韓淑蘭，段昊雨，孫丹丹，宋柳，鄒宜芳，初迪，李歡，郭建鋒

（吉林大學藥學院，吉林 長春 130021）

在過去的幾十年中，癌癥一直是威脅人類健康和生命的主要殺手。據(jù)統(tǒng)計，2018年全球有1 810萬癌癥新發(fā)病例和960萬死亡病例，呈逐年上升的趨勢[1]。原發(fā)性肝細胞癌是中國第四大常見的惡性腫瘤，也是造成腫瘤相關死亡的第二大原因[2]。手術(shù)切除部分肝臟并輔以藥物治療是治療肝癌的首選方案。但由于原發(fā)性肝癌的高復發(fā)率和高轉(zhuǎn)移率，患者的預后較差，5年生存率低[3]。因此，尋找一種能夠有效降低原發(fā)性肝癌遷移率和復發(fā)率的輔助治療藥物有重要意義。

白花丹素（plumbagin,PLB），又名蘭雪醌，是從傳統(tǒng)植物藥白花丹（Plumbago zeylanica L.）中提取出的萘醌類天然活性成分，具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌和抗炎等多種藥理作用[4]。據(jù)文獻報道，白花丹素對肺癌[5]、胰腺癌[6]、前列腺癌[7]和肝癌[8]等多種癌細胞有明顯的抑制作用，然而其對多種肝癌細胞作用的分子途徑尚不明確。因此，本研究將白花丹素作用于人源和鼠源兩種肝癌細胞，探究其對肝癌細胞增殖、遷移和凋亡能力的影響，并揭示其作用分子機制，為白花丹素的臨床應用提供理論依據(jù)和潛在的作用靶點。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

白花丹素購自上海同田生物技術(shù)有限公司；噻唑藍（MTT溶液，純度≥98%）購自美國Sigma Aldrich公司；結(jié)晶紫染液購自沈陽科托化工有限公司；胎牛血清、胰酶、DMEM培養(yǎng)基和磷酸鹽緩沖液均購自美國Thermo Fisher公司；二甲基亞砜（DMSO溶液，純度≥98%）、甲醇（純度≥99%）、三羥甲基氨基鹽酸鹽（Tris）、甘氨酸（Glycine）和Tween 20均購自國藥集團化學試劑有限公司；兔抗鼠一抗和羊抗兔二抗購自美國Affinity Biosciences公司；蛋白提取試劑盒和Western Blotting試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；SMMC-7721人肝癌細胞和Hepa 1-6小鼠肝癌細胞屬于吉林大學微生物與生物藥學教研室；FL600型酶標儀購自美國Bio-Tek公司；FACSCanto流式細胞儀購自美國BD公司；TDZ4-WS低速臺式離心機購自長沙湘儀有限公司；GL-8813渦旋混合器購自瑞金儀器有限公司；DYY-6C型電泳儀購自北京六一生物科技有限公司；Tanon-4500凝膠成像系統(tǒng)購自上海天能科技有限公司；CKX53倒置相差顯微鏡購自日本奧林巴斯株式會社；Eppendorf移液器購自德國Eppendorf有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

SMMC-7721人肝癌細胞和Hepa 1-6小鼠肝癌細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 U/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、飽和濕度、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞長至90%時，以1:3的比例進行傳代，待細胞處于對數(shù)生長期時進行實驗。

1.3 MTT法檢測白花丹素對肝癌細胞的生長抑制率

分別取對數(shù)生長期的SMMC-7721人肝癌細胞和Hepa 1-6小鼠肝癌細胞以1 104個/孔接種于96孔板中，置于恒溫細胞培養(yǎng)箱中培育過夜。設置DMSO處理組為對照組、不加藥的空白組和不同濃度的白花丹素（2.5mol/L、5mol/L、10mol/L、20mol/L、40mol/L和60mol/L）處理組，每組平行設置4孔，處理24 h，加入MTT 20L，在37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育4 h，棄去培養(yǎng)液，加入DMSO150L，避光震蕩10 min，待藍紫色結(jié)晶充分溶解后，用酶標儀在570 nm處測量吸光度，并計算細胞存活率和抑制率，實驗重復3次。細胞抑制率公式為：

