張靜遠(yuǎn)，繆發(fā)明，陳騰，李敏，扈榮良

非洲豬瘟實(shí)時(shí)熒光RPA診斷方法建立及應(yīng)用

1寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，銀川 750021；2軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事獸醫(yī)研究所，長春 130122

【】非洲豬瘟（African swine fever，ASF）自2018年首次暴發(fā)于我國沈陽后，迅速擴(kuò)散至全國，對(duì)我國養(yǎng)豬業(yè)造成了沉重打擊。研究針對(duì)其病原非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）建立一種快速核酸檢測(cè)技術(shù)，為及時(shí)發(fā)現(xiàn)、準(zhǔn)確處理ASF疫情提供一種快速診斷方法。針對(duì)ASFV保守的B646L（p72）基因，設(shè)計(jì)并篩選合適的引物、探針組合，利用基于重組酶-聚合酶擴(kuò)增（recombinase polymerase amplification，RPA）的實(shí)時(shí)熒光RPA方法，對(duì)反應(yīng)體系、反應(yīng)條件、樣品處理步驟等進(jìn)行優(yōu)化；利用質(zhì)控品，對(duì)檢測(cè)方法的特異性和靈敏度進(jìn)行評(píng)價(jià)。對(duì)1 009份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，并利用OIE推薦的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法（qPCR）和病毒分離，進(jìn)一步驗(yàn)證該方法的檢測(cè)結(jié)果。篩選得到一套合適的引物、探針，建立了針對(duì)ASFV p72基因的實(shí)時(shí)熒光RPA檢測(cè)方法，優(yōu)化后的反應(yīng)體系總體積為25 μL，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器上，最適反應(yīng)條件為39℃ 10 s，39℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間約20 min；室溫裂解法可取代傳統(tǒng)核酸提取方法作為本檢測(cè)的樣品處理方法；使用優(yōu)化后的條件，可在30 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)樣品處理、核酸擴(kuò)增和結(jié)果判定的整個(gè)過程，特異性評(píng)價(jià)結(jié)果顯示本方法對(duì)豬細(xì)小病毒（PPV）、偽狂犬病毒（PRV）、圓環(huán)病毒1型/2型（PCV1/2）、豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）樣品擴(kuò)增結(jié)果均為陰性；敏感性評(píng)價(jià)結(jié)果顯示本方法對(duì)基因I型、II型、IX型ASFV的模擬樣品均可檢出，對(duì)II型ASFV陽性模擬血樣品可檢測(cè)至10 拷貝/μL，對(duì)已知陽性臨床組織樣品可檢至1﹕103.0稀釋度，與OIE推薦的實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）方法的檢測(cè)靈敏度一致。通過對(duì)1 009份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)時(shí)熒光RPA診斷方法檢出17份陽性，其結(jié)果與qPCR方法完全一致；病毒分離獲得17份陽性培養(yǎng)物。建立的實(shí)時(shí)熒光RPA核酸檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便，耗時(shí)短，具有較高的靈敏度和特異性，為臨床提供了一種新型、簡(jiǎn)單、特異、快速診斷非洲豬瘟的方法。

非洲豬瘟病毒；重組酶聚合酶擴(kuò)增； 實(shí)時(shí)熒光RPA；核酸檢測(cè)；診斷技術(shù)

