秦璐璐，劉文瓊

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250014；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院婦科，山東 濟(jì)南 250014）

異常子宮出血（abnormal uterine bleeding,AUB）是指與正常月經(jīng)的周期、經(jīng)期及經(jīng)量中的任何一項(xiàng)不符、來(lái)源于宮腔的異常出血[1,2]。有資料顯示，AUB在生育期婦女中約占l/3，其中20%~50%為功血[3,4]。AUB發(fā)病率及就診率較高，且存在病因及發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、治療局限及復(fù)發(fā)率高的問(wèn)題，成為嚴(yán)重危害女性健康的疾病之一。目前西醫(yī)對(duì)AUB的治療較為局限，以激素及手術(shù)治療為主，人群接受率較低，所以迫切需要從中醫(yī)藥中尋找安全有效防治AUB的藥物。

益母草（Leonurus japonicus Houtt）在《雷公炮制藥性解》中曾記載：“味辛甘，性微寒，無(wú)毒，入諸陰經(jīng)，本功治血”，且具有“行血而不傷新血，養(yǎng)血而不滯瘀血”的特點(diǎn)。益母草作為婦科常用藥物，被稱為“婦科經(jīng)產(chǎn)之要藥”?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，益母草具有雙向調(diào)節(jié)子宮收縮活動(dòng)、防止凝血、激素調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)子宮肌電、保護(hù)子宮內(nèi)膜、促進(jìn)子宮內(nèi)膜復(fù)舊和抗子宮內(nèi)膜炎等作用[5,6]。馬齒莧（Portulaca oleracea L.）作為中國(guó)傳統(tǒng)的藥食同用的藥物，具有毒副作用小的特點(diǎn)，《唐本草》載其可：“破血癖癥癖”，《滇南本草》中其有“催生下胎、療痔瘡紅腫熱痛”的作用，現(xiàn)在藥理研究發(fā)現(xiàn)馬齒莧不僅有抗炎、抗氧化的作用，而且對(duì)子宮具有興奮作用，任何劑量均不會(huì)引起子宮肌強(qiáng)直收縮，故馬齒莧的臨床應(yīng)用安全范圍較大[7-9]。益母草和馬齒莧在臨床上治療異常子宮出血應(yīng)用頗多，且藥量變化靈活，故本文以益母草馬齒莧作為研究目標(biāo)，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選出該藥對(duì)的主要藥物活性成分，構(gòu)建“藥物成分靶點(diǎn)通路”網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測(cè)該藥對(duì)治療AUB的對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)及信號(hào)通路，從新的層面探討益母草馬齒莧治療AUB的可能作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 提取益母草-馬齒莧的藥物有效成分及靶點(diǎn)

在TCMSP分析平臺(tái)（https://tcmspw.com/tcmsp.php）上，以生物利用度（oral bioavailability,OB）≥30%[4]和類藥性（drug likeness,DL）≥0.18[5]為條件指標(biāo)，并檢索《中藥詞典》及相關(guān)文獻(xiàn)，篩選益母草及馬齒莧的化學(xué)成分，選擇“Related Targets”一欄，導(dǎo)出結(jié)果，提取中藥有效成分所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，把獲取的益母草馬齒莧的中藥成分及其對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org/）選出作用靶點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)基因名。

1.2 提取AUB疾病相關(guān)基因

將“Abnormal uterine bleeding”分別在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org/）、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)（https://omim.org/）中輸入，從而得到AUB相關(guān)的靶點(diǎn)基因。

1.3 獲取益母草-馬齒莧和AUB疾病靶點(diǎn)的交集

把益母草馬齒莧藥物靶點(diǎn)和AUB疾病靶點(diǎn)運(yùn)用相應(yīng)腳本，通過(guò)R 64 4.0.2軟件（https://www.r-project.org/）得到AUB疾病和益母草馬齒莧藥物交集靶點(diǎn)的韋恩圖。

