韓冰，商靜敏，申永靜，李賢偉，趙麗靜

(邯鄲市婦幼保健院 小兒呼吸科，河北 邯鄲 056001)

毛細支氣管炎是嬰幼兒最常見的急性下呼吸道感染，其臨床表現(xiàn)從有輕度下呼吸道癥狀到下呼吸道阻塞引起的嚴重呼吸窘迫等[1- 3]?？咕氖且环N陽離子肽，構(gòu)成先天免疫系統(tǒng)的基本元素，其在呼吸道中的作用尤為重要。其中人類β- 防御素(hBDs)和人組織蛋白酶抑制素抗菌肽18(human cathelicidin anti- microbial peptide 18，hCAP- 18)是呼吸道先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的關(guān)鍵因素。hCAP- 18可被切割成唯一有生物活性的N端含有雙亮氨酸的37個氨基酸殘基的小分子肽(37 amino acid residues with dileucine at the N- terminus，LL- 37)[4]，近期的研究[4- 6]支持了其在新的抗病毒策略中的治療潛力。此外有實驗室研究表明，維生素D在感染時可上調(diào)抗菌肽LL- 37的表達，通過調(diào)節(jié)細胞因子的產(chǎn)生抑制炎癥，進而減輕病毒性下呼吸道感染的嚴重程度[7]。然而目前尚缺乏相關(guān)研究，本研究旨在分析LL- 37及hBD2的黏膜生成與毛細支氣管炎患兒血清維生素D水平、急性期病情嚴重程度及反復(fù)喘息之間的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象

本研究為前瞻性隊列研究，于2017年2月至2020年4月在我院小兒呼吸科進行。研究方案在啟動前獲得了醫(yī)院倫理委員會的批準，所有參與本研究兒童的父母均知情同意。共納入101例毛細支氣管炎患兒，男55例(占54.46%)，年齡0.8～15.9歲。納入標準：(1) 年齡≤16歲；(2) 首次因患毛細支氣管炎住院治療；(3) 毛細支氣管炎被定義為以咳嗽、呼吸急促和胸部收縮為特征的第一次喘息發(fā)作，經(jīng)體格檢查及胸部X線檢查符合《諸福棠實用兒科學(第七版)》[8]中毛細支氣管炎的診斷標準。排除標準：(1) 母親妊娠期短于34周的早產(chǎn)兒，有既往喘息史、慢性肺病、先天性心臟病、神經(jīng)發(fā)育障礙、免疫缺陷和免疫抑制、過敏性鼻炎、支氣管內(nèi)存在異物、寄生蟲感染；(2) 預(yù)防性使用帕利珠單抗；(3) 合并嚴重肝、腎器官功能障礙。

1.2 基線數(shù)據(jù)和樣本采集

收集患兒的年齡、性別、體重、身高、體溫、脈搏、既往呼吸道感染史、癥狀、病毒學檢測結(jié)果、抗生素使用史、住院治療時間，以及實驗室檢查結(jié)果[白細胞計數(shù)(WBC)、糖化血紅蛋白(HbA1c)水平、中性粒細胞計數(shù)(NEUT)、單核細胞計數(shù)(MONO)、淋巴細胞計數(shù)(LY)、血小板計數(shù)(PLT)、降鈣素原(PCT)水平]。在初次接觸、未進行醫(yī)療干預(yù)之前，所有患兒完成抽血和鼻咽拭子檢查。血液樣本均在采血后1 h內(nèi)3 000 r·min-1離心10 min。鼻分泌物采用真空輔助吸引法收集，無化學刺激，避免異物進入鼻液。輕柔地操作鼻道內(nèi)裝有窄橡膠頭的真空裝置，輕度刺激鼻腔分泌物，標本采集后立即用抑肽酶(0.6 TIU·ml-1)處理，以阻止蛋白水解酶的作用。樣本均于-20 ℃下冷凍保存，待進一步分析。

