張靖雯，楊江華*，張效偉，2

(1.南京大學環(huán)境學院，污染控制與資源化研究國家重點實驗室，江蘇 南京 210023；2.江蘇省環(huán)境保護化學品安全與健康風險研究重點實驗室，江蘇 南京 210023)

0 前言

人類活動產(chǎn)生的環(huán)境污染、棲息地破壞、土地類型的改變等對生態(tài)系統(tǒng)的物種組成產(chǎn)生巨大影響[1]，進而導致整個生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性下降，生態(tài)功能和服務受損。環(huán)境管理中，高效準確地監(jiān)測物種多樣性對及時了解水生生態(tài)系統(tǒng)的健康狀況至關(guān)重要[2-3]。目前，對生態(tài)系統(tǒng)中生物組成的了解主要依靠傳統(tǒng)的形態(tài)學物種調(diào)查方法，即先將物種從環(huán)境中分離，再根據(jù)其特定的分類學特征鑒別物種，整個過程極其耗時、耗力，并嚴重依賴鑒定專家的物種鑒定經(jīng)驗。DNA宏條形碼技術(shù)作為一種準確、高效的新型生物監(jiān)測手段，主要利用環(huán)境中殘存的生物DNA序列識別物種，在河流、湖泊、海洋等生態(tài)系統(tǒng)的生物監(jiān)測中被廣泛應用[4-7]。盡管DNA宏條形碼技術(shù)被越來越多的學者所接受，但是由于缺乏統(tǒng)一的規(guī)范化操作流程，導致跨實驗室的結(jié)果難以橫向?qū)Ρ龋瑖乐刈璧K了該技術(shù)在環(huán)境管理中的應用，因此亟須針對不同生物類群建立統(tǒng)一規(guī)范的DNA宏條形碼分析方法。

浮游動物是水生生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，是物質(zhì)和能量從初級生產(chǎn)者(藻類)到更高營養(yǎng)級(魚類)物種傳遞的紐帶，對維持水生生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定具有重要意義[8]。浮游動物生活周期短，對環(huán)境因子(如物化參數(shù)、污染脅迫等)較為敏感，是水生生態(tài)健康狀況的重要指示生物[9-10]。目前，依賴形態(tài)學物種鑒定的生物調(diào)查是淡水生態(tài)系統(tǒng)生態(tài)健康評估的重要依據(jù)。但傳統(tǒng)調(diào)查難以辨別處于發(fā)育早期，分類特征尚未形成的橈足類浮游動物，無法準確反映浮游動物群落的物種組成。而DNA宏條形碼技術(shù)主要基于物種間特定DNA序列差異來區(qū)分物種，采樣便捷、準確性高，被廣泛應用在生態(tài)學領(lǐng)域的諸多研究中[11]，如新物種發(fā)現(xiàn)、生物多樣性評估[12]、生物捕食關(guān)系分析[13]及食物網(wǎng)的結(jié)構(gòu)特征分析等[14]，也為浮游動物群落組成的精準調(diào)查提供了新的機遇。

雖然DNA宏條形碼基本檢測單位是DNA分子，這與傳統(tǒng)調(diào)查以生物體為基本檢測單位明顯不同，但是 DNA宏條形碼監(jiān)測中的樣品采集方法主要參照傳統(tǒng)形態(tài)學調(diào)查的采樣方法[15-18]，即先用浮游生物網(wǎng)富集，之后提取富集獲得的混合組織的DNA，進而進行高通量測序和物種組成分析。該過程中究竟富集多大體積的水樣才能較準確地反映浮游動物群落的多樣性與完整性還存在爭議[19-22]。也有學者直接采用過濾水樣的方式開展浮游動物多樣性研究[23-24]，但這種簡單的采樣方式獲得的浮游動物多樣性的準確性和穩(wěn)定性不明確。因此，本研究重點探討不同的采樣方法對浮游動物DNA宏條形碼監(jiān)測結(jié)果的影響，為規(guī)范化的流域水生生物DNA宏條形碼監(jiān)測提供支撐。

