孟淑娟,李慧男,龐正軍,慕靜,王鳳寰

(北京工商大學(xué) 輕工科學(xué)技術(shù)學(xué)院,北京,100048)

表面活性肽是模擬天然脂質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)特征自主設(shè)計(jì)的一類具有表面活性的小分子短肽,一般由4～8個(gè)疏水性氨基酸形成的尾部和1～2個(gè)親水性氨基酸形成的頭部構(gòu)成。與其他化學(xué)表面活性劑相比,表面活性肽具有對(duì)環(huán)境無污染、易生物降解、抑菌性強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)性等優(yōu)勢(shì)[1],符合現(xiàn)代綠色工業(yè)發(fā)展理念,在清潔、食品、化妝品、醫(yī)藥等多個(gè)領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用。特別是在食品方面,表面活性肽通過其本身的特性,在食品生產(chǎn)過程中充當(dāng)乳化劑、濕潤(rùn)劑、穩(wěn)定劑等,提高了食品的口感和新鮮度[2]。ANJUM等[3]發(fā)現(xiàn),Bacillussp．MTCC 5877所產(chǎn)的生物表面活性劑能減少生物被膜的形成從而有效洗脫蔬菜表面粘附的有害微生物及殘留的重金屬。

目前表面活性肽的制備方法采用最多的是通過酶解把蛋白質(zhì)水解到一定程度,使水解液中含有一定量的活性肽[2],此類方法主要用于制備天然的生物活性肽。對(duì)于已知氨基酸序列的表面活性肽還可采取定向合成法,包括化學(xué)合成、酶法合成和DNA重組技術(shù)等[4]。MERRIFIELD[5]建立的固相合成法奠定了多肽固相合成的基礎(chǔ),其原理是:將目標(biāo)多肽的C端羧基以共價(jià)鍵形式結(jié)合在高分子樹脂上,氨基酸在此基體內(nèi)合成。以此作為起始端,目的肽所需的氨基酸順序依次進(jìn)行縮合,通過肽鍵連接不斷延長(zhǎng)肽鏈直至合成完成。但化學(xué)合成表面活性肽過程復(fù)雜、成本高、收率低,而生物發(fā)酵的方式對(duì)環(huán)境友好,操作過程無需使用大量有毒試劑,且一旦發(fā)酵流程和條件確定后可重復(fù)性高,能夠?qū)崿F(xiàn)放大生產(chǎn)。因此對(duì)具有應(yīng)用價(jià)值的肽的合成,該方法是極佳的選擇。VAN HELL等[6]設(shè)計(jì)了可以自組裝成囊泡結(jié)構(gòu)的兩親性寡肽Ac-A-A-V-V-L-L-L-W-E2/7 —COOH,保持疏水尾長(zhǎng)度不變,通過改變E的個(gè)數(shù),使親水基部分長(zhǎng)度增加,從而使親水基團(tuán)與疏水基團(tuán)的長(zhǎng)度之比發(fā)生改變,使肽鏈的親水性發(fā)生變化。他們使用大腸細(xì)菌對(duì)肽進(jìn)行重組生產(chǎn),作為固相合成的替代方法,所得產(chǎn)物得率高且生產(chǎn)過程較為簡(jiǎn)單。ZHOU等[7]通過大腸桿菌重組表達(dá)并純化出了由35個(gè)氨基酸殘基組成的抗菌肽CM4,最終得到純度為98%的1.4 mg/L重組抗菌肽CM4,且其抗菌活性與化學(xué)合成的CM4相近。這些研究都表明生物發(fā)酵的方式能夠代替化學(xué)合成成為多肽的新制備方法,因此本研究嘗試通過基因重組和生物發(fā)酵誘導(dǎo)表達(dá)得到表面活性肽。