0 引言

【研究意義】非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的豬的一種高度接觸性急性出血性傳染病[1]，被OIE規(guī)定為需要通報(bào)的動(dòng)物疫病，我國明確該病為一類動(dòng)物傳染病。ASFV是非洲豬瘟病毒科（asfarviridae）非洲豬瘟病毒屬（asfivirus）的唯一成員[2]，是一種大的DNA病毒，其基因組全長170—190 kb，含160—175個(gè)ORFs。根據(jù)p72（B646L）基因序列的差異，可將ASFV毒株劃分為I—XXIV個(gè)基因型[3-4]。其中基因II型自2007年從東非地區(qū)傳入格魯吉亞的高加索地區(qū)后，廣泛傳播至東歐、西亞以及包括俄羅斯聯(lián)邦在內(nèi)的鄰國[5-6]，2018年8月確認(rèn)傳入中國[7-8]，后亞洲其他養(yǎng)豬國家也相繼報(bào)告疫情[9-10]。由于尚無有效疫苗進(jìn)行預(yù)防，針對(duì)非洲豬瘟疫情只能通過確診后采取撲殺和凈化的措施。雖然目前疫情態(tài)勢(shì)有所放緩，但病毒已在全國形成較大污染面。為盡可能有效降低該病對(duì)我國養(yǎng)豬業(yè)、國民經(jīng)濟(jì)和國際貿(mào)易的影響和損失，快速準(zhǔn)確的診斷仍是有效控制本病擴(kuò)散的必要手段?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】傳統(tǒng)的非洲豬瘟病原學(xué)診斷方法有紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)[11]、免疫組化[12]、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）[13]等，但這些方法耗時(shí)較久，操作復(fù)雜。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，核酸檢測(cè)技術(shù)逐漸建立：早在1995年，孫書華等[14]建立了針對(duì)ASFV的PCR方法，而LUO等[15]2017年建立的PCR方法檢測(cè)敏感性達(dá)60拷貝/反應(yīng)；KING等[16-17]報(bào)道的針對(duì)ASFV p72基因建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè)敏感性達(dá)10—100拷貝/反應(yīng)；JAMES等[18]報(bào)道的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）操作流程較PCR更為簡(jiǎn)便，檢測(cè)敏感度為330拷貝，最近WANG等[19]針對(duì)ASFV p10基因建立的LAMP可檢測(cè)至30拷貝/μL的質(zhì)粒，并適用于多個(gè)基因型。相比傳統(tǒng)方法，核酸檢測(cè)方法不再需要原代細(xì)胞、單克隆抗體等昂貴的材料，且具有較高的檢測(cè)敏感性，但這些常用的核酸擴(kuò)增方法在實(shí)際應(yīng)用中也存在一定缺陷，如樣品處理過程復(fù)雜，常需對(duì)核酸進(jìn)行多步純化提??；需要較高反應(yīng)溫度，常在60℃以上；同時(shí)整個(gè)檢測(cè)過程耗時(shí)較長，急需更為便捷的替代方式?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】針對(duì)II型ASFV的保守的B646L（p72）基因，利用重組酶聚合酶擴(kuò)增（recombinase polymerase amplification，RPA）技術(shù)，建立了一種實(shí)時(shí)熒光RPA（real-time RPA）核酸檢測(cè)方法；結(jié)合實(shí)際需要，針對(duì)RPA反應(yīng)體系和條件及核酸提取步驟進(jìn)行了優(yōu)化，簡(jiǎn)化操作程序，為臨床非洲豬瘟檢測(cè)提供便捷診斷工具。【擬解決的關(guān)鍵問題】篩選合適的引物探針，優(yōu)化反應(yīng)條件，簡(jiǎn)化樣品處理過程，為非洲豬瘟臨床診斷提供一種簡(jiǎn)單、特異、快速的方法。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2018年9月至2019年10月于軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事獸醫(yī)研究所進(jìn)行。

1.1 引物和探針

RPA引物和探針為軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)和篩選；PPV、PRV、PCV1/2、CSFV、PRRSV引物參考國家標(biāo)準(zhǔn)[20-24]；ASFV實(shí)時(shí)熒光定量PCR（即qPCR）引物參考OIE推薦[16]，序列為OIE-F：5′-CTGCTCATGGTATCAAT CTTATC GA-3′，OIE-R：5′-GATACCACAAGATCAGC CGT-3′，OIE-P:5′-FAM-CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG-TAMRA-3′；所有引物探針均由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 質(zhì)粒與樣品