1.4 平板單克隆實驗檢測細胞增殖活力

分別取對數(shù)生長期的SMMC-7721人肝癌細胞和Hepa 1-6小鼠肝癌細胞，以1 103個/孔接種于6孔板中，加入不同濃度的白花丹素（2.5mol/L、5mol/L、10mol/L、20mol/L、40mol/L和60mol/L），以DMSO組為對照組，放入恒溫培養(yǎng)箱，培育2周，當6孔板中出現(xiàn)肉眼可見細胞克隆團時停止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液，PBS清洗3次，用4%多聚甲醛固定，加入結(jié)晶紫染液染色，顯微鏡計算細胞克隆數(shù)。

1.5 劃痕實驗檢測細胞遷移

分別取對數(shù)生長期的SMMC-7721人肝癌細胞和Hepa 1-6小鼠肝癌細胞以1 105個/孔接種于24孔板中，置于恒溫培養(yǎng)箱中培育過夜，待細胞長滿至90%孔底時，用滅菌的200L移液槍槍頭垂直于板，沿預先畫好的標記線進行劃痕，使用PBS洗滌3次，加入含有2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液及不同濃度的白花丹素（2.5mol/L、5mol/L、10mol/L、20mol/L、40mol/L和60mol/L），以DMSO組為對照組，放入恒溫培養(yǎng)箱。在0 h和48 h拍照，使用Image J軟件測量劃痕面積并計算劃痕愈合率。劃痕愈合率計算公式為：

愈合率=（0 h劃痕面積48 h劃痕面積）/0 h劃痕面積100%。

1.6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況

分別取對數(shù)生長期的SMMC-7721人肝癌細胞和Hepa 1-6小鼠肝癌細胞以5 105個/孔接種于6孔板中，并放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細胞貼壁后加入IC50濃度的白花丹素處理12 h和24 h，以DMSO為對照組。用細胞凋亡試劑盒中7-AAD和ANNEXINPE雙染色，流式細胞儀檢測細胞凋亡率，用FlowJo軟件分析數(shù)據(jù)。

1.7 Western blot檢測細胞凋亡通路相關蛋白的表達

分別取對數(shù)生長期的SMMC-7721人肝癌細胞和Hepa 1-6小鼠肝癌細胞，加入IC50濃度的白花丹素，處理6 h、12 h和24 h后提取總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。各組取20L等量蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后將蛋白條帶電轉(zhuǎn)到PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜以適量的TBST清洗，加入1%封閉液封閉1 h，加入兔抗鼠一抗（Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3、Caspase-3、Cleaved Caspase-9、Caspase-9、-actin，比例為1:2 000），4℃孵育過夜，次日早晨用TBST清洗PVDF膜3次，每次10 min，加入羊抗兔二抗（1:5 000），室溫下避光孵育1 h，TBST清洗3次。配制ECL顯影液，將PVDF膜浸泡在顯影液中孵育1 min，使用化學發(fā)光凝膠成像儀對目標蛋白條帶進行掃描成像，使用Image J軟件計算各組蛋白條帶灰度值，計算蛋白條帶相對表達量。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 白花丹素對細胞生長抑制率的影響

實驗結(jié)果顯示，與DMSO對照組相比，不同濃度白花丹素（2.5mol/L、5mol/L、10mol/L、20mol/L、40mol/L和60mol/L）處理24 h后，SMMC-7721生長抑制率分別為（4.27±3.43）%、（14.61±3.8）%、（20.73±6.52）%、（41.31±5.29）%、（61.07±4.86）%和（79.30±7.07）%，IC50為（26.78±6.22）mol/L（圖1A）；Hepa 1-6生長抑制率分別為（3.66±3.01）%、（14.17±8.3）%、（22.91±5.2）%、（48.15±6.52）%、（74.67±6.33）%和（87.08±7.56）%。IC50為（21.40±2.52）mol/L（圖1 B）。上述結(jié)果表明，白花丹素對細胞生長有明顯抑制作用（P＜0.05），且呈藥物濃度依賴性。

圖1 白花丹素對肝癌細胞生長的抑制作用Fig.1 The inhibitory effect of PLB on the viability of hepatoma cells