VON MALTZAHN等[8]首先報(bào)道了兩端封閉型表面活性肽A6K(Ac-AAAAAAK-NH2)在水溶液中的自組裝行為,并且提出其在表面活性劑、生物技術(shù)和納米技術(shù)中均有潛在應(yīng)用。在隨后的研究中,人們發(fā)現(xiàn)A6K可以在水中自組裝形成囊泡,因此在疏水性藥物的包裹和輸送中具有良好的應(yīng)用前景[9-10]。本實(shí)驗(yàn)室前期通過化學(xué)方法設(shè)計(jì)合成了非封閉端表面活性肽——A6K,并對(duì)其進(jìn)行了表面張力、自組裝性能等的研究,發(fā)現(xiàn)其具有較好的應(yīng)用前景[11]。本研究旨在通過生物發(fā)酵方法制備此種表面活性肽,通過將編碼A6K的重復(fù)DNA片段(A6K)15克隆到4種不同的原核表達(dá)載體上,構(gòu)建重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化3種不同的表達(dá)宿主,選擇最優(yōu)載體和最優(yōu)宿主后優(yōu)化表達(dá)條件。經(jīng)純化和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)及Western blot鑒定,最終確定了適合此類表面活性肽表達(dá)的最優(yōu)載體和最優(yōu)宿主,并且通過優(yōu)化表達(dá)條件獲得了表達(dá)量較高的新型小分子多肽聚合物(A6K)15。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒

質(zhì)粒pET-28a(+)、pET-28a-CLCⅠ,實(shí)驗(yàn)室保存；質(zhì)粒pET-28a-SUMO、pT7-GST-His、大腸桿菌(E.coli)克隆宿主DH5α、表達(dá)宿主BL21(DE3)、BL21(DE3) plysS、Rosetta(DE3),北京莊盟國(guó)際生物科技有限公司。

1.1.2 試劑和材料

限制性核酸內(nèi)切酶BamH I、XhoI、T4DNA連接酶,Takara公司；DNA 標(biāo)記物、蛋白質(zhì)標(biāo)記時(shí)物、PCR 主混合物、ExRed核酸電泳染料、10×SDS-PAGE電泳液,北京莊盟國(guó)際生物科技有限公司；提質(zhì)粒試劑盒、膠回收試劑盒,OMEGA Biotek公司；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒,碧云天生物技術(shù)公司；鎳-次氮基三乙酸(nickel-nitrilotriacetic acid,Ni-NTA)Agarose,GE Healthcare；Anti-His Tag、羊抗小鼠IgG-HRP、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)、聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜、電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence,ECL)Plus發(fā)光液,北京索萊寶科技有限公司；0.22 μm濾膜,美國(guó)Merck Millipore；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基用于培養(yǎng)重組大腸桿菌,其配制方法如下(質(zhì)量分?jǐn)?shù))：胰蛋白胨1%,酵母提取物0.5%,NaCl 1%,瓊脂粉1.7%(固體培養(yǎng)基用)；pH調(diào)為7.0。使用時(shí)添加卡那霉素終質(zhì)量濃度至50 mg/mL,氨芐青霉素的終質(zhì)量濃度為100 mg/mL。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 (A6K)15編碼基因的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)目標(biāo)多肽序列(A6K)15設(shè)計(jì)其編碼DNA序列如下所示,在氨基酸序列之前引入6×His標(biāo)簽,在DNA序列首尾添加BamH I和XhoI酶切位點(diǎn),同時(shí),為便于合成,對(duì)丙氨酸A的密碼子進(jìn)行優(yōu)化?；蚝铣晌斜本┤A大基因科技有限公司進(jìn)行。

5′GGATCCCATCATCATCATCATCATAGCAGCGGCCTGGTTCC-TAAAGCAGCGGCAGCAGCGGCAAAAGCAGCGGCAGCGGCA-GCAAAAGCGGCAGCAGCAGCAGCAAAAGCAGCGGCAGCGGC-AGCAAAAGCAGCGGCAGCGGCGGCAAAAGCAGCAGCAGCAG-CAGCGAAAGCAGCAGCGGCAGCAGCGAAAGCAGCAGCAGCG-GCAGCAAAAGCAGCAGCAGCAGCGGCAAAAGCGGCGGCAGC-GGCGGCAAAAGCAGCAGCAGCAGCGGCAAAAGCAGCGG-CGGCAGCGGCAAAAGCAGCAGCAGCAGCGGCAAAAGCAGCAGC-AGCGGCGGCAAAAGCAGCGGCGGCAGCAGCAAAACTCGAG-3′

1.2.2 基因的克隆及重組表達(dá)載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

PCR擴(kuò)增(A6K)15編碼基因反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s,52 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后進(jìn)行切膠回收,得到目的基因(A6K)15。