1.4 構(gòu)建中藥-有效成分-疾病-靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

將1.2中獲得的益母草馬齒莧藥物靶點(diǎn)和1.3中獲得的益母草馬齒莧和AUB交集靶點(diǎn)通過(guò)Perl腳本得到相應(yīng)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，然后對(duì)該網(wǎng)絡(luò)通過(guò)Cytoscape3.7.2軟件（https://cytoscape.org/）進(jìn)行可視化呈現(xiàn)，得到中藥 成分 疾病 靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖，圖中的節(jié)點(diǎn)具體代表了中藥、有效成分、疾病和靶點(diǎn)，連線代表了上述節(jié)點(diǎn)之間的作用聯(lián)系。

1.5 建立中藥-疾病靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)并選取核心基因

將中藥-疾病靶點(diǎn)輸入STRING 11.0在線軟件（http://string-db.org/cgi/input.pl），條件選為homo sapiens（human），保存所得結(jié)果，將所得結(jié)果輸入R 64 4.0.2軟件，從而獲得蛋白互作網(wǎng)絡(luò)核心靶點(diǎn)的條型圖。

1.6 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

運(yùn)用R 64 4.0.2軟件計(jì)算中藥疾病靶點(diǎn)，獲得GO功能富集分析結(jié)果（表2、圖5和圖6）和KEGG通路富集分析結(jié)果（表3、圖7、圖8和圖9）。

1.7 分子對(duì)接技術(shù)驗(yàn)證中藥活性成分與核心基因的結(jié)合活性

運(yùn)用分子對(duì)接技術(shù)，選擇中藥的3個(gè)特征性活性成分與蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中排名前3的靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，通過(guò)PubChem找到中藥的化合物結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入Chem3D軟件對(duì)其空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)RCSB PDB下載蛋白受體結(jié)構(gòu)，使用AutoDock Tools 1.5.6對(duì)化合物進(jìn)行去水、加氫和加電荷處理，根據(jù)配體的位置以及蛋白活性位點(diǎn)的坐標(biāo)進(jìn)行分子對(duì)接研究，通過(guò)結(jié)合能的大小對(duì)活性成分與靶點(diǎn)之間的結(jié)合活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，并用PyMOL進(jìn)行分析作圖。

2 結(jié)果

2.1 益母草-馬齒莧藥物有效成分及靶點(diǎn)信息

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)（以O(shè)B≥30%和DL≥0.18為條件）檢索《中藥詞典》及相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)益母草-馬齒莧共篩選出19個(gè)藥物有效成分（其中益母草10個(gè)、馬齒莧12個(gè)，共有成分3個(gè)）（見(jiàn)表1），匯總?cè)ブ睾?，獲取929個(gè)藥物靶點(diǎn)，通過(guò)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，其中僅有455個(gè)靶點(diǎn)可找到對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)基因名，然后利用R 64 4.0.2軟件將上述獲得的455個(gè)標(biāo)準(zhǔn)基因名與GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的AUB相關(guān)基因進(jìn)行匹配，最終得到92個(gè)共同靶點(diǎn)，將其作為候選靶點(diǎn)（見(jiàn)圖1）。

圖1 益母草-馬齒莧中藥成分作用靶點(diǎn)和AUB靶點(diǎn)韋恩圖Fig.1 Venn plots of the AUB targets and action targets of the motherwort-purslane

表1 益母草-馬齒莧藥物有效成分及其篩選參數(shù)Table 1 Active components and screening parameters of Motherwort and Portulaca oleracea

2.2 構(gòu)建中藥-有效成分-疾病-靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的結(jié)果

Cytoscape構(gòu)建調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，得到114個(gè)節(jié)點(diǎn)（其中藥物2個(gè)，核心有效成分19個(gè)，疾病1個(gè)，靶點(diǎn)92個(gè)）和761條線（圖2）。結(jié)果顯示，芹菜素、槲皮素、山柰酚、木犀草素、楊梅黃酮和益母草堿等化合物可能是益母草馬齒莧治療異常子宮出血發(fā)揮治療作用的核心化合物。

圖2 中藥-成分-疾病-靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Fig.2 TCM-component-disease-target regulatory network

2.3 建立中藥-疾病靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)并選取核心基因的結(jié)果