2.2 白花丹素對細胞增殖能力的影響

分別采用不同濃度白花丹素溶液處理SMMC-7721細胞和Hepa 1-6細胞，在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周后拍照（圖2A），比較集落形成率。如圖2B所示，SMMC-7721細胞被不同濃度白花丹素處理后，集落形成數(shù)為（320.67±18.52）個、（236.33±20.13）個、（164.33±15.87）個、（115.00±23.69）個、（79.33±15.67）個、（40.67±9.08）個和（23.33±3.08）個；Hepa1-6集落形成數(shù)為（361.67±25.88）個、（287.33±32.89）個、（220.67±19.95）個、（143.33±25.67）個、（87.33±15.87）個、（50.00±9.88）個和（23.33±8.31）個。因此，與對照組DMSO相比，藥物處理組的集落形成數(shù)明顯下降（P＜0.05），且隨藥物濃度的不斷增加，集落形成數(shù)不斷減少，表明白花丹素抑制了SMMC-7721和Hepa1-6細胞的增殖。

圖2 不同濃度白花丹素對細胞增殖能力的影響Fig.2 The effect of different concentration of PLB on the cell proliferation

2.3 白花丹素對肝癌細胞遷移率的影響

采用不同濃度白花丹素溶液分別處理SMMC7721細胞和Hepa 1-6細胞，在0 h，48 h進行拍照（圖3 A），比較細胞遷移率。如圖3 B所示，經(jīng)過不同濃度白花丹素處理后，SMMC-7721細胞遷移率為（83.01±2.12）%、（75.23±4.32）%、（62.35±3.87）%，（53.67±5.01）%、（14.78±2.13）%、（6.52±1.23）%和（4.71±1.21）%（圖3 B）；Hepa1-6細胞遷移率為（80.93±4.67）%、（76.23±4.35）%、（66.56±3.67）%、（52.14±5.23）%、（9.67±4.78）%、（7.96±3.96）%和（5.65±3.80）%（圖3 C）。以上結(jié)果表明，與對照組DMSO相比，處理組劃痕愈合逐漸減少，細胞遷移率顯著降低（P<0.05）。因此白花丹素有效抑制SMMC-7721和Hepa 1-6細胞遷移，細胞遷移率隨藥物處理濃度增加而減少。

圖3 白花丹素對細胞遷移率的抑制作用Fig.3 The inhibitory effect of plumbagin on cell mobility

2.4 白花丹素對肝癌細胞凋亡情況的影響

分別采用IC50濃度的白花丹素處理細胞SMMC-7721（26.78mol/L）和Hepa 1-6（21.4mol/L）12 h和24 h，以DMSO組為空白對照組，采用細胞凋亡檢測試劑7-AAD和ANNEXIN-PE處理細胞，之后采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況（圖4 A）。結(jié)果如圖4 B所示，在DMSO對照組中，SMMC-7721細胞凋亡率為（2.79±2.38）%，藥物處理12 h和24 h后細胞凋亡率分別為（22.16±4.58）%和（54.11±6.96）%。同樣，Hepa 1-6細胞對照組凋亡率為（3.76±2.38）%，藥物處理12 h和24 h后，細胞凋亡率分別為（20.20±3.05）%和（40.77±5.04）%。兩組細胞凋亡結(jié)果相似，以上結(jié)果顯示，與DMSO對照組相比，白花丹素處理組的細胞凋亡率顯著增高（P＜0.01），且凋亡率呈時間依賴性。

圖4 白花丹素對細胞凋亡率的影響Fig.4 Effect of PLB on apoptosis rate

2.5 白花丹素處理前后細胞凋亡相關蛋白表達變化

分別采用IC50濃度的白花丹素溶液處理細胞SMMC-7721（26.78mol/L）和細胞Hepa1-6（21.4mol/L）6 h，12 h和24 h后提取蛋白，用Western blot法測定各組蛋白表達情況。結(jié)果如圖5所示，與DMSO對照組相比，處理組Bcl-2表達量在6 h時，與對照組無統(tǒng)計學差異；在12 h和24 h時，Bcl-2表達量顯著下降，且與處理時間呈正相關關系（圖5 A）；SMMC-7721細胞Bax表達量、Caspase-3和Caspase-9激活量隨藥物處理時間延長而增加（圖5 A），提示在24 h時，SMMC-7721細胞凋亡過程最活躍。如圖5 B所示，Hepa 1-6細胞Bax表達量和Caspase-9激活量在處理12h時達到最大值，提示處理12h時，大量Hepa1-6細胞的凋亡通路被激活；Caspase-3激活量隨處理時間延長而增加，在24 h到達最大值（圖5 B），此時凋亡過程最活躍。