1 材料與方法

1.1 調(diào)查點位及樣本采集

調(diào)查點位位于南京市棲霞區(qū)羊山湖(118°57′E, 32°6′N)。樣品采集設置4～5個平行樣，分別采用直接過濾法和網(wǎng)富集法采樣。

(1) 直接過濾法：直接利用過濾器過濾(濾膜孔徑為5 μm)不同體積(100，200，500和1 000 m L)的水樣，過濾后收集濾膜用于后續(xù)DNA提取。

(2) 網(wǎng)富集法：先用標準25#浮游生物網(wǎng)過濾一定體積(5，10，20和1 000 L)的水樣，對浮游動物進行初步富集濃縮，濃縮后的樣本再用孔徑為5 μm的濾膜進行過濾，最后收集濾膜用于后續(xù)DNA提取。過濾體積基于水泵的流速和過濾時間換算。

1.2 核酸提取與擴增

采用E.Z.N.A. water DNA kit 水樣提取試劑盒(美國Omega公司)提取濾膜DNA。具體操作為：將濾膜裝入5 mL無菌管中，加入0.2 mg的無菌玻璃珠，加入1 mL裂解液，用MoBio Vortex-Genie2渦旋振蕩儀(美國MoBio公司)均質(zhì)10 min，之后按照試劑盒操作說明提取DNA。聚合酶鏈式反應(PCR)擴增體系：總反應體系為50 μL，由37.8 μL 雙蒸水, 2 μL DNA，1 μL擴增引物，5 μL 10倍PCR高保真PCR緩沖溶液(High Fidelity PCR buffer)，2 μL 50 mmol/L的硫酸鎂，1 μL 10 mmol/L的脫氧核糖核苷三磷酸混合物(dNTP mix)，0.2 μL Platinum Taq DNA 聚合酶組成(美國Invitrogen公司)[13]。

PCR擴增程序為： 95 °C 預變性30 s，擴增35個循環(huán)，95 °C變性10 s， 48 °C退火30 s，72 °C延伸30 s，72°C延伸5 min。PCR結(jié)束后用2%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增效果進行檢測，用核酸純化試劑盒進行產(chǎn)物純化，用Qubit(美國Invitrogen公司)進行核酸定量。

1.3 高通量測序與生物信息學分析

不同樣本擴增后的PCR產(chǎn)物被稀釋到10-2g/L 并等體積混合。用Ion Torrent PGM測序?qū)Ｓ迷噭┖?美國Lifetech公司)構(gòu)建測序文庫。測序文庫測序前，用磁珠純化去除文庫中的雜質(zhì)和短片段(< 100 bp)；純化后的測序文庫用2100生物分析儀(美國Agilent公司)檢測合格后稀釋到100 pmol/L的濃度，用Ion Torrent PGM測序儀進行高通量測序。

測序結(jié)束后利用Mothur fastq.info命令將測序輸出的原始FASTQ文件轉(zhuǎn)為FASTA文件和Qual質(zhì)量值文件[25]。利用QIIME軟件[26]刪除測序質(zhì)量低于Q20和引物中出現(xiàn)3個堿基以上錯配的序列。利用UCHIME[27]識別并去除PCR過程中產(chǎn)生的嵌和子序列[28]。利用USEARCH軟件[29]對序列進行聚類，并形成可操作分類單元(OTUs)。利用SAP和BLAST+軟件的默認參數(shù)進行OTUs序列[30]的比對和注釋，其中序列間的相似性>90%，且后驗概率>60%的序列被注釋到種水平。序列注釋數(shù)據(jù)庫包括自建的本土物種數(shù)據(jù)庫和NCBI GenBank中公開的條形碼數(shù)據(jù)庫[31-33]。