構(gòu)建酶切體系,將PCR產(chǎn)物與空載體pET-28a(+)、pET-28a-CLCⅠ、pET-28a-SUMO、pT7-GST-His進(jìn)行BamH I和XhoI雙酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后切膠回收,加入T4DNA ligase及緩沖液后配成連接體系,置于金屬浴中16 ℃過夜連接,42 ℃熱激法將連接好的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)克隆宿主E.coliDH5α感受態(tài),在含相應(yīng)抗生素的抗性平板上篩選轉(zhuǎn)化子,挑選陽(yáng)性單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定。培養(yǎng)陽(yáng)性單克隆并提取質(zhì)粒,經(jīng)測(cè)序鑒定正確后,再將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入3種不同的表達(dá)菌株E.coliBL21(DE3)、BL21(DE3) plysS和Rosetta(DE3),菌種保藏至-80 ℃冰箱。

1.2.3 誘導(dǎo)表達(dá)和條件優(yōu)化

將PCR鑒定及測(cè)序正確的菌株4區(qū)劃線接種于LB固體培養(yǎng)基中,37 ℃倒置培養(yǎng)12～16 h,挑取單菌落接種于3 mL LB液體培養(yǎng)基(含相應(yīng)抗性)中,37 ℃,220 r/min 振蕩培養(yǎng)12～16 h。取培養(yǎng)的菌液,按1%的接種量接種于含有100 mL LB培養(yǎng)基(含相應(yīng)抗性)的三角瓶中,37 ℃,220 r/min振蕩培養(yǎng)至合適的OD600(0.4～0.6),用IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá),分別對(duì)IPTG誘導(dǎo)終濃度(0、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mmol/L),誘導(dǎo)溫度(15、23、30、37、40 ℃),誘導(dǎo)時(shí)間(3、5、7、12、24 h)進(jìn)行優(yōu)化,以不含(A6K)15基因的空載體為空白對(duì)照,所有樣品通過15%的SDS-PAGE結(jié)果顯示。

1.2.4 (A6K)15表達(dá)形式的鑒定[6]

按優(yōu)化后的條件,取培養(yǎng)的菌液,按1%轉(zhuǎn)接于200 mL液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD600=0.6,加IPTG至終濃度為1.0 mmol/L,30 ℃誘導(dǎo)12 h。4 ℃收集菌體,取1 mL菌體離心后取沉淀和發(fā)酵上清液分別進(jìn)行SDS-PAGE分析,另取100 mL菌體經(jīng)PBS(20 mmol/L NaH2PO4,20 mmol/L Na2HPO4)洗滌2次后用10 mL PBS重懸,在冰水混合物中用超聲細(xì)胞破碎儀進(jìn)行細(xì)胞破碎(超聲5 s,間隔5 s冰浴超聲20 min),破碎后離心取上清液和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE分析其表達(dá)形式。

1.2.5 (A6K)15可溶性表達(dá)量的提高

除外源蛋白本身的性質(zhì)以外,大腸桿菌的生長(zhǎng)環(huán)境也是影響外源蛋白的可溶性表達(dá)的關(guān)鍵因素之一[12]。在不影響培養(yǎng)基pH和大腸桿菌生長(zhǎng)的前提下,向培養(yǎng)基中加入磷酸鹽緩沖液、微量元素(Zn、Mg等)可以提高目的蛋白的可溶性表達(dá)[12]。因此,向LB培養(yǎng)基中分別加入終濃度為50 mmol/L的K3PO4緩沖液、2.0 mmol/L CaCl2·2H2O,以不加磷酸鹽緩沖液和微量元素的LB培養(yǎng)基為對(duì)照,相同條件下誘導(dǎo)表達(dá)(A6K)15,通過SDS-PAGE分析對(duì)比表達(dá)效果。