1.2.1 pMD19-ASFV-P72質(zhì)粒是以pMD19T為載體，攜帶有ASFV SY18株B646L(p72)全基因的陽性質(zhì)粒，為軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。pUC-P72-I、pUC-P72-IX分別為攜帶基因I型和基因IX型ASFV P72基因的陽性質(zhì)粒，由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2.2 陰性抗凝血采集自健康豬，按照OIE推薦方法和國標(biāo)檢測(cè)方法檢測(cè)證明其不含ASFV、PPV、PRV、PCV1/2、CSFV、PRRSV。

1.2.3 ASFV臨床樣品為軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)室自2018年8月以來收集并保存的病料，共1 009份。主要為來源于豬場(chǎng)的臨床樣品及疫苗研究攻毒試驗(yàn)中的組織樣品，按照國家要求處理后冷凍保存。

1.2.4 特異性樣品：PPV、PRV、PCV1/2、CSFV、PRRSV樣品分別為軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)室分離保存的病毒株或購買的市售活疫苗。

1.2.5 敏感性樣品：M1為含pUC-P72-I質(zhì)粒的抗凝血，濃度為1×105拷貝/μL；M2為含pUC-P72-IX質(zhì)粒的抗凝血，濃度為1×105拷貝/μL；M3—M8為含人為加入的不同濃度（10倍梯度）pMD19-ASFV-P72質(zhì)粒的抗凝血，質(zhì)粒濃度分別為M3：1×105拷貝/μL至M8：1×100拷貝/μL。

1.3 試劑與儀器

RPA TwistAmp? exo試劑盒購自TwistDx，核酸提取試劑盒（離心柱法）購自Axygen，DNA純化試劑盒購自碧云天，磁珠法DNA提取試劑盒購自天津美菱生物，Lysis1（主成分為NaOH溶液）、Lysis2（主成分為Tris-HCl溶液）及FITC的p30單抗為實(shí)驗(yàn)室制備。Eco實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器，購自Illumina。

1.4 引物探針的篩選

根據(jù)p72基因序列設(shè)計(jì)篩選3套引物-探針（分別命名為Pa，Pb，Pc），使用TwistAmp? exo試劑盒，根據(jù)表1配制實(shí)時(shí)熒光RPA（下稱實(shí)時(shí)RPA）反應(yīng)體系，將1—5號(hào)成分預(yù)先混合后，再加入凍干管中，充分溶解后等分至兩個(gè)反應(yīng)管，再依次加入1 μL作為模板的陽性質(zhì)?；?d水，1.25 μL MgOAc。最終反應(yīng)體積為25 μL。設(shè)置熒光定量PCR儀的程序。步驟1：39℃ 10 s，步驟2：39℃ 20 s，并在步驟2收集熒光信號(hào)；如此反應(yīng)50個(gè)循環(huán)（約25 min）后，根據(jù)結(jié)果篩選最佳引物-探針組合。

表1 實(shí)時(shí)RPA反應(yīng)體系

1.5 反應(yīng)條件優(yōu)化

1.5.1 反應(yīng)時(shí)間和溫度優(yōu)化 將pMD19-ASFV-P72質(zhì)粒稀釋至濃度為1×106拷貝/μL、1×103拷貝/μL，作為強(qiáng)陽性、弱陽性對(duì)照樣品。分別在33℃、36℃、39℃、42℃恒溫條件下，用熒光定量PCR儀對(duì)陰性（4d水）、強(qiáng)陽性、弱陽性對(duì)照進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程序設(shè)置同1.4，50個(gè)循環(huán)（約25 min），觀察擴(kuò)增曲線。同時(shí)以5、10、15、20、25 min為節(jié)點(diǎn)，觀察擴(kuò)增曲線。