2 實驗結(jié)果

2.1 采樣方法和體積對浮游動物宏條形碼OTUs/序列注釋的影響

不同采樣方法和體積對浮游動物宏條形碼測序結(jié)果的影響見圖1(a)—(e)，采樣體積以L為單位， 0.1～1 L為直接過濾水樣體積，5～1 000 L為浮游生物網(wǎng)富集過程中的過水體積。由圖1(a)和(b)可見，直接過濾法中，DNA宏條形碼測序獲得的總OTUs數(shù)量和注釋到浮游動物OTUs數(shù)量均隨過濾體積的增加而增加；網(wǎng)富集法中，總OTUs隨著采樣體積的增加而下降，在采樣體積為5和1 000 L時，浮游動物OTUs的數(shù)量較大。由圖1(c)可見，直接過濾法中，隨著過濾體積的提高，不能被注釋的未知DNA序列占比也逐漸增多，當過濾水樣體積為1 L時，有超過40%的DNA序列無法被數(shù)據(jù)庫準確注釋；網(wǎng)富集法中，隨著浮游動物網(wǎng)過水體積的增加，不能夠被注釋的序列占比下降，在采樣體積為1 000 L時，僅有不到5%的未知序列。由圖1(d)可見，直接過濾法中，隨著采樣體積的不斷加大，浮游動物序列占總序列的比例也逐漸下降，當過濾水樣體積達到1 L時，浮游動物僅占總序列的10%左右；網(wǎng)富集法中，浮游動物所占總序列的比例隨著過水體積的增加而逐漸增加，在采樣體積為1 000 L時，有超過90%的序列都為浮游動物。由圖1(e)可見，與直接過濾法相比，網(wǎng)富集法能發(fā)現(xiàn)更多的浮游動物種類，尤其是能檢出更多枝角類和橈足類，而對于部分小型浮游動物輪蟲來說，直接過濾水樣對其檢出效果更好。

圖1 不同采樣方法和體積對浮游動物宏條形碼測序結(jié)果的影響

2.2 采樣體積對浮游動物多樣性的影響

采樣體積對浮游動物多樣性的影響見圖2(a)—(d)。由圖2可見，直接過濾法中，大型浮游動物(主要為枝角類和橈足類)的多樣性隨著過濾體積的增加而增加，其中大型浮游動物多樣性在過濾體積為1 L時達到最大值；隨著過濾體積的增加，枝角類的多樣性有所增加，而橈足類的多樣性變化不明顯；小型浮游動物輪蟲的多樣性隨著過濾體積的增加而有所下降。網(wǎng)富集法中，大型浮游動物的多樣性在富集5 L水樣時達到最大，10和20 L時小型浮游動物多樣性則大幅降低，而在過濾體積達到1 000 L時多樣性再次上升，并與5 L富集體積下的多樣性基本保持一致；枝角類多樣性與中大型浮游動物的多樣性變化趨勢基本一致；橈足類的多樣性受采樣體積的影響較小，但在采樣體積達到1 000 L時監(jiān)測的重復性更好；小型浮游動物輪蟲在富集體積達到1 000 L時，其多樣性達到最大值。

圖2 采樣體積對浮游動物多樣性的影響

2.3 采樣體積對重復樣本中OTUs檢出率的影響

重復樣本的檢出率是反映采樣方法穩(wěn)定性的重要指標。浮游動物OTUs在重復采樣時的檢出率見圖3。由圖3可見，直接過濾法中，隨著過濾體積的增加，檢出率>75%的浮游動物OTUs的數(shù)量逐漸增加，在總OTUs中的占比也呈上升趨勢，這說明實驗結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性在不斷提高。網(wǎng)富集法中，富集體積為5 L時，4個重復樣本中檢出率>75%的OTUs占比為82%，在過水體積為10 和20 L時，這一比例分別為73%和69%，當富集水樣體積達到1 000 L時，該比例增長到 87%。由此說明選擇1 000 L的富集體積得到的浮游動物多樣性監(jiān)測結(jié)果穩(wěn)定性最高。

圖3 浮游動物OTUs在重復采樣時的檢出率

3 討論

傳統(tǒng)形態(tài)學生物監(jiān)測中，結(jié)合浮游動物的體型大小與分布特點，通常用直接過濾法獲取小微型浮游動物(如輪蟲)，用網(wǎng)富集法獲取大型浮游動物(如橈足類和枝角類)[34]。傳統(tǒng)調(diào)查中采樣的目的是要捕獲足夠量的生物個體，以便后續(xù)依據(jù)生物的形態(tài)學特征進行分類鑒定[35]。而DNA宏條形碼技術(shù)是通過檢測DNA分子來判斷生物存在與否，可利用有機體的組織、殘片或游離DNA，不需要獲取到生物個體[36]，因此，DNA宏條形碼監(jiān)測并不能完全遵循傳統(tǒng)的采樣方式，需要結(jié)合環(huán)境DNA的自身特點進行采樣。