1.2.6 (A6K)15的純化

由于(A6K)15中的His標(biāo)簽可與Ni柱中的硫酸鎳結(jié)合,在蛋白上樣后,帶有組氨酸標(biāo)簽的蛋白可以特異性結(jié)合到Ni柱里,其他的雜蛋白流出。因此可采用Ni親和層析柱(Ni-chelating column)對(duì)(A6K)15進(jìn)行純化。按優(yōu)化后的條件擴(kuò)大培養(yǎng)菌體,取45 mL培養(yǎng)的菌液,4 ℃、10 000 r/min離心收集菌體,用pH 7.4的PBS(20 mmol/L NaH2PO4,20 mmol/L Na2HPO4,0.9% NaCl,20 mmol/L咪唑)洗滌2次并重懸菌體,在冰水混合物中進(jìn)行細(xì)胞破碎。將破碎后的細(xì)胞12 000 r/min離心10 min,收集上清液,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾。用10倍柱體積結(jié)合緩沖液(binding buffer)(20 mmol/L pH 7.4 Na3PO4緩沖液,500 mmol/L NaCl,20 mmol/L咪唑)平衡柱子,待基線平衡后再將破碎后的上清液緩慢注入系統(tǒng),用洗脫緩沖液(elution buffer)(20 mmol/L pH 7.4 Na3PO4緩沖液,500 mmol/L NaCl,500 mmol/L咪唑)進(jìn)行梯度洗脫(咪唑濃度分別為100、200、300、400和500 mmol/L)收集目的蛋白,流出液留樣。采用SDS-PAGE分析多肽的純化過程。

1.2.7 Western blot分析

Western blot的基本原理是通過特異性抗體對(duì)SDS-PAGE處理過的蛋白樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)膜著色,再通過分析抗原抗體結(jié)合的位置和信號(hào)強(qiáng)度來獲得目的蛋白在樣品中的表達(dá)情況信息[13-14]。本實(shí)驗(yàn)所獲得的(A6K)15中含有6×His,因此選取對(duì)His特異性的一抗二抗,可檢測(cè)出(A6K)15的表達(dá)情況。取10 μL蛋白洗脫收集液進(jìn)行15% SDS-PAGE,將電泳所得凝膠110 V恒壓冰浴電轉(zhuǎn)至PVDF膜,用含有5%脫脂奶粉的TBST封閉液在脫色搖床上室溫封閉2 h后,向TBST中加入鼠抗MBP一抗(1∶5 000)4 ℃孵育過夜。TBST漂洗3次,每次10 min。再加IgG-HRP標(biāo)記的羊抗小鼠二抗(1∶2 000)37 ℃孵育2 h,TBST漂洗6次,每次5 min,采用ECL化學(xué)發(fā)光法顯影。

1.2.8 BCA法測(cè)定(A6K)15濃度

制備蛋白標(biāo)準(zhǔn)品：取1.2 mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液加入到1管蛋白標(biāo)準(zhǔn)(30 mg牛血清蛋白)中,充分溶解配制成25 mg/mL的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液,取適量此標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL。制備BCA工作液：V(BCA試劑A)∶V(BCA試劑B)=50∶1,充分混勻制成工作液。將標(biāo)準(zhǔn)品按0、1、2、4、8、12、16、20 μL加到96孔板的標(biāo)準(zhǔn)品孔中,加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補(bǔ)足到20 μL,純化后的(A6K)15和稀釋10倍后的全細(xì)胞蛋白各取20 μL到96孔板的樣品孔中,各孔加入200 μL BCA工作液,37 ℃放置30 min。用酶標(biāo)儀測(cè)定A562的吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品體積計(jì)算出(A6K)15濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增(A6K)15基因

以設(shè)計(jì)合成的pET-28a-(A6K)15作為模板,添加特異性引物進(jìn)行PCR,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,在250～500 bp可見單一擴(kuò)增條帶,與理論(A6K)15基因片段堿基對(duì)數(shù)366 bp相符。

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和酶切驗(yàn)證

PCR產(chǎn)物與空載體共同進(jìn)行BamH I和XhoI的雙酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后分別切膠回收,將(A6K)15基因分別與質(zhì)粒用連接酶進(jìn)行連接,構(gòu)建成為重組表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化至克隆宿主E.coliDH5α,擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒,再次用BamH I 和XhoI進(jìn)行雙酶切鑒定,產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證(圖1)顯示,(A6K)15基因已成功克隆到載體上。

M-核酸分子質(zhì)量marker；1-pT7-GST-His-(A6K)15； 2-pET28a-SUMO-(A6K)15；3-pET28a-CLCⅠ-(A6K)15；4-pET28a-(A6K)15圖1 重組質(zhì)粒酶切驗(yàn)證電泳圖Fig.1 Verification of recombinant plasmids by restriction endonuclease digestion