1.3 樣本檢測

使用Abbott ARCHITECT化學發(fā)光微粒免疫分析法測定25- 羥維生素D[25(OH)D]水平。另外采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(美國Phoenix Pharmaceutical公司)定量檢測hBD2及LL- 37水平。所有ELISA檢測包括用于構(gòu)建分析物水平評估標準曲線的內(nèi)標準品檢測都重復(fù)進行。

1.4 急性期疾病嚴重程度

患兒臨床病情的嚴重程度在每個住院日使用改良Wang氏毛細支氣管炎嚴重程度評分(簡稱改良Wang評分，該評分用血氧飽和度替換患者的一般狀況；0～4.9分為輕度，5～8.9分為中度，9～12分為重度)及住院治療時間[9]進行判定。

1.5 隨訪評估

患兒出院后，每6個月進行1次門診或電話隨訪，記錄患兒喘息發(fā)生情況，至隨訪截止時喘息發(fā)作≥3次的患兒納入反復(fù)喘息組，<3次者納入非反復(fù)喘息組(2次發(fā)作時間間隔≥1周)，隨訪期限為2年。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 鼻分泌物抗菌肽水平與患兒臨床病理特征的相關(guān)性

患兒鼻分泌物LL- 37和hBD2水平分別為17.63(11.67，33.30)ng·mg-1和93.39(75.92，107.29)ng·mg-1。根據(jù)鼻分泌物LL- 37水平17.63 ng·mg-1和hBD2水平93.39 ng·mg-1的中位值，將患兒分別納入低水平組和高水平組。經(jīng)分析，LL- 37低水平組患兒脈搏>100 次·min-1及呼吸道合胞病毒(RSV)感染例數(shù)顯著高于高水平組患兒(P<0.05，表1),但hBD2低水平組和高水平組患兒的臨床病理特征差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 毛細支氣管炎患兒鼻分泌物抗菌肽水平與臨床病理特征的相關(guān)性 例

2.2 患兒鼻分泌物抗菌肽水平、血清25(OH)D水平與急性期疾病嚴重程度的相關(guān)性

經(jīng)Spearman秩相關(guān)分析，患兒血清25(OH)D水平與住院時間(r=-0.145，P=0.148)、改良Wang評分得分(r=-0.201，P=0.052)、鼻分泌物hBD2水平(r=0.087，P=0.388)均無關(guān)，但與鼻分泌物LL- 37水平(r=0.257，P=0.009)呈正相關(guān)。鼻分泌物LL- 37水平與住院時間(r=-0.343，P<0.001)、改良Wang評分得分(r=-0.495，P<0.001)呈負相關(guān)，鼻分泌物hBDs水平與住院時間(r=-0.072，P=476)、改良Wang評分得分(r=-0.032，P=754)無相關(guān)性。進一步校正年齡、性別、臨床表現(xiàn)等因素后，經(jīng)多元線性回歸分析，鼻分泌物LL- 37水平仍是改良Wang評分得分的獨立影響因素(β=-0.062，95%CI為-0.090～-0.033，P<0.001)。

2.3 單因素和多因素Logistic回歸分析影響毛細支氣管炎患兒反復(fù)喘息的臨床因素

本研究共有17例毛細支氣管炎患兒在隨訪期間發(fā)生反復(fù)喘息。經(jīng)單因素和多因素Logistic回歸分析，脈搏及鼻分泌物LL- 37水平都是患兒發(fā)生反復(fù)喘息的獨立影響因素(P<0.001，表2)。

表2 單因素和多因素Logistic回歸分析毛細支氣管炎患兒反復(fù)喘息的影響因素

2.4 鼻分泌物抗菌肽水平對毛細支氣管炎患兒反復(fù)喘息的預(yù)測價值

經(jīng)ROC曲線分析，鼻分泌物LL- 37和hBD2水平預(yù)測毛細支氣管炎患兒反復(fù)喘息的AUC分別為0.773(95%CI為0.669～0.876)和0.555(95%CI為0.410～0.699)，見圖1。