3.1 小型浮游動物

直接過濾水樣對小型浮游動物的監(jiān)測效果更好。在直接過濾小體積水樣時，能捕獲到分布相對均勻且數(shù)量較多的小型浮游動物(如輪蟲)，DNA的檢出效果更好，而對于數(shù)量較少的大型浮游動物來說，如橈足類，往往并不能直接富集到[34]，DNA的檢出效果也較差。而在采用網(wǎng)富集法時，由于25#浮游動物網(wǎng)的孔徑會遺漏一些個體較小的輪蟲，在富集體積不足時導致檢出的輪蟲數(shù)量要低于直接過濾法。但是，對小型輪蟲的遺漏可以通過增大過水體積來彌補不足，當富集體積達到1 000 L時，檢出的輪蟲多樣性與直接過濾1 L水樣時所檢測出的輪蟲多樣性基本一致。但是，綜合考慮采樣效率和經(jīng)濟性時，采用直接過濾1 L水樣的方法更適于小型浮游動物的檢測。

3.2 大型浮游動物

浮游生物網(wǎng)富集對大型浮游動物的監(jiān)測效果更好。對于大型浮游動物而言，由于其在水體中數(shù)量少、密度低，須先用浮游動物網(wǎng)進行富集濃縮再進行DNA宏條形碼的檢測。實際上，由于自然水體中“自由DNA”的存在，使得在直接過濾水樣中也能檢測出某些大型浮游動物的OTUs。其中枝角類的多樣性隨浮游動物網(wǎng)富集體積增加而顯著變化，富集體積為5 L時所檢測出的枝角類種數(shù)最多，該過濾體積比較適合枝角類多樣性的檢測。對于橈足類，網(wǎng)富集法所得到的物種多樣性高于直接過濾法，該結(jié)論與以往的研究結(jié)果相一致。Djurhuus等[17]比較了不同的環(huán)境DNA樣品來源對浮游動物多樣性的影響發(fā)現(xiàn)，網(wǎng)富集法相較于直接過濾法獲得的大型浮游動物橈足類的物種數(shù)目更多。本研究中，當富集體積達到1 000 L時，檢測出的橈足類多樣性最高，平行樣間的重復性也較好。然而，在現(xiàn)實采樣中，定量富集1 000 L的做法可操作性差，且大體積富集會降低枝角類的檢測效率，因此建議浮游動物網(wǎng)的最佳富集體積為5～10 L。

4 展望

本研究建立了適合于浮游動物DNA宏條形碼監(jiān)測技術(shù)的采樣方法，初步實現(xiàn)了該采樣方法的標準化，同時也為DNA宏條形碼技術(shù)在淡水水體生物多樣性監(jiān)測方面的靈活運用提供了技術(shù)支撐。但是，浮游動物在水中的分布受光、熱、營養(yǎng)物質(zhì)的影響，不同水體類型(河流、湖泊、水庫)中的浮游動物分布也不同[37]，如海水中浮游動物存在明顯分層[38]，河流的流速、沿岸排污口會對浮游動物產(chǎn)生巨大影響等[39]，尤其是在開展物種定量監(jiān)測時，采樣方法則顯得尤為重要[40]。因此在未來的浮游動物DNA宏條形碼監(jiān)測中，要考慮上述各方面影響對浮游動物分布的綜合作用，針對不同水體類型確定合理的采樣深度、采水方式、采樣體積等。作為一種新型監(jiān)測方法，規(guī)范化和標準化是DNA宏條形碼技術(shù)業(yè)務化應用的基礎。除采樣方法需要標準化外，標志基因和擴增引物[41]、評價指標的篩選和建立[42]、生物信息學分析方法等都需要統(tǒng)一的標準[43]，以提高物種監(jiān)測的準確性及監(jiān)測結(jié)果的可比性。