1.5.2 反應(yīng)體系優(yōu)化 為盡可能減少操作步驟，提高操作便捷性，對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行調(diào)整，比較兩種反應(yīng)體系的檢測(cè)效果。①體系A(chǔ)：配制與操作同1.4；②體系B（表2）：將工作濃度的引物F、引物R、探針P及Rehydration buffer、4d水按照2.1﹕2.1﹕0.6﹕29.5﹕5.7的比例混合，配制成Rehydration Mix；同時(shí)將濃度為280 mmol·L-1的MgOAc與水按照2.5?5.5的比例配制成稀釋后的MgOAc-B。檢測(cè)時(shí)向每個(gè)RPA凍干管加入40 μL Rehydration Mix，充分溶解混勻后分裝至2個(gè)反應(yīng)管，每管20 μL，即為1個(gè)反應(yīng)體系。向反應(yīng)管中依次加入1 μL待檢模板，4 μL MgOAc-B。放入熒光定量PCR儀中，程序設(shè)置同體系A(chǔ)。③使用體系A(chǔ)、B檢測(cè)陰性、強(qiáng)陽性、弱陽性對(duì)照（同1.5.1）。比較檢測(cè)結(jié)果。

表2 實(shí)時(shí)RPA反應(yīng)優(yōu)化體系

1.6 核酸提取方法優(yōu)化

將pMD19-ASFV-P72質(zhì)粒加入陰性抗凝血中，制備成含1×106拷貝/μL、1×103拷貝/μL的模擬強(qiáng)陽性、弱陽性臨床樣品，同時(shí)設(shè)陰性抗凝血為陰性臨床樣品。裂解法和煮沸法均為基于傳統(tǒng)DNA提取法改良的適用于多類型樣品的核酸提取方法，其操作步驟如下：裂解法—將待檢樣品與Lysis 1等體積混勻后，室溫放置10 min，離心后的上清即為粗提核酸；煮沸法—將待檢樣品與Lysis 2等體積混合，煮沸5 min后4℃放置5 min，離心后的上清即為粗提核酸。分別以柱提取法、磁珠法、裂解法、煮沸法，對(duì)模擬的陰性、強(qiáng)陽性、弱陽性臨床樣品進(jìn)行核酸提取，同時(shí)設(shè)不處理原液對(duì)照，按優(yōu)化后的反應(yīng)體系和條件進(jìn)行實(shí)時(shí)RPA反應(yīng)。比較檢測(cè)結(jié)果。

1.7 實(shí)時(shí)熒光RPA診斷方法的特異性

使用優(yōu)化后的實(shí)時(shí)RPA體系和反應(yīng)條件，對(duì)特異性樣品進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)與OIE推薦的qPCR方法進(jìn)行比較。

1.8 實(shí)時(shí)熒光RPA診斷方法的敏感性和靈敏度

使用優(yōu)化后的實(shí)時(shí)RPA體系和反應(yīng)條件，對(duì)敏感性樣品M1—M8進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)與OIE推薦的qPCR方法進(jìn)行比較。此外，取已知ASFV陽性的脾臟、淋巴結(jié)、血清樣品，分別進(jìn)行10、100、1 000、10 000倍稀釋后，使用實(shí)時(shí)RPA和qPCR方法進(jìn)行檢測(cè)。通過以上兩種指標(biāo)，評(píng)價(jià)實(shí)時(shí)RPA檢測(cè)方法的對(duì)不同基因型ASFV的檢測(cè)敏感性及檢測(cè)靈敏度。

1.9 實(shí)時(shí)熒光RPA診斷方法對(duì)臨床樣品的檢測(cè)

使用優(yōu)化后的實(shí)時(shí)RPA體系和反應(yīng)條件，針對(duì)實(shí)驗(yàn)室采集的來源于豬場(chǎng)的臨床樣品和疫苗研究攻毒試驗(yàn)中的組織樣品共1 009份分別進(jìn)行實(shí)時(shí)RPA檢測(cè)，并與實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果比較。利用病毒分離方法對(duì)檢出的陽性樣品進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證：將研磨后的陽性樣品接種單層原代肺泡巨噬細(xì)胞（PAM），37℃孵育1 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)3 d后，觀察細(xì)胞病變。同時(shí)使用FITC標(biāo)記的p30單抗進(jìn)行免疫熒光（IFA），根據(jù)熒光的有無判定結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 引物探針的篩選結(jié)果

