王園園，呂小紅

0 引言

微小核糖核酸（microRNAs,miRNAs）是一種短的內(nèi)源性非編碼RNA，通過介導翻譯抑制或mRNA降解來調(diào)控基因表達[1]。以miRNAs作為標志物在癌癥研究和治療中發(fā)揮重要的作用，關于癌癥miRNAs標志物挖掘的研究工作也為癌癥治療提供了寶貴的資源[2]。胃癌是常見惡性腫瘤之一，其臨床治療方法需不斷突破，臨床療效也有待提高[3]。由于缺少合適的生物標志物，大多數(shù)胃癌患者被診斷時已為晚期。miRNAs可以作為胃癌診斷和預后的潛在生物標志物[4]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-218-5p在胃癌組織和細胞中表達下調(diào)，且與腫瘤預后有關，具有成為胃癌新治療靶點和預后標志物的潛在價值[5]。miR-218-5p在胃癌發(fā)生發(fā)展過程發(fā)揮重要的抑制作用，但具體作用機制尚未完全闡明，因此，探究miR-218在胃癌中的靶基因及其機制，對于胃癌的治療研究具有重大意義。酪氨酰-DNA磷酸二酯酶1（tyrosyl DNA phosphodiesterase 1,TDP1）是細胞核和線粒體DNA損傷修復的關鍵因子，在癌癥中呈高表達水平，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮驅(qū)動作用[6-8]。根據(jù)預測結(jié)果，miR-218-5p與TDP1存在靶向調(diào)控關系，因此，推測miR-218-5p可能通過靶向TDP1調(diào)控胃癌細胞線粒體DNA損傷修復過程，進而影響胃癌的發(fā)展，故本文對此進行驗證，旨在了解miR-218-5p在胃癌中的作用機制，以期為胃癌有效治療新策略的研發(fā)提供思路。

1 材料與方法

1.1 細胞系、主要試劑及儀器

人正常胃黏膜上皮細胞GES-1由中國科學院上海細胞生物學研究所提供；胃癌細胞系SGC-7901、HGC-27、MGC-803和BGC-823均購自美國ATCC細胞庫。主要試劑：miR-218-5p模擬物（mimic）和其陰性對照（negative control,NC）由上海吉瑪基因生物科技有限公司設計合成；DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司；胎牛血清、魚藤酮購自美國Sigma公司；TRIzol、Lipofectamine 2000TM購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司；SYBR Green PCR試劑盒購自美國KAPA Biosystems公司；AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；細胞質(zhì)和線粒體蛋白質(zhì)提取試劑盒購自上海生工生物工程有限公司；PVDF膜、化學發(fā)光試劑購自美國Millipore公司；兔抗TDP1、Bax、Bcl-2、Cyt-c多克隆抗體均購自英國Abcam公司。主要儀器：倒置顯微鏡購自德國Leica公司；實時熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司；流式細胞儀購自艾森生物（杭州）有限公司；全自動化學發(fā)光分析儀購自上海天能科技有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

從液氮罐中取出凍存的GES-1、SGC-7901、HGC-27、MGC-803和BGC-823細胞，復蘇后接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待80%細胞貼壁生長時，進行傳代處理。

1.3 RT-PCR檢測miR-218-5p和TDP1表達水平

收集對數(shù)生長期細胞，TRIzol試劑盒提取各細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR反應，反應條件：95℃變性10 s，60℃退火25 s，72℃延伸30 s，共39個循環(huán)。引物序列如下：miR-218-5p-F：5’-ATGTAGCGTGC GACCGTGGAC-3’，miR-218-5p-R：5’-CAGGCTGACGCACTCTGTGCT-3’；TDP1-F：5’-TCTTCCAGTTCTTAGCCTCCTCTGC-3’，TDP1-R：5’-TGGCCTGGATCTCACTCTGGAGGC-3’；U6-F：5’-GGCCTCTCGAACTTGCGTGTC-3’，U6-R：5’-CCATCGGAAGCTCGTATACGA-3’；GAPDH-F：5’-CCACTCCTCCACCTTTG-3’，GAPDH-R：5’-CACCACCCTGTTGCTGT-3’。采用2-△△Ct法對數(shù)據(jù)進行定量分析。