根據(jù)圖3、圖4可知，中藥疾病核心基因按鄰接節(jié)點(diǎn)數(shù)目從多至少按順序?yàn)镮L6、INS、ALB、CASP3、EGFR、VEGFA、MAPK8、MYC、ESR1、CCND1、ERBB2、FOS、CYCS、AR、CASP8、RELA、CTNNB1、MDM2、PPARG、NOS3、ICAM1、MCL1、CASP9、CAV1、PGR、HIF1A、AHR、PARP1TNFRSF1A和CCNB1等，鄰接節(jié)點(diǎn)數(shù)目越多，越有可能成為核心基因。

圖3 中藥-疾病靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Fig.3 TCM-disease target protein interaction network

圖4 中藥-疾病核心靶點(diǎn)的條圖Fig.4 The bar chart of TCM core disease targets

2.4 GO功能富集分析結(jié)果

GO功能富集分析結(jié)果，見(jiàn)表2。通過(guò)GO功能富集分析共得出114條生物過(guò)程，選取P值最小的20條生物過(guò)程制作柱狀圖和氣泡圖（見(jiàn)圖5和圖6），其中類固醇結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與凋亡過(guò)程、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結(jié)合描述因子結(jié)合及DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑活性等生物過(guò)程中靶點(diǎn)較為集中。

圖5 GO功能富集分析柱狀圖Fig.5 histogram of GO functional enrichment analysis

圖6 GO功能富集分析氣泡圖Fig.6 Bubble diagram of GO functional enrichment analysis

表2 GO功能富集分析結(jié)果Table 2 GO functional enrichment analysis results

2.5 KEGG通路富集分析結(jié)果

KEGG通路富集分析結(jié)果，見(jiàn)表3和圖9。122條信號(hào)通路從KEGG富集分析中得出，選擇P值最小的20條信號(hào)通路制作柱狀圖和氣泡圖（見(jiàn)圖7和圖8），靶基因主要集中在脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、p53信號(hào)通路和TNF信號(hào)通路等。

圖8 KEGG通路富集分析氣泡圖Fig.8 Bubble diagram of KEGG pathway enrichment analysis

圖9 KEGG通路分析圖Fig.9 The KEGG pathway analysis diagram

表3 KEGG通路富集分析結(jié)果Table 3 Results of the KEGG pathway enrichment analysis

圖7 KEGG通路富集分析柱狀圖Fig.7 The histogram of the KEGG pathway enrichment analysis

2.6 分子對(duì)接

選擇中藥的3個(gè)特征性活性成分芹菜素、楊梅黃酮和益母草堿與蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中排名前3的靶點(diǎn)蛋白（IL6、INS和ALB），利用AutoDock軟件進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果見(jiàn)表4、圖10和圖11。本次對(duì)接用結(jié)合能來(lái)評(píng)價(jià)活性成分與蛋白的相互作用強(qiáng)度，若結(jié)合能＜0，表明配體分子均能和受體蛋白自發(fā)結(jié)合，結(jié)合能小于﹣20.92 kJ moL-1，表示有較好的結(jié)合活性，且數(shù)值越小結(jié)合活性越強(qiáng)[10]。結(jié)果顯示芹菜素與INS、ALB的結(jié)合能力均最強(qiáng)，IL6與楊梅黃酮的結(jié)合能力最強(qiáng)。

圖10 芹菜素與ALB分子對(duì)接模式圖Fig.10 Apigenin and ALB docking pattern diagrams

圖11 楊梅黃酮與IL6分子對(duì)接模式圖Fig.11 Myricetin and IL6 docking pattern diagrams

表4 益母草馬齒莧特征性活性成分與核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接結(jié)果Table 4 Molecular docking results of the characteristic active components of Herba Leonuri and Portulaca oleracea with core targets

3 討論

異常子宮出血西醫(yī)病因復(fù)雜，如宮腔內(nèi)膜息肉、子宮平滑肌瘤、子宮腺肌病、排卵功能障礙和凝血相關(guān)疾病等都可導(dǎo)致AUB的發(fā)生，中醫(yī)稱為“崩漏”，多是由于腎虛、脾虛、血熱及血瘀等病因?qū)е聸_脈任脈損傷，不能約束經(jīng)血所致，在治療上，西醫(yī)較為單一，且遠(yuǎn)期療效欠佳，復(fù)發(fā)率較高，中醫(yī)則采用“急則治其標(biāo)，緩則治其本”的原則，提出了“塞源”、“澄源”、“復(fù)舊”的“治崩三法”，中醫(yī)藥采用辨證論治的原則，臨床治療效果較好，因其獨(dú)特的價(jià)值，臨床挖掘潛力巨大。