如圖1所示，3組引物探針對(duì)目的樣品擴(kuò)增后，陽性樣品均出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，陰性樣品無擴(kuò)增。但3組引物探針中，Pa組強(qiáng)陽性和弱陽性樣品均起峰早，熒光信號(hào)強(qiáng)，故選擇Pa組為最佳引物探針組合。確定的引物探針序列及相應(yīng)標(biāo)記如表3。

Pa：組合a；Pb：組合b；Pc：組合c；1：強(qiáng)陽性對(duì)照；2：弱陽性對(duì)照；3：空白對(duì)照

表3 實(shí)時(shí)RPA引物探針序列

2.2 反應(yīng)條件優(yōu)化

2.2.1 反應(yīng)溫度與時(shí)間的優(yōu)化 結(jié)果如圖2所示，在33℃、36℃、39℃、42℃條件下，陰性對(duì)照樣品均未出現(xiàn)擴(kuò)增，強(qiáng)陽性對(duì)照樣品均可在10 min內(nèi)（Ct值＜20）呈現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線。而對(duì)于拷貝數(shù)較低的弱陽性樣品，在39℃、42℃反應(yīng)時(shí)，其擴(kuò)增曲線起峰較早，當(dāng)反應(yīng)溫度降低，在36℃或33℃條件下，弱陽性對(duì)照樣品至反應(yīng)15 min后才出現(xiàn)擴(kuò)增曲線（Ct值30—45），同時(shí)熒光信號(hào)較低。以上結(jié)果顯示在39℃、42℃條件下，實(shí)時(shí)RPA的擴(kuò)增效率較高。結(jié)合試劑盒關(guān)鍵酶的最佳活性溫度，考慮實(shí)際操作的可行性，選擇39℃為最佳反應(yīng)溫度。而就反應(yīng)時(shí)間來看，39℃條件下，弱陽性樣品在反應(yīng)15 min內(nèi)（約30循環(huán)）即出現(xiàn)明顯擴(kuò)增，說明本實(shí)時(shí)RPA在15 min內(nèi)即可檢測(cè)至103拷貝/μL的樣品。為保證后續(xù)試驗(yàn)的靈敏度和可重復(fù)性，最終選擇40循環(huán)、20 min為實(shí)時(shí)RPA的反應(yīng)時(shí)間。

A 33℃；B 36℃；C 39℃；D 42℃

2.2.2 反應(yīng)體系優(yōu)化 優(yōu)化前的反應(yīng)體系A(chǔ)與使用了Rehydration mix的體系B相比，在檢測(cè)強(qiáng)陽性、弱陽性對(duì)照樣品均出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，而陰性對(duì)照無擴(kuò)增曲線，說明兩種反應(yīng)體系對(duì)本試驗(yàn)中的陽性樣品均可檢出（圖3）?？紤]實(shí)際應(yīng)用的便捷性及經(jīng)濟(jì)性原則，最終選擇反應(yīng)體系B作為本實(shí)時(shí)RPA試劑盒的反應(yīng)體系。