將陽(yáng)性重組質(zhì)粒委托北京華大生物科技有限公司測(cè)序分析,經(jīng)比對(duì),序列正確率為100%。

2.3 誘導(dǎo)表達(dá)及條件優(yōu)化

2.3.1 不同表達(dá)載體和宿主細(xì)胞對(duì)(A6K)15的表達(dá)影響

研究不同宿主細(xì)胞對(duì)(A6K)15的表達(dá)影響,DE3是溶源性的λDE3,所以在lacUV5啟動(dòng)子下攜帶有T7 RNA聚合酶的染色體拷貝。因此以3種不同的宿主細(xì)胞：BL21(DE3)、BL21(DE3)plysS和Rosetta(DE3)為對(duì)象[15],將含有熒光蛋白的重組融合表達(dá)載體pET-28a-CLCⅠ-(A6K)15進(jìn)行轉(zhuǎn)化。誘導(dǎo)表達(dá)后取發(fā)酵液的熒光強(qiáng)度進(jìn)行定性定量分析,通過紫外成像儀初步觀察熒光強(qiáng)度,已知Cerulean熒光蛋白的激發(fā)波長(zhǎng)為433 nm,吸收波長(zhǎng)為475 nm,通過酶標(biāo)儀對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行熒光信號(hào)檢測(cè)。結(jié)合圖2-a熒光強(qiáng)度的初步觀察和表1熒光信號(hào)的定量檢測(cè),結(jié)果顯示,融合蛋白CLCⅠ-(A6K)15在BL21(DE3)中的表達(dá)量較其他2種宿主最高。因此選擇BL21(DE3)作為表達(dá)宿主對(duì)(A6K)15進(jìn)行表達(dá)。將不同的重組表達(dá)載體pET28a-(A6K)15、pET-28a-SUMO-(A6K)15、pT7-GST-His-(A6K)15、pET-28a-CLCⅠ-(A6K)15轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE結(jié)果顯示,載體pET-28a(+)不能表達(dá)(A6K)15,添加融合標(biāo)簽(SUMO、GST、熒光蛋白CLCⅠ)的載體可以與(A6K)15形成融合蛋白,從而促進(jìn)(A6K)15表達(dá)(圖2-b),使用電泳膠條帶定量分析軟件Band Scan 5.0對(duì)各電泳泳道進(jìn)行掃描,得到泳道3中融合蛋白占細(xì)菌總蛋白最高,為46.2%,由此可見,SUMO標(biāo)簽對(duì)促進(jìn)(A6K)15的表達(dá)效果更好,因此選用pET-28a-SUMO-(A6K)15進(jìn)行后續(xù)的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

a-不同菌株熒光強(qiáng)度；b-不同載體融合蛋白表達(dá)差異 a：從左至右依次為Rosetta(DE3)、BL21(DE3)和BL21(DE3) plysS b：M-蛋白分子質(zhì)量marker；1-對(duì)照；2-pET28a-CLC-(A6K)15； 3-pET28a-SUMO-(A6K)15；4-pT7-GST-His-(A6K)15；5-pET28a-(A6K)15圖2 不同宿主細(xì)胞和表達(dá)載體對(duì)融合蛋白(A6K)15的 表達(dá)差異Fig.2 Expression differences of fusion protein (A6K) 15 in different host cells and expression vectors

表1 不同宿主表達(dá)融合蛋白的熒光強(qiáng)度比較Table 1 Fluorescence signal detection of CLC I-(A6K)15 in different hosts

2.3.2 IPTG濃度對(duì)(A6K)15表達(dá)的影響

取培養(yǎng)的菌液,按1%的接種量轉(zhuǎn)接于50 mL液體LB培養(yǎng)基中,于37 ℃擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600=0.6,誘導(dǎo)溫度為37 ℃。加IPTG至終濃度分別為0、0.4、0.6、0.8、1.0和2.0 mmol/L,SDS-PAGE結(jié)果顯示(圖3),未添加IPTG誘導(dǎo)時(shí)未見有(A6K)15表達(dá)條帶,在添加不同濃度IPTG后在40 kDa左右均見有不同程度的(A6K)15表達(dá),不同終濃度IPTG對(duì)(A6K)15的表達(dá)影響不大。使用Band Scan 5.0對(duì)各電泳泳道進(jìn)行掃描,得到泳道5中融合蛋白占細(xì)菌總蛋白最高,為29.8%,因此可得出,終濃度為1.0 mmol/L時(shí)(A6K)15表達(dá)量最高,可見IPTG為誘導(dǎo)表達(dá)的最適濃度為1.0 mmol/L。

