方玲，夏永欣，張向東

(南陽市中心醫(yī)院 消化內(nèi)科二病區(qū)，河南 南陽 473000)

胃癌是最常見的癌癥類型，其早期階段癥狀隱匿且具有非特異性，就診時多數(shù)患者已處于中晚期[1]。手術(shù)切除是胃癌的有效治療方法，且隨著近年來化療的進(jìn)展，患者無進(jìn)展生存期和總生存率有所提高，但預(yù)后仍然較差，晚期患者5年生存率僅為20%左右[2]。因此，尋找可準(zhǔn)確預(yù)測胃癌患者預(yù)后的指標(biāo)有積極意義。具有表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)樣結(jié)構(gòu)域的心臟發(fā)育蛋白1(heart development protein with EGF- like domains 1，HEG1)是一種跨膜蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，HEG1能促進(jìn)間皮瘤細(xì)胞的增殖和存活，可作為新穎且精確的惡性間皮瘤鑒定標(biāo)志物，用于惡性間皮瘤的早期診斷和治療[3]。Krev相互作用捕獲蛋白1(Krev interaction trapped protein 1,KRIT1)具有錨蛋白重復(fù)序列和一個FERM結(jié)構(gòu)域，其參與腦海綿狀血管瘤的發(fā)生發(fā)展，敲低KRIT1能夠促進(jìn)錨定獨(dú)立的腫瘤細(xì)胞生長[4]。HEG1、KRIT1均可影響癌癥的疾病進(jìn)展，且HEG1能直接結(jié)合KRIT1，調(diào)節(jié)和維持內(nèi)皮連接的完整性[5]。但兩者表達(dá)與胃癌的關(guān)系目前尚不清楚。本研究通過分析胃癌組織中HEG1、KRIT1蛋白的表達(dá)及其臨床意義，為胃癌預(yù)后標(biāo)志物的尋找提供幫助。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院2014年9月至2016年9月收治的胃癌患者85例作為研究對象，其中男59例，女26例，年齡32～79歲，平均(60.74±12.35)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1) 病 理檢查確診為胃癌；(2) 臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1) 合并其它惡性腫瘤；(2) 合并機(jī)體免疫性疾病；(3) 無法配合研究。所有研究對象或其直系親屬簽署知情同意書，且經(jīng)我院倫理委員會審核、批準(zhǔn)后實(shí)施(倫理批號20140817)。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本采集 患者均行手術(shù)治療，在術(shù)中收集患者胃癌組織85例以及癌旁正常黏膜組織(距病灶≥2 cm 的組織)57例，經(jīng)石蠟包埋后保存待測。

1.2.2 免疫組化法檢測HEG1、KRIT1蛋白表達(dá) 將石蠟包埋后的組織標(biāo)本制備成4 μm的連續(xù)切片，經(jīng)常規(guī)烤片、脫蠟、酒精梯度脫水、抗原修復(fù)，3%過氧化氫阻斷過氧化物酶，室溫下采用山羊血清封閉，分別添加兔抗人HEG1多克隆抗體[貨號ab121343，艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司]、兔抗人KRIT1單克隆抗體(濃度1∶5 000)(貨號H00000889- K，亞諾法生技股份有限公司)孵育過夜，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)清洗后添加二抗孵育2 h，二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色，封片，鏡下觀察結(jié)果。

1.2.3 結(jié)果判斷 采用陽性細(xì)胞百分比與染色強(qiáng)度乘積對結(jié)果進(jìn)行評價[6]。陽性細(xì)胞百分比：<5%、6%～25%、26%～50%、51%～75%、>75%分別為0、1、2、3、4分；染色強(qiáng)度：無色、淡黃色、棕黃色、棕褐色分別為0、1、2、3分。兩項(xiàng)乘積≤2分定義為陰性，>2分為陽性。

1.2.4 數(shù)據(jù)庫分析 通過Ualcan數(shù)據(jù)庫(http:∥ualcan.path.uab.edu/)分析HEG1、KRIT1 mRNA在胃癌組織及癌旁正常胃黏膜組織中的表達(dá)水平，并以HEG1、KRIT1 mRNA中位數(shù)為高、低表達(dá)界值，分析HEG1、KRIT1 mRNA水平與胃癌預(yù)后的關(guān)系。