本文以益母草馬齒莧藥為研究對(duì)象，在最終得到的19個(gè)核心有效成分中，以芹菜素、槲皮素、山柰酚、木犀草素、楊梅黃酮和益母草堿與疾病的關(guān)系最為密切。芹菜素具有抗氧化、抗炎特性，通過(guò)控制自噬以改善組織損傷[11]；楊梅黃酮可增強(qiáng)免疫功能，抑制細(xì)胞因子，改善心功能不全，具有抗腫瘤潛能[12]；槲皮素的止血療效是通過(guò)抑制血小板激活因子與抗血小板聚集發(fā)揮作用，此外，槲皮素還有較強(qiáng)的防氧化、抗炎和清除氧自由基的作用[13-17]；Chen等[18]發(fā)現(xiàn)木犀草素可以減少脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）對(duì)小白鼠肺泡MH-S細(xì)胞刺激而產(chǎn)生的促炎癥因子、腫瘤壞死因子（TNF-）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、炎癥介質(zhì)一氧化氮（NO）和前列腺素E2（PGE2），減少炎癥因子和過(guò)量的活性氧對(duì)機(jī)體造成的損傷，另外，它還具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤作用、抗激素和抗氧化的作用[19,20]；山柰酚是一種黃酮類化合物，通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)、抑制轉(zhuǎn)錄因子激活等方式減少炎癥因子的發(fā)生、發(fā)展，且還具有防氧化、防癌抗癌及抗病毒等多種療效[21-24]；益母草堿可減少藥物流產(chǎn)后子宮出血量并縮短出血時(shí)間，減少宮內(nèi)殘留，通過(guò)改善下丘腦垂體卵巢軸（HPOA）、增加雌二醇含量，進(jìn)而改善子宮異常出血[25]。

此外，益母草馬齒莧與異常子宮出血的核心基因很可能是IL6、ALB、VEGFA、CASP3和EGFR。IL6（白介素-6）作為一種細(xì)胞因子，對(duì)B淋巴細(xì)胞的成熟以及炎癥過(guò)程起重要的作用，有研究證明在子宮內(nèi)膜病變過(guò)程中常伴有白介素-6的過(guò)分表達(dá)[26,27]；ALB（白蛋白）具有維持血漿膠體滲透壓的作用，另外ALB作為一種非專一性的載體蛋白，能可逆性地與體內(nèi)許多難溶性的小分子有機(jī)物和無(wú)機(jī)離子進(jìn)行結(jié)合，利于這些物質(zhì)在血液循環(huán)中運(yùn)行，黃敏[28]研究發(fā)現(xiàn)，白蛋白可以運(yùn)輸紫杉醇作用于腫瘤細(xì)胞，從而能使紫杉醇發(fā)揮更強(qiáng)大的抗腫瘤效果；有研究表明，VEGFA（血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子）在圍絕經(jīng)期子宮平滑肌肌瘤合并AUB患者的子宮內(nèi)膜組織中具有過(guò)分表達(dá)，且與BFGF相互調(diào)控，促進(jìn)子宮內(nèi)膜增長(zhǎng)并導(dǎo)致異常出血；另一項(xiàng)研究表明子宮腺肌病和宮腔內(nèi)膜息肉的發(fā)病原因之一可能是血管的異常生成，已有研究證實(shí)VEGFA的過(guò)分表達(dá)和異常出血的發(fā)生呈正相關(guān)的關(guān)系[29,30]；CASP3（胱天蛋白酶3）是一種與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的酶，有研究證明Caspase-3的低表達(dá)可能促使細(xì)胞抗凋亡的能力增強(qiáng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡減少而增殖過(guò)度，這可能是子宮內(nèi)膜異常增生的發(fā)病機(jī)制[31]；EGFR（表皮生長(zhǎng)因子受體）具有酪氨酸激酶活性，通過(guò)與EGF結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖。有研究結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜癌變組織、子宮內(nèi)膜非典型增生組織和正常子宮內(nèi)膜組織中EGFR的陽(yáng)性比率分別是74.4%、38.1%和18.4%，EGFR在由正常子宮內(nèi)膜細(xì)胞向子宮內(nèi)膜癌變細(xì)胞轉(zhuǎn)變過(guò)程中起到了至關(guān)重要的作用[32]。

