賈洪響，張楊，張莉莉，甘楚文，杜孟鴿，何馳華

(1. 荊州市中心醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)科，湖北 荊州 434020； 2. 長江大學(xué) 醫(yī)學(xué)部，湖北 荊州 434020)

不孕不育正成為當(dāng)今社會關(guān)注的一個重要問題，近10年來中國男性精液質(zhì)量隨著時間變化呈持續(xù)下降的趨勢[1]。對臨床上出現(xiàn)的越來越多的少弱畸精癥患者，可通過卵胞漿內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)將配子培養(yǎng)成胚胎后進(jìn)行胚胎移植助孕；而對梗阻性無精癥患者及射精障礙患者，因輸精管梗阻其精液中未見精子或無法取到精子，可通過睪丸穿刺取精(testicular sperm aspiration，TESA)獲取活動精子，再經(jīng)ICSI助孕。本研究對行TESA聯(lián)合ICSI助孕的132例患者(共136周期)的臨床資料進(jìn)行回顧性分析，探究TESA- ICSI周期臨床結(jié)局的影響因素，旨在為患者選擇助孕方案和預(yù)測臨床結(jié)局提供一定的參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料來源

收集2017年1月至2021年12月間在荊州市中心醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科行TESA聯(lián)合ICSI助孕的132例患者(共136個周期)的臨床資料，其中梗阻性無精癥122周期、射精障礙14周期，設(shè)為TESA組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1) 因男方患有梗阻性無精癥或射精障礙于取卵日行TESA獲取活動精子；(2) 取卵當(dāng)日女方取到成熟卵子并行ICSI助孕。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1) 女方患有子宮畸形、子宮內(nèi)膜異位癥、子宮肌瘤、輸卵管積水等病變；(2) 雙方染色體核型異常；(3) 女方有嚴(yán)重內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病；(4) 女方年齡>40歲。另選取同時期因男方因素取精液中精子行ICSI助孕，排除標(biāo)準(zhǔn)同TESA組，共納入498例患者(共517周期)為精液組。通過對比，觀察睪丸精子對TESA- ICSI周期臨床結(jié)局的影響，然后將TESA組患者根據(jù)臨床結(jié)局分為妊娠組(88例)和未妊娠組(48例)，采用單因素分析和多因素Logistic回歸分析探究TESA- ICSI周期臨床結(jié)局的影響因素。本研究未涉及倫理問題，患者行TESA及ICSI前均已簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 控制性促排卵及卵母細(xì)胞收集 采用荊州市中心醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科常規(guī)促排卵方案進(jìn)行控制性促排卵，當(dāng)女方優(yōu)勢卵泡直徑≥18 mm時，注射人絨毛膜促性腺激素(hCG)扳機(jī)，注射后36 h在陰道B超引導(dǎo)下穿刺取卵，體式顯微鏡下收集卵冠丘復(fù)合物(OCCCs)，轉(zhuǎn)入受精培養(yǎng)液置于37 ℃、含6%CO2、飽和濕度的桌面培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 睪丸穿刺取精 男方經(jīng)睪丸穿刺手術(shù)取得睪丸組織，并用1 ml注射器針頭將睪丸組織充分撕碎，使曲細(xì)精管中的精子盡可能釋放到培養(yǎng)液中，將收集的精液或組織懸液用梯度離心法洗滌，處理后獲得的沉淀用預(yù)平衡的受精培養(yǎng)液(COOK，美國)洗滌后制成精子懸液備用。

1.2.3 授精及胚胎培養(yǎng) 取卵后2 h 用80 U·L-1的透明質(zhì)酸酶(SAGE，美國)脫掉OCCCs四周包裹的卵丘細(xì)胞，用于行ICSI。操作結(jié)束后將卵子轉(zhuǎn)入平衡好的卵裂培養(yǎng)液(COOK，美國)微滴中，置于37 ℃、含6%CO2、飽和濕度的桌面培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.4 胚胎評分及妊娠判定 ICSI后16～18 h 觀察受精情況，卵母細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)雙原核(2PN)為正常受精。卵裂期胚胎評分根據(jù)Peter評分標(biāo)準(zhǔn)、囊胚根據(jù)Gardner評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分。胚胎移植后5周B超檢查孕囊，可見孕囊者判定為臨床妊娠。