1.4 雙熒光素酶報告基因驗證miR-218-5p與TDP1的靶向關系

根據(jù)網(wǎng)站TargetScan（www.targetscan.org）預測結(jié)果，miR-218-5p與TDP1之間存在靶向關系，進一步采用熒光素酶報告基因驗證該關系，具體實驗過程如下：根據(jù)網(wǎng)站預測miR-218-5p與TDP1的結(jié)合片段，進行PCR擴增，并插入至熒光素酶載體中，構建TDP1野生質(zhì)粒。采用基因突變技術將結(jié)合片段進行突變處理，構建TDP1突變質(zhì)粒。將miR-218-5p-mimic、miR-218-5p-NC和野生質(zhì)?；蛲蛔冑|(zhì)粒使用Lipofectamine 2000TM混合后，共轉(zhuǎn)染至篩選的胃癌細胞中。轉(zhuǎn)染48 h后，檢測熒光素酶活性。

1.5 構建TDP1過表達載體

根據(jù)TDP1基因序列設計合成含GFP的TDP1過表達慢病毒載體（Lv-TDP1）和陰性對照空載體（Lv-NC），由上海吉凱基因化學技術有限公司完成，病毒滴度為1×108TU/ml。

1.6 細胞損傷模型構建及分組

采用含有終濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 μmol/L魚藤酮的培養(yǎng)基培養(yǎng)胃癌細胞24 h，并對細胞活力進行檢測，篩選出魚藤酮誘導胃癌細胞損傷的最佳干預濃度為1.0 μmol/L。將消化處理后的細胞分為對照組、損傷組、miR-218-5p-NC組、miR-218-5p-mimic組、Lv-NC組、Lv-TDP1組和miR-218-5p-mimic+Lv-TDP1組，除對照組不作處理外，其他組細胞均采用1 μmol/L魚藤酮誘導細胞損傷，干預24 h后進行后續(xù)檢測。

1.7 流式細胞術檢測細胞周期

消化處理各組細胞，制備單細胞懸液，收集至流式細胞術檢測專用管中。1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入300 μl含10%胎牛血清的PBS溶液重懸細胞沉淀，再加入700 μl無水乙醇，-20℃固定24 h。3 000 r/min離心30 s，棄上清液，1 ml PBS洗滌2次。加入400 μl PI（50 μg/ml）避光染核10 min，流式細胞儀檢測細胞周期占比。

1.8 流式細胞術檢測細胞凋亡

PBS洗滌貼壁細胞，消化處理后收集至離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，PBS重懸。取1×105個重懸細胞，1 000 r/min離心5 min，1 ml PBS懸浮細胞。1 000 r/min離心5 min，加入200 μl Binding buffer重懸細胞，分別加入10 μl Annexin V-FITC和PI，混勻后避光孵育30 min。加入300 μl Binding buffer，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.9 Western blot檢測蛋白表達

提取細胞質(zhì)或線粒體蛋白，定量后，以20 μg蛋白上樣量經(jīng)SDS-PAGE電泳。濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h。加入一抗稀釋液（TDP1、Bcl-2稀釋比1:2 000，Bax、Cyt-c稀釋比1:1 000），室溫孵育1 h，PBS清洗3次，加入經(jīng)辣根過氧化酶標記的二抗，室溫孵育1 h，PBS清洗3次。滴加化學發(fā)光試劑顯影，凝膠成像系統(tǒng)拍照，采用TANON GIS讀取條帶灰度值。