M-蛋白分子質(zhì)量marker；1～6-IPTG濃度依次為 0、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mmol/L圖3 IPTG濃度對(duì)SUMO-(A6K)15表達(dá)的影響Fig.3 The expression of SUMO-(A6K)15 in different IPTG concentration

2.3.3 誘導(dǎo)溫度對(duì)(A6K)15表達(dá)的影響

取培養(yǎng)的菌液,按體積1%轉(zhuǎn)接于50 mL培養(yǎng)基中,于37 ℃擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600=0.6,加IPTG終濃度至1.0 mmol/L,分別在15、23、30、37、40 ℃條件下誘導(dǎo)。使用Band Scan 5.0對(duì)各電泳泳道進(jìn)行掃描,可知30 ℃時(shí)目標(biāo)蛋白占細(xì)菌總蛋白最高,為27.6%(圖4),高溫和低溫都不利于(A6K)15的表達(dá)。

M-蛋白分子質(zhì)量marker；1-空白對(duì)照；2～6-誘導(dǎo)溫度 依次為15、23、30、37、40 ℃圖4 誘導(dǎo)溫度對(duì)SUMO-(A6K)15表達(dá)的影響Fig.4 The expression of SUMO-(A6K)15 at different inducing temperature

2.3.4 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)(A6K)15表達(dá)的影響

取培養(yǎng)的菌液,按體積1%轉(zhuǎn)接于50 mL培養(yǎng)基中,于37 ℃擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600=0.6,添加IPTG至終濃度1.0 mmol/L,誘導(dǎo)溫度為30 ℃,分別誘導(dǎo)3、5、7、12、24 h。在誘導(dǎo)前期,表達(dá)量隨誘導(dǎo)時(shí)間增加而上升,12 h后趨于穩(wěn)定(圖5),使用電泳膠條帶定量分析軟件Band Scan 5.0對(duì)各電泳泳道進(jìn)行掃描,可知誘導(dǎo)12 h時(shí)目標(biāo)蛋白(A6K)15表達(dá)量最大,占細(xì)菌總蛋白的32.6%。

M-蛋白分子質(zhì)量marker；1～5-誘導(dǎo)時(shí)間依次為 3、5、7、12、24 h；6-空白對(duì)照?qǐng)D5 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)SUMO-(A6K)15表達(dá)的影響Fig.5 The expression of SUMO-(A6K)15 at different inducing time

2.4 (A6K)15表達(dá)形式的定位

取經(jīng)超聲破碎前后的菌體離心后的上清液和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析,如圖6所示,誘導(dǎo)后的全細(xì)胞蛋白中有明顯的(A6K)15表達(dá),發(fā)酵液上清液則沒有特異性表達(dá)帶,說明目的多肽(A6K)15為胞內(nèi)表達(dá)。此外,對(duì)菌體進(jìn)行超聲細(xì)胞破碎后,在沉淀中可見明顯的特異性條帶,上清液中有微量(A6K)15表達(dá),經(jīng)Band Scan 5.0掃描分析后發(fā)現(xiàn)沉淀中(A6K)15含量(52.1%)顯著高于上清液(20.5%),說明其主要以包涵體的形式表達(dá)。

M-蛋白分子質(zhì)量marker；1-誘導(dǎo)后菌體沉淀；2-菌體離心后上清液； 3-菌體超聲破碎后沉淀；4-菌體超聲破碎上清液；5-空白對(duì)照?qǐng)D6 表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞中的定位Fig.6 Cell location ofSUMO-(A6K)15