1.3 隨訪

術(shù)后對患者進(jìn)行5年隨訪，所有患者均給予規(guī)范化治療(包括化療、靶向治療、免疫治療等)，至患者死亡或于2021年9月結(jié)束隨訪。隨訪通過門診復(fù)查、微信、電話等方式進(jìn)行，術(shù)后第1年每3～6個月隨訪1次，術(shù)后第2～第5年每6～12個月隨訪1次，隨訪記錄完整，隨訪率為100%。統(tǒng)計患者的生存情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 23.0軟件分析數(shù)據(jù)。計數(shù)資料以例數(shù)和百分比描述，行χ2檢驗(yàn)；Spearman法分析胃癌組織中HEG1、KRIT1蛋白表達(dá)的相關(guān)性；Kaplan- Meier法評估HEG1、KRIT1蛋白表達(dá)與胃癌患者總生存率的關(guān)系；Cox回歸分析影響胃癌患者預(yù)后的因素。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Ualcan數(shù)據(jù)庫胃癌組織HEG1、KRIT1 mRNA表達(dá)水平比較

Ualcan數(shù)據(jù)庫顯示，胃癌組織中HEG1、KRIT1 mRNA表達(dá)水平均高于正常組織(P<0.05)。見圖1、2。

圖1 Ualcan數(shù)據(jù)庫分析胃癌組織中HEG1 mRNA表達(dá)水平

圖2 Ualcan數(shù)據(jù)庫分析胃癌組織中KRIT1 mRNA表達(dá)水平

2.2 不同組織中HEG1、KRIT1蛋白表達(dá)的差異

胃癌組織HEG1、KRIT1蛋白陽性率均高于癌旁正常黏膜組織(P<0.05)。見表1和圖3、4。

圖3 胃癌組織及癌旁正常黏膜組織中HEG1蛋白表達(dá)(×400) A.胃癌組織HEG1蛋白陰性表達(dá)； B.胃癌組織HEG1蛋白陽性表達(dá)； C.癌旁正常黏膜組織HEG1蛋白陰性表達(dá)； D.癌旁正常黏膜組織HEG1蛋白陽性表達(dá)

表1 不同組織中HEG1、KRIT1蛋白表達(dá)差異 例

2.3 胃癌組織中HEG1、KRIT1蛋白陽性率與患者臨床病理特征的關(guān)系

不同性別、年齡及腫瘤直徑患者胃癌組織中HEG1、KRIT1蛋白陽性率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；胃癌組織中HEG1、KRIT1蛋白陽性率與患者胃癌分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。見表2。

表2 胃癌組織中HEG1、KRIT1蛋白陽性率與患者臨床病理特征的關(guān)系 例

2.4 胃癌組織中HEG1與KRIT1蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析

Spearman法分析顯示，胃癌組織中HEG1與KRIT1蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.05)。見表3。

表3 胃癌組織中HEG1與KRIT1蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析 例

2.5 Ualcan數(shù)據(jù)庫中HEG1、KRIT1mRNA表達(dá)水平與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系

Ualcan數(shù)據(jù)庫顯示，HEG1 mRNA高表達(dá)患者總生存率低于HEG1 mRNA低表達(dá)患者(P<0.05)；KRIT1 mRNA高表達(dá)患者總生存率低于KRIT1 mRNA低表達(dá)患者，但兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖5、6。

2.6 胃癌組織中HEG1、KRIT1蛋白表達(dá)與患者總生存率的關(guān)系

隨訪5年，胃癌患者總生存率為43.53%(37/85)。采用Kaplan- Meier法分析HEG1、KRIT1蛋白表達(dá)與患者總生存率的關(guān)系，結(jié)果顯示，HEG1蛋白陽性表達(dá)者總生存率為36.67%(22/60)，明顯低于HEG1陰性表達(dá)者的60.00%(15/25)，兩者比較，log- rank值為4.312，P=0.038，見圖7；KRIT1蛋白陽性表達(dá)者總生存率為26.67%(7/30)，明顯低于KRIT1陰性表達(dá)者的52.73%(29/55)，兩者比較，log- rank值為7.209，P=0.007，見圖8。

圖4 胃癌組織及癌旁正常黏膜組織中KRIT1蛋白表達(dá)(×400) A.胃癌組織KRIT1蛋白陰性表達(dá)； B.胃癌組織KRIT1蛋白陽性表達(dá)； C.癌旁正常黏膜組織KRIT1蛋白陰性表達(dá)； D.癌旁正常黏膜組織KRIT1蛋白陽性表達(dá)

圖5 Ualcan數(shù)據(jù)庫中HEG1 mRNA表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系

圖6 Ualcan數(shù)據(jù)庫中KRIT1 mRNA表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系

圖7 胃癌組織中HEG1蛋白表達(dá)與患者生存的關(guān)系

圖8 胃癌組織中KRIT1蛋白表達(dá)與患者生存的關(guān)系

將HEG1、KRIT1蛋白同時表達(dá)陽性的27例患者作為A組，其余58例患者作為B組。Kaplan- Meier法分析顯示，A組總生存率為14.81%(4/27)，明顯低于B組的56.90%(33/58)，兩組比較，log- rank值為35.436，P=0.000，見圖9。