1.10 統(tǒng)計學方法

采用SPSS19.0軟件進行分析，細胞中miR-218-5p和TDP1 mRNA表達水平、雙熒光素酶活性、周期及凋亡占比、TDP1、Bcl-2和Bax蛋白表達水平均以（x±s）表示，符合正態(tài)分布，兩獨立樣本間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.01表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌細胞中miR-218-5p與TDP1表達相關性

結(jié)果顯示，miR-218-5p在胃癌細胞中的表達水平低于正常細胞（F=25.806,P=0.000），而TDP1表達水平卻顯著高于正常細胞（F=55.251,P=0.0 0 0），兩者呈負相關（R2=0.9 5 8,P=0.0212），見圖1。本研究選擇在四種胃癌細胞中miR-218-5p表達水平最高。TDP1表達水平低的SGC-7901細胞作為后續(xù)實驗的細胞材料。

圖1 miR-218-5p與TDP1在胃癌細胞中的表達及相關性Figure 1 Expression of miR-218-5p and TDP1 in gastric cancer cells and their correlation

2.2 miR-218-5p與TDP1靶向關系驗證

雙熒光素酶報告基因驗證結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染miR-218-5p-mimic和TDP1野生質(zhì)粒的細胞中熒光素酶活性顯著降低（t=6.612,P=0.003），見圖2。

圖2 miR-218-5p與TDP1的靶向關系Figure 2 Targeting relationship between microRNA-218-5p and TDP1

2.3 miR-218-5p及TDP1對SGC-7901細胞周期的影響

流式細胞術檢測結(jié)果顯示，相較于對照組，損傷組G1期細胞數(shù)量增多（t=5.795,P=0.004）；與損傷組相比，Lv-TDP1過表達組G1期細胞數(shù)量減少（t=3.405,P=0.027），而miR-218-5pmimic +Lv-TDP1組G1期細胞數(shù)量增多（t=5.577,P=0.005），miR-218-5p-mimic組進一步增多（t=14.201,P=0.000），見圖3。

圖3 miR-218-5p及TDP1對SGC-7901細胞周期的影響Figure 3 Effects of microRNA-218-5p and TDP1 on cell cycle of SGC-7901 cells

2.4 miR-218-5p及TDP1對SGC-7901細胞凋亡的影響

細胞凋亡檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，損傷組、miR-218-5p-NC和Lv-NC組細胞凋亡率升高（F=21.133,P=0.000）；與損傷組比較，Lv-TDP1組凋亡率降低（t=2.911,P=0.044），而miR-218-5p-mimic+Lv-TDP1組凋亡率升高（t=3.013,P=0.039），miR-218-5p-mimic組凋亡率進一步升高（t=5.371,P=0.006），見圖4。

圖4 miR-218-5p及TDP1對SGC-7901細胞凋亡的影響Figure 4 Effects of microRNA-218-5p and TDP1 on apoptotic rate of SGC-7901 cells

2.5 miR-218-5p對SGC-7901細胞線粒體TDP1及細胞中Bax和Cyt-c蛋白表達的影響

Western blot結(jié)果顯示，與對照組比較，損傷組線粒體TDP1蛋白水平顯著升高（t=11.416,P=0.000），細胞中Bax與Cyt-c蛋白表達水平也顯著升高（t=7.339,P=0.002;t=6.987,P=0.002）；與損傷組比較，Lv-TDP1組線粒體TDP1水平顯著升高（t=4.734,P=0.009），Bax及Cyt-c蛋白表達水平顯著降低（t=4.775,P=0.009;t=3.363,P=0.028），而miR-218-5p-mimic+Lv-TDP1組和miR-218-5pmimic組與Lv-TDP1組趨勢相反，線粒體TDP1水平顯著降低（F=208.357,P=0.000），Bax及Cyt-c蛋白表達顯著升高（F=29.328,P=0.001;F=29.109,P=0.001），見圖5。