GO富集分析包括類固醇結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與凋亡過(guò)程、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結(jié)合描述因子結(jié)合和DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑活性等多種生物學(xué)過(guò)程。在KEGG富集分析中，結(jié)果表示靶基因主要集中在PI3K-Akt、MAPK、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE和TNF等信號(hào)通路上。PI3K-Akt信號(hào)通路主要參與體內(nèi)細(xì)胞的分化、增殖和凋亡過(guò)程，PI3K被激活后會(huì)募集并激活下游的信號(hào)分子Akt，Akt被激活后會(huì)促使mTOR和NF-B的活化，活化后的磷酸化底物會(huì)促使細(xì)胞的增殖，另外，PI3K/AKT及其關(guān)鍵因子PI3K、AKT與血管的生成密切相關(guān)[33]；MAPK信號(hào)通路可以被炎性因子、細(xì)胞因子及物理應(yīng)激等刺激所激活，從而誘導(dǎo)炎性細(xì)胞及其他細(xì)胞的增殖與分化；還有研究發(fā)現(xiàn)，MAPK信號(hào)通路的激活與子宮內(nèi)膜容受性和蛻膜的形成密切相關(guān)[34-36]；糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路可激活核轉(zhuǎn)錄因子-B（NF-B），刺激VEGF和TGF-1的產(chǎn)生，誘導(dǎo)MCP-1的表達(dá)，從而引起慢性細(xì)胞活化和組織損傷，增加血管的通透性，進(jìn)而促進(jìn)多種趨化因子、炎癥因子及黏附因子的釋放，如MCP-1、白細(xì)胞介素-1等，從而導(dǎo)致機(jī)體的損傷[37]。通過(guò)本次KEGG富集分析得到的AGE-RAGE信號(hào)通路圖中可以看到，益母草馬齒莧可能通過(guò)激活下游不同的效應(yīng)蛋白如JNK、NF-B和Bcl-2等，進(jìn)而調(diào)控下游的靶蛋白如IL-6、VEGF、casp3等對(duì)AUB起到治療作用；TNF信號(hào)通路是一個(gè)炎癥誘導(dǎo)細(xì)胞因子通路，TNF信號(hào)主要由其細(xì)胞膜受體TNF-R1和TNF-R2介導(dǎo)，研究表明TNF家族的細(xì)胞因子主要通過(guò)激活NF-B途徑誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)炎癥、細(xì)胞存活、增殖和分化基因的快速轉(zhuǎn)錄，NF-B可以通過(guò)TNF-信號(hào)通路促進(jìn)卵巢癌變細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[38,39]，在本次KEGG富集分析中得到的TNF信號(hào)通路圖可能是通過(guò)激活下游不同的效應(yīng)蛋白如JNK和NF-B等，進(jìn)而調(diào)控下游的靶蛋白如炎癥細(xì)胞因子IL-6、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)因子NF bia、轉(zhuǎn)錄因子Fos及細(xì)胞黏附因子Icaml等對(duì)異常子宮出血起到治療作用。本文通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)驗(yàn)證了益母草馬齒莧兩味中藥的特征性活性成分芹菜素、楊梅黃酮、益母草堿與IL6、INS、ALB具有較強(qiáng)的結(jié)合活性，進(jìn)一步說(shuō)明了益母草馬齒莧對(duì)AUB具有較大的臨床治療潛力。

綜上所述，本文通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)，得出益母草馬齒莧可能是通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)和多通路的方式對(duì)異常子宮出血起到相應(yīng)的治療作用，初步對(duì)益母草馬齒莧治療異常子宮出血作用機(jī)制進(jìn)行了闡述，這也為以后臨床應(yīng)用益母草馬齒莧提供了客觀依據(jù)。