圖9 胃癌組織中不同HEG1、KRIT1蛋白表達(dá)與患者生存的關(guān)系

2.7 影響胃癌患者預(yù)后的因素分析

Cox回歸分析結(jié)果顯示，腫瘤低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、HEG1蛋白陽性及KRIT1蛋白陽性是影響胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素(P<0.05)，見表4。

表4 影響胃癌患者預(yù)后的因素分析

3 討 論

胃癌是全球所有惡性腫瘤中第五大最常見和第三大癌癥相關(guān)死亡原因，2013—2015年中國胃癌患者5年總生存率低于35%[7]。早期胃癌病變僅限于胃黏膜及黏膜下層，但因缺乏特異性癥狀，80%以上的患者被確診時處于晚期，通常需要手術(shù)治療，即使采用先進(jìn)的全身治療方法，仍需進(jìn)行遠(yuǎn)端胃及淋巴結(jié)切除，預(yù)后較差[8]。因此，探究胃癌的分子機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)及預(yù)后預(yù)測指標(biāo)意義重大。

HEG1是一種高度特異和敏感的間皮瘤標(biāo)志物，可用于鑒別上皮樣、雙相型惡性間皮瘤[9]。Zhao等[10]研究發(fā)現(xiàn)，HEG1在人肝癌組織和細(xì)胞株中均呈高表達(dá)，可在體外及體內(nèi)環(huán)境中促進(jìn)肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、侵襲，誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，且HEG1高表達(dá)能夠預(yù)測肝癌患者的不良預(yù)后，可作為肝癌的預(yù)后標(biāo)志物及治療靶標(biāo)。然而HEG1在胃癌中作用的相關(guān)研究較少，通過檢索Ualcan數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中HEG1 mRNA水平高于正常胃黏膜組織，且HEG1 mRNA高表達(dá)患者總生存率低于低表達(dá)患者，提示HEG1可能參與胃癌的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中HEG1蛋白陽性率高于癌旁正常黏膜組織，與Ualcan數(shù)據(jù)庫結(jié)果一致。此外，HEG1蛋白陽性率與患者胃癌分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，HEG1蛋白陽性表達(dá)者總生存率明顯低于HEG1陰性表達(dá)者，推測HEG1能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、侵襲等過程，從而參與胃癌疾病進(jìn)展，影響患者預(yù)后。

KRIT1能夠調(diào)節(jié)鈣黏蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞- 細(xì)胞連接、整合素介導(dǎo)的細(xì)胞- 基質(zhì)黏附、血管內(nèi)皮生長因子信號，以及由Krüppel樣因子家族的血流敏感轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等[11]。KRIT1還與主要的氧化還原敏感信號通路有關(guān)，參與調(diào)節(jié)促氧化和抗氧化通路以及自噬等[12- 13]。而本研究結(jié)果與Ualcan數(shù)據(jù)庫結(jié)果一致，胃癌組織中KRIT1蛋白陽性率明顯高于癌旁正常黏膜組織，KRIT1蛋白陽性率與胃癌患者臨床病理特征有關(guān)，提示KRIT1可能通過影響腫瘤生長過程中的血管生成及血管通透性，參與胃癌的發(fā)生發(fā)展。Ualcan數(shù)據(jù)庫結(jié)果顯示，KRIT1 mRNA高表達(dá)患者總生存率較低表達(dá)患者低，但兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義，本研究結(jié)果則顯示KRIT1蛋白陽性表達(dá)者總生存率明顯低于KRIT1陰性表達(dá)者，可能是由于樣本量的差異及隨訪時間的不同所導(dǎo)致。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)腫瘤低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、HEG1蛋白陽性及KRIT1蛋白陽性是影響胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素，且HEG1、KRIT1蛋白同時表達(dá)陽性的患者具有更低的生存率，進(jìn)一步提示HEG1、KRIT1蛋白表達(dá)與胃癌患者預(yù)后有關(guān)，可能作為評估預(yù)后的重要指標(biāo)。研究報道，KRIT1 FERM結(jié)構(gòu)域可與HEG1細(xì)胞質(zhì)尾部C端結(jié)合形成蛋白復(fù)合體，用于穩(wěn)定內(nèi)皮連接，HEG1- KRIT1相互作用的完整性與內(nèi)皮細(xì)胞對血流反應(yīng)的核心轉(zhuǎn)錄因子密切相關(guān)[14]。本研究通過Spearman法分析顯示，胃癌組織中HEG1、KRIT1蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，提示二者可能通過相互作用，影響胃癌生長過程中的血管生成。

綜上所述，胃癌組織中HEG1、KRIT1均呈高表達(dá)，二者水平可預(yù)測患者預(yù)后，有望成為胃癌預(yù)后的標(biāo)志物。但HEG1、KRIT1在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的具體作用機(jī)制仍需通過細(xì)胞或動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究。