2.5 (A6K)15可溶性表達(dá)量的提高

按照1.2.5所述方法對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化,向LB培養(yǎng)基中加入終濃度為50 mmol/L的K2HPO4·3H2O、2.0 mmol/L CaCl2·2H2O,以未優(yōu)化培養(yǎng)基為對(duì)照組,相同的培養(yǎng)條件誘導(dǎo)表達(dá)(A6K)15,誘導(dǎo)后的發(fā)酵液經(jīng)超聲破碎后取上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析。如圖7所示,經(jīng)Band Scan 5.0灰度掃描分析結(jié)果顯示,培養(yǎng)基中分別添加K2HPO4·3H2O和CaCl2·2H2O后表達(dá)(A6K)15分別占菌體總蛋白的46.3%和65.4%,與對(duì)照組的36.8%相比,表達(dá)量有所提高。因此可證明,向培養(yǎng)基中添加適量的磷酸鹽緩沖液和微量元素可以一定程度提高(A6K)15的可溶性表達(dá),且添加微量元素Ca2+后表達(dá)量提高較多且雜蛋白較少。

M-蛋白分子質(zhì)量marker；1-空白對(duì)照；2-LB液體培養(yǎng)基； 3-LB添加K2HPO4·3H2O；4-LB添加CaCl2·2H2O圖7 培養(yǎng)基組份對(duì)SUMO-(A6K)15表達(dá)的影響Fig.7 The effect of medium component on the expression of SUMO-(A6K)15

2.6 (A6K)15的純化

按1.2.6所述方法對(duì)(A6K)15進(jìn)行Ni柱親和層析純化。在咪唑濃度為300和500 mmol/L時(shí)有洗脫峰出現(xiàn),收集出峰處的洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE分析,如圖8所示,經(jīng)Band Scan 5.0掃描分析結(jié)果顯示,純化前目標(biāo)多肽占菌體總蛋白的37.2%,咪唑濃度為300 mmol/L時(shí)洗脫得到的目標(biāo)多肽占菌體總蛋白的42.5%,咪唑濃度為500 mmol/L時(shí)目標(biāo)多肽占菌體總蛋白的83.4%,因此認(rèn)為咪唑濃度為500 mmol/L時(shí)洗脫得到的(A6K)15純度較高。

M-蛋白分子質(zhì)量marker；1-空白對(duì)照；2-純化前樣品； 3～4-咪唑濃度分別為300和500 mmol/L的洗脫液圖8 (A6K)15純化前后的SDS-PAGE結(jié)果Fig.8 SDS-PAGE result of (A6K)15 with purification

2.7 Western blot鑒定

純化后的(A6K)15經(jīng)1.2.7所述的Western blot分析,結(jié)果如圖9所示,經(jīng)Ni柱純化后的(A6K)15具有單一的條帶,說明純化后的(A6K)15中的6×His標(biāo)簽?zāi)軌蚺c羊抗小鼠的多克隆抗體特異性結(jié)合,具有良好的抗原性,與預(yù)期結(jié)果一致。

1～3-Western blot 3次平行試驗(yàn)圖9 (A6K)15的Western blot鑒定Fig.9 Western blot identification of (A6K)15

2.8 (A6K)15濃度的測(cè)定

將純化后的蛋白通過凝膠柱脫鹽除去咪唑之后,根據(jù)1.2.8方法用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定(A6K)15的濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=1.392 5x+0.042,R2=0.999 8,取可溶性表達(dá)的(A6K)15蛋白溶液進(jìn)行吸光度測(cè)定,代入標(biāo)曲計(jì)算得可溶性(A6K)15的質(zhì)量濃度為0.63 mg/mL。取稀釋后的全細(xì)胞蛋白溶液進(jìn)行吸光度測(cè)定,計(jì)算可得蛋白濃度為5.97 mg/mL,由圖6可知,(A6K)15形成的包涵體蛋白占全細(xì)胞蛋白的52.1%,由此可以計(jì)算出以包涵體形式表達(dá)的(A6K)15質(zhì)量濃度高達(dá)3.11 mg/mL。因此可推算,大腸桿菌高密度發(fā)酵可生產(chǎn)重組蛋白(A6K)15的收率為3.7 g/L,所需試劑及耗材價(jià)格約為700元/mg,但化學(xué)合成多肽的價(jià)格則達(dá)1 000元/mg。因此,與化學(xué)合成方法相比較,生物法合成更能節(jié)約成本,且當(dāng)發(fā)酵技術(shù)進(jìn)一步成熟和產(chǎn)量達(dá)到一定規(guī)模后,若需要大規(guī)模生產(chǎn),相比于化學(xué)合成法生產(chǎn)成本可望進(jìn)一步降低。