3 討 論

毛細支氣管炎是一種自限性的急性呼吸系統(tǒng)疾病，但部分患兒會出現(xiàn)反復(fù)喘息[10- 11]。有研究證實，維生素D可以降低病毒感染的風險，它通過調(diào)節(jié)緊密連接、黏附連接及縫隙連接蛋白的產(chǎn)生來改善身體的物理屏障，這些蛋白可被微生物(包括病毒)感染所干擾[12- 13]。維生素D可刺激抗菌肽的產(chǎn)生，抗菌肽對各種微生物都有一定的生物活性。例如大多數(shù)病毒產(chǎn)生的雙鏈RNA可增加1α- 羥化酶的表達，導(dǎo)致活性維生素D的產(chǎn)生和抗菌肽在人氣管支氣管上皮細胞中的表達增加。因此，充足的維生素D可能通過增強物理屏障和增加肺上皮抗菌肽的產(chǎn)生來阻止病毒的入侵，而抗菌肽LL- 37及hBDs已被證實與病毒性呼吸系統(tǒng)疾病相關(guān)[14]。然而在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，毛細支氣管炎患兒的血清25(OH)D僅與鼻分泌物LL- 37水平有相關(guān)性，而與hBDs無相關(guān)性，此外急性毛細支氣管炎患兒鼻腔分泌物中抗菌肽LL- 37水平與住院時間、RSV感染以及Wang評分得分呈顯著負相關(guān)。說明抗菌肽LL- 37可能參與了急性毛細支氣管炎的病情進展。

LL- 37是最具抗病毒活性的抗菌肽，該肽主要存在于中性粒細胞特異性顆粒中，但也可由其他類型的細胞(包括上皮細胞、巨噬細胞和淋巴細胞)產(chǎn)生和分泌。LL- 37可直接作用于一系列呼吸道病原體，包括流感病毒、結(jié)核分枝桿菌、銅綠假單胞菌和RSV[15- 16]。在本研究中，感染RSV的患兒鼻分泌物LL- 37水平更低。LL- 37在多種疾病(如克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、尿路感染、銀屑病等感染性疾病，卵巢癌、肺癌等癌癥，心血管疾病等[17])中均發(fā)揮重要作用。王璐等[18]指出，哮喘患兒血清LL- 37水平顯著升高，提示其參與支氣管哮喘的發(fā)生。此外，LL- 37可通過破壞RSV包膜的完整性并阻止細胞結(jié)合來抑制RSV復(fù)制，進而發(fā)揮抗病毒活性[19]。本研究中毛細支氣管炎患兒鼻分泌物LL- 37水平與急性期疾病嚴重程度呈負相關(guān)，而且調(diào)整多種客觀的混雜因素后亦是如此。經(jīng)分析，鼻分泌物LL- 37水平還對患兒反復(fù)喘息的發(fā)生有良好的預(yù)測效能，這與Papadaki等[9]的研究結(jié)論相符。此外鼻腔分泌物似乎比血清更能反映肺部狀態(tài)，因此我們的研究結(jié)果可能具有潛在的重要意義。

本研究首次將低水平鼻分泌物抗菌肽與毛細支氣管炎嚴重程度及RSV感染聯(lián)系起來，然而尚不清楚LL- 37水平與疾病嚴重程度之間的因果關(guān)系，因此在將來需要進一步研究LL- 37作為需要重癥監(jiān)護的毛細支氣管炎患兒潛在治療靶點的可靠性。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，較低的鼻分泌物LL- 37水平與毛細支氣管炎急性期疾病嚴重程度(較高的Wang氏評分得分和較長的住院時間)及慢性發(fā)病率(反復(fù)喘息)顯著相關(guān)，提示檢測鼻分泌物LL- 37水平可以預(yù)測兒童急性毛細支氣管炎的疾病進展。我們的觀察結(jié)果將有助于進一步研究抗菌肽在毛細支氣管炎及其遠期后遺癥的病理生理學中的作用。盡管毛細支氣管炎的病理學機制很復(fù)雜，但維生素D和抗菌肽之間的關(guān)聯(lián)為治療提供了一個潛在的方向，抗菌肽LL- 37有可能是一個有吸引力的治療靶標，為預(yù)防和治療毛細支氣管炎及其慢性疾病提供新途徑。