的蛋白質(zhì)圖3 重組cpUH親和純化的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of affinity purification of recombinant cpUH

表1 Ni-NTA親和色譜純化重組cpUHTable 1 Purification of recombinant cpUH by Ni2+-NTA affinity chromatography

a-最適溫度；b-溫度穩(wěn)定性圖4 反應(yīng)溫度對(duì)cpUH的活力及穩(wěn)定性影響Fig.4 Effect of reaction temperature on activity and stability of cpUH

cpUH在25～30 ℃能保持很好的穩(wěn)定性,如圖4-b所示,8 h后仍有70%以上的酶活力。35 ℃表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性,保溫8 h后仍保留48.08%的酶活力。但當(dāng)溫度>40 ℃后,cpUH的穩(wěn)定性較差,8 h后都失去了活力。

2.4 酶反應(yīng)的最適pH及其穩(wěn)定性

酶的最適反應(yīng)pH值如圖5-a所示。pH 3～4時(shí),酶活力為0；pH 5.0～7.5時(shí),隨著pH的升高,酶活力逐漸升高;pH=7.5時(shí),酶活力達(dá)到最高,相對(duì)酶活力為100%；當(dāng)pH>7.5時(shí),酶活力下降;但pH=8.5時(shí)還保留90%左右的酶活力；當(dāng)pH>8.5后,酶活力急劇下降;pH=10時(shí),只保留了6%的酶活力。

a-最適pH；b-pH穩(wěn)定性圖5 pH對(duì)cpUH的活力及穩(wěn)定性影響Fig.5 Effect of pH on activity and stability of cpUH

酶的pH穩(wěn)定性是酶在實(shí)際應(yīng)用中的一個(gè)重要指標(biāo)。由圖5-b可知,cpUH在pH 6.0～9.0都具有較好的穩(wěn)定性,8 h以后仍能保持70%左右的酶活力,而cpUH在pH 5.0中穩(wěn)定性較差,8 h后降到了0,失去酶活力。

2.5 酶對(duì)NaCl 和乙醇的耐受性

cpUH對(duì)NaCl和乙醇的耐受性分別如圖6所示。該酶的酶活力隨著NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)和乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加,都呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時(shí),酶活力保留了50%左右,而當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%時(shí),該酶的殘余酶活力為未經(jīng)NaCl處理酶活力的10%左右。乙醇的添加也抑制了cpUH的活性,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%時(shí),酶活力保持了60%左右,乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%時(shí),殘余酶活力為50%。該結(jié)果表明,cpUH對(duì)低質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NaCl 和低體積分?jǐn)?shù)乙醇具有一定耐受性,可為在醬油和低酒精度的黃酒中使用提供參考。

a-NaCl耐受性；b-乙醇耐受性圖6 cpUH對(duì)NaCl和乙醇的耐受性Fig.6 Tolerance of cpUH to NaCl and ethanol

2.6 金屬離子與EDTA對(duì)酶活力的影響

各種金屬離子對(duì)cpUH酶活力均有不同程度的抑制,其中Fe3+、Mn2+、Ca2+和Mg2+抑制了15%～20%的酶活力,Co2+抑制了41%的酶活力,而Zn2+、Cu2+嚴(yán)重抑制酶活力,酶活力分別降至原來的11%和0.77%；金屬螯合劑EDTA對(duì)酶活力無顯著影響,如圖7所示。

圖7 金屬離子與EDTA 對(duì)cpUH酶活力的影響Fig.7 Effects of metal ions and EDTA on the activity of cpUH

2.7 酶的底物特異性

為了考察cpUH對(duì)底物的特異性,本研究選擇6種底物進(jìn)行研究,結(jié)果如表2所示,測(cè)定了對(duì)3種氨基甲酸酯的酶活性。該酶對(duì)EC的活性最高,對(duì)氨基甲酸甲酯的活性為90.06%,對(duì)氨基甲酸正丁酯的活性為13.74%。相互比較了對(duì)3種酰胺化合物的酰胺酶活性。該酶對(duì)苯甲酰胺、L-谷氨酰胺和乙酰胺顯示出幾乎相同的活性。

表2 cpUH的底物特異性Table 2 Substrate specificity of cpUH

2.8 酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

以EC為底物,測(cè)定不同底物濃度下該酶的酶促反應(yīng)速率,并做出Lineweaver-Burk圖,結(jié)果如圖8所示。根據(jù)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法得到方程：y=1.796 4x+0.299(R2=0.997 4),計(jì)算得出該UH的Km值為6.01 mmol/L,Vmax為3.34 μmol/min。

圖8 假絲酵母cpUH催化氨基甲酸乙酯的Lineweaver-Burk圖Fig.8 Lineweaver-Burk plots of ethyl carbamate catalyzed by C.parapsilosis cpUH

3 結(jié)論與討論

本研究從假絲酵母中克隆了UH基因,并實(shí)現(xiàn)了其在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)和酶學(xué)性質(zhì)的考察,為后續(xù)的分子改造奠定了基礎(chǔ)。假絲酵母的UH基因大小為1 656 bp,編碼551個(gè)氨基酸；蛋白分子質(zhì)量約為60 kDa。酶學(xué)性質(zhì)研究表明,cpUH酶促反應(yīng)的最適pH和溫度分別為7.5和40 ℃。cpUH在25～30 ℃具有較高的溫度穩(wěn)定性。cpUH在pH 6.0～8.0具有較好的穩(wěn)定性,8 h以后仍能保持70%左右的酶活力。不同的金屬離子對(duì)UH影響不同,終濃度1 mmol/L的Fe3+、Mn2+、Zn2+、Ca2+、Co2+、Mg2+、Cu2+對(duì)cpUH的酶活力無激活作用,而Mn2+、Ca2+可以激活肺炎克雷伯氏菌的UH的酶活力[25],此外,EDTA對(duì)cpUH的酶活性無影響。底物特異性的考察表明,cpUH對(duì)EC的水解活性最強(qiáng),氨基甲酸甲酯、氨基甲酸丁酯的水解活性依次減小,對(duì)乙酰胺、L-谷氨酰胺、苯甲酰胺具有較強(qiáng)的水解作用,而來自于賴氨酸芽孢桿菌的UH,其隨著底物碳鏈長(zhǎng)度的增加,酶活力減小,對(duì)苯甲酰胺和谷氨酰胺沒有降解效果[21]。cpUH對(duì)鹽和乙醇的耐受性研究發(fā)現(xiàn),其具有良好的乙醇耐受性,4 ℃保溫4 h后,在乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%時(shí),其殘余酶活力為50%左右,這可為其在低酒精度的黃酒中使用提供參考。此外,本文還研究了cpUH的酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué),發(fā)現(xiàn)其Km值為6.01 mmol/L,相比較于變幻青霉[26](Km為27.2 mmol/L)及賴氨酸芽孢桿菌[21](Km為37.2 mmol/L)對(duì)EC具有較強(qiáng)的親和力。