3 結(jié)論

原核表達(dá)系統(tǒng)具有操作方便、快捷,耗時(shí)短,表達(dá)量大,適合工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn),是蛋白表達(dá)和生物合成最常用的方法[16]。其中,大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)發(fā)展最為迅速、成熟,因?yàn)槠渚哂胁僮鞣奖恪⑦z傳背景明確、表達(dá)量高且試驗(yàn)成本低等優(yōu)點(diǎn),成為目前研究較為深入并最常用的表達(dá)系統(tǒng)之一[17-18]。因此本研究選用大腸桿菌作為宿主菌表達(dá)新型小分子短肽。但使用大腸桿菌表達(dá)外源蛋白質(zhì)時(shí),雖然表達(dá)量大但可溶性較低,目的蛋白常以包涵體形式存在[19],故本研究試圖通過豐富培養(yǎng)基配方提高目的蛋白可溶性表達(dá)。

本研究選用了4種原核表達(dá)載體pET-28a(+)、pET-28a-CLCⅠ、pET-28a-SUMO、pT7-GST-His插入目的基因,將構(gòu)建好的重組表達(dá)載體進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)后發(fā)現(xiàn),不帶有融合標(biāo)簽的pET-28a(+)無法表達(dá)(A6K)15,帶有融合標(biāo)簽的載體均可不同程度地與(A6K)15形成融合蛋白,從而促使目標(biāo)多肽進(jìn)行表達(dá)。其中SUMO標(biāo)簽對(duì)(A6K)15的表達(dá)具有最為顯著的促進(jìn)效果,SUMO作為一種新型的融合載體,它能提高目的蛋白的折疊程度和溶解度[20-21]。并且SUMO蛋白酶能夠特異性識(shí)別SUMO的三級(jí)結(jié)構(gòu),這樣就能夠避免對(duì)目的多肽的切割,這對(duì)于后續(xù)分離純化時(shí)保持目標(biāo)多肽的活性至關(guān)重要[22-23]。因此,以SUMO為融合標(biāo)簽形成融合蛋白的方式表達(dá),不僅可避免(A6K)15對(duì)宿主的殺傷作用,也保護(hù)了(A6K)15免受蛋白酶的降解。綜合以上原因,選擇pET-28a-SUMO作為最優(yōu)表達(dá)載體。與此同時(shí),通過熒光蛋白與(A6K)15結(jié)合后在不同表達(dá)宿主上進(jìn)行熒光信號(hào)檢測(cè),得到其最優(yōu)表達(dá)宿主為BL21(DE3)。在此基礎(chǔ)上,利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)對(duì)(A6K)15進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),為探索此新型小分子短肽的最優(yōu)表達(dá)條件,進(jìn)一步通過設(shè)置不同終濃度IPTG以及不同誘導(dǎo)溫度和時(shí)間誘導(dǎo)(A6K)15,篩選出(A6K)15在E.coliBL21(DE3)中表達(dá)量最高的條件是：添加終濃度為1.0 mmol/L的IPTG、30 ℃條件下誘導(dǎo)12 h。此外,本研究還在傳統(tǒng)液體LB培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加微量元素和磷酸鹽緩沖液,在一定程度上有效提高了(A6K)15的可溶性表達(dá)。

本研究雖然解決了新型表面活性肽(A6K)15在大腸桿菌中異源表達(dá)的關(guān)鍵問題,但對(duì)此類表面活性肽的研究還只是一個(gè)開始。雖然對(duì)提高(A6K)15的可溶性表達(dá)進(jìn)行了初步探索,但是SDS-PAGE結(jié)果顯示,(A6K)15在表達(dá)時(shí)仍主要以包涵體形式存在,因此未來需要解決(A6K)15在表達(dá)中出現(xiàn)的包涵體問題,以提高表達(dá)量、濃度和純度。用SUMO蛋白酶特異性切割去除SUMO標(biāo)簽,繼而用胰蛋白酶對(duì)(A6K)15重復(fù)序列進(jìn)行切割以獲得單一氨基酸序列的小肽A6K,旨在獲得純度較高的具有利用價(jià)值的表面活性肽,并且與化學(xué)合成相比進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本,為生物發(fā)酵法合成表面活性肽提供成熟的研究思路和技術(shù)路線。