圖5 miR-218-5p及TDP1對SGC-7901細胞線粒體TDP1及細胞中Bax和Cyt-c蛋白表達的影響Figure 5 Effects of microRNA-218-5p and TDP1 on expression of TDP1 in mitochondria and Bax and Cyt-c proteins in SGC-7901 cells

3 討論

胃癌是一種高發(fā)病率和高死亡率的腫瘤，傳統(tǒng)的化療和生物制劑的預后均較差[9]。我國近二十年的胃癌發(fā)病率和死亡率雖然呈現(xiàn)出下降趨勢[10]，但疾病負擔仍然十分沉重，嚴重危害著我國居民的健康，仍是我國癌癥防治的重點。miR-218-5p在多種腫瘤中發(fā)揮抑制因子作用，影響腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移[11-12]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-218在胃癌組織中低表達，其表達水平降低與胃癌患者的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及預后不良有關，而且miR-218可抑制胃癌細胞的增殖，抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[13]。Kim等[14]研究結(jié)果也顯示，miR-218在胃癌細胞及組織中異常表達，可能是一種新的胃癌治療靶點。miR-218-5p在胃癌中作為治療靶點的潛力也已被初步探討[5]，Lin等[15]研究結(jié)果顯示miR-218-5p模擬物可抑制胃癌細胞的轉(zhuǎn)移。在本實驗結(jié)果中，miR-218-5p在四種胃癌細胞中均呈現(xiàn)低表達，結(jié)合上述文獻的研究結(jié)果，提示miR-218-5p與胃癌之間存在密切關系。

本研究中，miR-218-5p和TDP1在四種胃癌細胞中的表達呈負相關，雙熒光素酶報告基因亦驗證兩者間存在靶向關系。拓撲異構酶1（Top1）在基因復制和轉(zhuǎn)錄過程中調(diào)節(jié)DNA拓撲狀態(tài)，當Top1無法從DNA鏈上解離時可導致DNA斷裂，而TDP1可修復由Top1介導的染色體斷裂，從而修復細胞核及線粒體中的DNA損傷[7,16]。TDP1是一種細胞核和線粒體蛋白，研究發(fā)現(xiàn)，當細胞發(fā)生氧化應激（過氧化氫或魚藤酮誘導）損傷時，TDP1易位轉(zhuǎn)移至線粒體中，維持線粒體DNA的完整性，支持線粒體功能[17]。線粒體基因不穩(wěn)定在胃癌的發(fā)生中起著重要作用，參與其發(fā)病機制，可通過兩種途徑引起細胞癌變：一是引起核基因組的不穩(wěn)定；二是線粒體氧化壓力的增加導致線粒體酶表達異常和凋亡途徑的激活影響細胞的生物學特征，使其發(fā)生惡變[18]。Bax存在于線粒體外，當其接收到凋亡信號時易位至線粒體，改變線粒體膜電位及其通透性，促進線粒體中Cyt-c的釋放，從而激活下游級聯(lián)反應，誘導線粒體內(nèi)源性凋亡途徑[19]。本次研究采用魚藤酮誘導胃癌細胞SGC-7901發(fā)生氧化損傷，當miR-218-5p表達升高時，細胞G1期阻滯加劇，細胞凋亡水平升高，且細胞中Bax和Cyt-c表達上調(diào)，而線粒體中TDP1表達降低；當TDP1表達升高時，緩解細胞G1期阻滯，凋亡率降低，線粒體中TDP1水平升高，而Bax和Cyt-c表達下調(diào)，因此，推測miR-218-5p可能通過抑制線粒體TDP1水平，促使細胞線粒體功能受損，從而觸發(fā)細胞線粒體內(nèi)源性凋亡途徑。

綜上所述，本研究顯示過表達miR-218-5p或抑制TDP1表達可促進魚藤酮誘導胃癌細胞SGC-7901發(fā)生凋亡，其作用機制可能與miR-218-5p靶向抑制TDP1介導的線粒體DNA損傷修復及功能維持、激活線粒體內(nèi)源性凋亡途徑相關。