1.2.5 觀察指標(biāo) 記錄患者雙方年齡、不孕年限、孕產(chǎn)史、促性腺激素(Gn)用量、子宮內(nèi)膜厚度、促排卵方案、獲卵數(shù)、可利用胚胎數(shù)、移植方案等基本資料，統(tǒng)計受精率、正常受精率、正常卵裂率、可利用胚胎率和累積臨床妊娠率[2]等數(shù)據(jù)，各指標(biāo)計算公式參照胚胎實驗室關(guān)鍵指標(biāo)質(zhì)控專家共識。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 TESA組和精液組患者夫婦一般資料比較

TESA組和精液組患者夫婦年齡、不孕年限、Gn總量及子宮內(nèi)膜厚度間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，見表1。

表1 TESA組和精液組患者夫婦一般資料比較

2.2 TESA組和精液組胚胎發(fā)育和臨床結(jié)局比較

TESA組的受精率和正常受精率均顯著低于精液組(均P<0.05)，而第二次減數(shù)分裂中期(metaphase Ⅱ)卵母細(xì)胞率(簡稱MⅡ卵率)、正常卵裂率、可利用胚胎率及累積臨床妊娠率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，見表2。

表2 TESA組和精液組胚胎發(fā)育及臨床結(jié)局比較

2.3 TESA- ICSI周期臨床結(jié)局的單因素分析

將TESA- ICSI周期按照臨床結(jié)局不同分為妊娠組和未妊娠組。兩組在女方年齡、男方年齡、不孕年限、獲卵數(shù)、可利用胚胎數(shù)和基礎(chǔ)黃體生成素(LH)方面差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；而在Gn總量、子宮內(nèi)膜厚度、雙方體質(zhì)指數(shù)(BMI)，基礎(chǔ)促卵泡素(FSH)、基礎(chǔ)泌乳素(PRL)、基礎(chǔ)雌二醇(E2)、基礎(chǔ)孕酮(P)、基礎(chǔ)睪酮(T)、抗苗勒氏管素(AMH)、hCG日LH、hCG日E2、hCG日P水平，孕產(chǎn)史、促排卵方案、移植方案方面差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表3。

表3 TESA- ICSI周期臨床結(jié)局的單因素分析

2.4 TESA- ICSI周期臨床結(jié)局影響因素的多因素Logistic回歸分析

將TESA- ICSI周期臨床結(jié)局單因素分析篩選出的具有統(tǒng)計學(xué)意義的因素納入多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，男方年齡及獲卵數(shù)與TESA- ICSI周期臨床結(jié)局存在顯著關(guān)聯(lián)(P<0.05)，見表4。

表4 TESA- ICSI周期臨床結(jié)局影響因素的多因素Logistic回歸分析

3 討 論

TESA聯(lián)合ICSI助孕在臨床上應(yīng)用已有近30年，Lewin等[3]于1996年報道了經(jīng)皮睪丸抽吸取精行ICSI并獲得妊娠。但與精液來源的精子相比，TESA來源的精子對患者臨床結(jié)局的影響還存在爭議。以往有研究[4]認(rèn)為，睪丸精子成熟度較低，會造成受精率、臨床妊娠率的下降，但近年來有越來越多的研究[5-7]顯示，不同來源精子行ICSI助孕能獲得相似的妊娠結(jié)局，且未明顯增加嬰兒出生性別差異及子代出生缺陷。還有研究[8- 9]認(rèn)為，在隱匿精子癥和高精子DNA碎片指數(shù)患者中應(yīng)用睪丸精子可以改善臨床結(jié)局。本研究發(fā)現(xiàn)，TESA組患者雖然在受精率和正常受精率方面低于精液組，但是兩組在可利用胚胎率和累積臨床妊娠率方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義，我們認(rèn)為睪丸精子成熟度較低、活力差和優(yōu)質(zhì)精子數(shù)量不足是造成TESA組受精率和正常受精率低于精液組的主要原因，但精子在睪丸中已完成了減數(shù)分裂，成為已攜帶父源遺傳物質(zhì)的單倍體，其中優(yōu)質(zhì)精子與卵子受精成功后形成的胚胎具有正常的發(fā)育潛能。

本研究將TESA- ICSI組的患者按照移植后是否妊娠分為妊娠組和未妊娠組，對兩組患者的各項指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計，分析TESA- ICSI周期臨床結(jié)局的影響因素。單因素分析結(jié)果顯示：男女雙方年齡、不孕年限、基礎(chǔ)LH水平、獲卵數(shù)及可利用胚胎數(shù)與臨床結(jié)局存在顯著關(guān)聯(lián)；而男女雙方BMI、女方孕產(chǎn)史，AMH、基礎(chǔ)FSH、PRL、E2、P、T水平及hCG日LH、E2、P水平，促排卵方案、Gn用量、移植方案等與臨床結(jié)局無顯著關(guān)聯(lián)。在單因素分析基礎(chǔ)上進(jìn)行多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，男方年齡和女方獲卵數(shù)是TESA- ICSI周期臨床結(jié)局的影響因素(P<0.05)。