3 討論

原發(fā)性肝細胞癌（HCC）是我國最常見的惡性腫瘤之一，盡管多種傳統(tǒng)治療方法已應用于肝癌的臨床治療，但因其高轉(zhuǎn)移率及高復發(fā)率，患者常常預后不佳，5年生存率低于40%[9,10]。近年來，中醫(yī)中藥在癌癥治療中發(fā)揮了日益顯著的作用，中藥及其提取物能作用于癌細胞生命周期的多個階段，具有多靶點、毒副作用小及難產(chǎn)生耐藥性的特點[11]。白花丹素是我國傳統(tǒng)中藥白花丹的根部提取物，屬于天然有效活性成分，研究表明，白花丹素具有一定的抑制癌細胞增殖的作用[5-7]，是一種潛在的抗癌藥物。然而，肝癌發(fā)病機制不一、癌細胞類型復雜多樣，雖有報道稱白花丹素通過抑制基質(zhì)蛋白酶產(chǎn)生抑制HepG2肝癌細胞遷移[8]，但白花丹素對多種肝癌細胞的抗癌作用機制目前尚不明確，阻礙了其臨床廣泛應用。因此，深入研究白花丹素對多種肝癌細胞的作用效果及機制，對于進一步闡明并推動白花丹素的臨床抗肝癌應用具有重要的意義。本研究系統(tǒng)探究了白花丹素對兩種肝癌細胞（SMMC-7721和Hepa 1-6）增殖、遷移與凋亡的影響及其作用機制。

MTT實驗與平板單克隆形成實驗結(jié)果顯示，白花丹素對肝癌細胞生長和集落形成能力與藥物濃度呈正相關關系，說明白花丹素在體外有較強的抑制肝癌細胞增殖的能力。肝癌患者預后較差的重要原因之一就是癌細胞易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。因此，降低肝癌細胞的遷移能力，是預防其侵襲和轉(zhuǎn)移的有效手段。在本研究中，劃痕實驗結(jié)果顯示，白花丹素能有效抑制肝癌細胞的遷移能力，且遷移率隨藥物濃度升高而降低，遷移率最終降低至4.71%±1.21%（SMCC-7721）和5.65%±3.80%（Hepa 1-6），說明白花丹素在體外有較強的抑制肝癌細胞遷移的能力。

細胞凋亡是一種程序性的細胞死亡，當細胞所處的環(huán)境發(fā)生變化，如接觸化學藥物時，凋亡通路被激活，出現(xiàn)細胞凋亡[12,13]。有研究表明，藥物可通過內(nèi)源性線粒體途徑誘導細胞凋亡[14,15]，而線粒體介導的凋亡途徑主要依賴Bcl-2家族蛋白調(diào)控，其中包括凋亡抑制蛋白Bcl-2和凋亡誘導蛋白Bax[16-18]。當外源刺激激活Bax蛋白時，Bax作用于線粒體外膜，引起線粒體外膜通透化（Mitochondrial outer membrane permeabilization,MOMP），線粒體膜間隙的細胞色素C（cytochrome C）釋放進入胞質(zhì)，促使Caspase-3和Caspase-9激活[19,20]，激活的Caspase-9（Cleaved-Caspase-9）切割凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3，然后，活化的Caspase-3（Cleaved-Caspase-3）使聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase,PARP）裂解，最終導致細胞凋亡[21]，而抑制凋亡蛋白包括Bcl-2，能夠抑制MOMP作用，從而阻止這個過程[22]。本研究結(jié)果顯示，白花丹素上調(diào)了Bax蛋白表達水平，下調(diào)了Bcl-2蛋白表達水平；活化的Caspase蛋白與未活化的Caspase的比值隨處理時間延長而升高，表明Caspase-3和Caspase-9被激活，且激活程度與處理時間呈正相關關系，說明白花丹素在體外有較強的誘導細胞凋亡的能力，其誘導細胞凋亡的作用機制與內(nèi)源性線粒體凋亡途徑密切相關。

綜上所述，白花丹素可抑制肝癌細胞的增殖與遷移，并有效誘導細胞凋亡，且呈劑量-時間依賴性，同時，白花丹素可下調(diào)凋亡抑制蛋白Bcl-2表達水平，上調(diào)凋亡相關蛋白Bax的表達，并促進凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3的激活以促進細胞凋亡，因此，白花丹素具備成為有效治療肝細胞癌的藥物的潛能。本研究為白花丹素的臨床抗肝癌應用提供了理論基礎和實驗依據(jù)。