在以往的報道中，男方年齡對TESA- ICSI周期臨床結(jié)局影響的研究較少，而男方年齡對精子質(zhì)量的影響是多方面的，因而該因素對ICSI助孕臨床結(jié)局的影響還存在爭議。男方年齡的增大會對精液參數(shù)產(chǎn)生不利影響[10- 11]，包括精液濃度的下降和精子碎片率的升高。Kawai等[12]證明了自噬和胚胎生長重要基因的表達(dá)與父親年齡呈負(fù)相關(guān)，這可能與表達(dá)遺傳修飾有關(guān)。Kaarouch等[13]的一項研究發(fā)現(xiàn)，在IVF周期中，隨著男性年齡的增大，受精率、卵裂率、囊胚形成率、妊娠率和流產(chǎn)率等指標(biāo)都出現(xiàn)了惡化。但在一項針對36歲以下婦女供卵ICSI周期的研究中，Beguería等[14]發(fā)現(xiàn)，不同男性年齡段的臨床結(jié)局沒有差異。也有文獻(xiàn)報道，男方年齡對ICSI周期患者臨床結(jié)局沒有影響[15]，原因可能是在ICSI過程中可以選擇質(zhì)量較好的精子進(jìn)行授精，從而避免精液質(zhì)量下降帶來的不利影響。本研究的結(jié)果顯示男方年齡與TESA- ICSI周期臨床結(jié)局有顯著關(guān)聯(lián)，分析原因可能是由于TESA來源的精子本身存活率極低，可用于ICSI注射的精子很少，隨著年齡的增長，即使是人工挑選出的精子質(zhì)量也在持續(xù)下降，從而影響胚胎發(fā)育潛能和妊娠能力，導(dǎo)致累積臨床妊娠率下降。

本研究結(jié)果顯示，女方獲卵數(shù)也是TESA- ICSI周期臨床結(jié)局的影響因素，這也與目前的多數(shù)觀點相符合。謝妍等[16]發(fā)現(xiàn)，女性年齡和獲卵數(shù)對PESA- ICSI治療周期的妊娠結(jié)局有明顯影響。在IVF周期中，獲卵數(shù)與累積活產(chǎn)率之間存在顯著的相關(guān)性，可作為預(yù)測累積活產(chǎn)率的指標(biāo)之一[17]。陳鑫等[18]報道了PGT- M/PGT- SR助孕周期中，累積活產(chǎn)率隨著獲卵數(shù)、可活檢囊胚數(shù)和可移植囊胚數(shù)的增加而逐漸上升；當(dāng)每周期獲卵數(shù)≥10個時，患者的累積活產(chǎn)率趨于平穩(wěn)，不再增加。獲卵數(shù)通常與女性卵巢功能和年齡相關(guān)聯(lián)，隨著年齡的增大，卵巢功能逐漸下降，導(dǎo)致獲卵數(shù)減少，而獲卵數(shù)過少又會造成可利用胚胎數(shù)的不足，從而影響臨床結(jié)局，但是過多的卵母細(xì)胞數(shù)往往伴隨著過高的雌激素和卵巢過度刺激，因此適宜的獲卵數(shù)能夠使臨床結(jié)局獲益最大[19]。在TESA- ICSI周期中，由于受精率和卵裂率等的下降會減少可利用胚胎數(shù)，因此為了保證有充足的可利用胚胎，就需要盡可能增加獲卵數(shù)。

綜上所述，在TESA- ICSI助孕周期中，睪丸精子來源并不是影響臨床結(jié)局的因素，而男性年齡及女方獲卵數(shù)與臨床結(jié)局有顯著相關(guān)性，因此對需要行TESA- ICSI助孕的患者來說，越早尋求輔助生殖助孕成功率越高。在促排卵過程中最好根據(jù)患者實際情況采用個性化促排卵方案，盡可能提高獲卵數(shù)以增加可利用胚胎，從而提高累積臨床妊娠率。同時本研究尚存在一定的局限性：首先本研究屬于單中心研究，樣本量較少，研究結(jié)果尚需大樣本量的驗證；其次是在TESA- ICSI助孕周期中可能影響臨床結(jié)局的因素眾多，本研究只納入了本中心有完整記錄的臨床參數(shù)進(jìn)行分析，在實際中可能還有其它影響因素未納入研究，需要采用新的臨床資料加以論證。