2.3 核酸提取方法的優(yōu)化

模擬的臨床血樣品經(jīng)不同核酸提取方法處理后，進(jìn)行實(shí)時(shí)RPA擴(kuò)增（表4），結(jié)果顯示，強(qiáng)陽性血樣經(jīng)不同方法處理或不處理時(shí)，均可在10 min內(nèi)出現(xiàn)擴(kuò)增曲線（Ct值＜20），陰性樣品均無擴(kuò)增（無Ct值）；但是對(duì)弱陽性樣品，在不作處理時(shí)起峰較晚，在反應(yīng)15 min后才出現(xiàn)擴(kuò)增曲線；而其他4種方法處理后的性樣品均能在15 min內(nèi)出現(xiàn)擴(kuò)增信號(hào)（Ct值＜30）。以上結(jié)果說明，雖然在不處理的條件下RPA也可實(shí)現(xiàn)對(duì)弱陽性樣品的擴(kuò)增，但血液成分一定程度影響了擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行。由表4可見，在幾種可選的提取方法中，裂解法僅需加入一種裂解液，并在室溫條件即可進(jìn)行，成分單一，步驟簡(jiǎn)單，減少了操作中污染的風(fēng)險(xiǎn)，節(jié)省操作時(shí)間，最終選擇該方法作為實(shí)際應(yīng)用的核酸提取方法。

A：優(yōu)化前的反應(yīng)體系The amplification system before optimization；B：優(yōu)化后的反應(yīng)體系The amplification system after optimization

2.4 實(shí)時(shí)熒光RPA診斷方法的特異性

使用優(yōu)化后的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，對(duì)建立的實(shí)時(shí)RPA檢測(cè)方法進(jìn)行特異性評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，本實(shí)時(shí)RPA對(duì)PPV、PRV、PCV1/2、CSFV、PRRSV樣品檢測(cè)均為陰性；同時(shí)陰陽性對(duì)照成立。其結(jié)果與qPCR結(jié)果一致（圖4）。說明本方法特異性良好。

表4 不同樣品處理方法比較

RT：室溫Room temperature；N：陰性對(duì)照Negative Control；WP：弱陽性對(duì)照Weak positive control；SP：強(qiáng)陽性對(duì)照Strong positive control； /：無Ct值 No Ct value

A實(shí)時(shí)RPA對(duì)特異性樣品檢測(cè)結(jié)果Results of specific samples tested by real-time RPA；B qPCR對(duì)特異性樣品檢測(cè)結(jié)果Results of specific samples tested by qPCR。1：陽性對(duì)照 Positive Control；2：陰性對(duì)照 Negative Control；3：PPV；4：PRV；5：PCV1/2；6：CSFV；7：PRRSV

2.5 實(shí)時(shí)熒光RPA診斷方法的敏感性及靈敏度

使用實(shí)時(shí)RPA檢測(cè)方法分別對(duì)敏感性樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，陰、陽性對(duì)照成立，基因I型、基因IX型樣品M1、M2均呈陽性；在含不同濃度的ASFV基因II型質(zhì)粒的樣品中，除了約含1拷貝/μL的樣品呈現(xiàn)陰性外，10拷貝/μL以上濃度的樣品檢測(cè)結(jié)果均為陽性。說明實(shí)時(shí)RPA對(duì)基因I型、II型、IX 型的陽性樣品均可檢出，最低檢測(cè)限為10拷貝/μL，同qPCR方法的靈敏度一致（圖5）。而兩種方法對(duì)不同稀釋的脾、淋巴結(jié)、血清等臨床陽性樣品均可檢測(cè)至1﹕103.0稀釋度（表5）。

2.6 實(shí)時(shí)熒光RPA診斷方法對(duì)臨床樣品的檢測(cè)

分別使用本研究建立的實(shí)時(shí)RPA方法與OIE推薦的qPCR方法對(duì)本研究室收集和保存的1 009份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，實(shí)時(shí)RPA方法共檢測(cè)出17份陽性樣品，992份陰性樣品，與qPCR結(jié)果完全一致，符合率100%。將檢測(cè)為陽性的樣品接種PAM細(xì)胞，72 h后均觀察到典型的細(xì)胞病變，感染細(xì)胞折光率降低，少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)胞內(nèi)空泡，體積增大，培養(yǎng)基pH下降。以FITC標(biāo)記的p30蛋白單抗做IFA，感染細(xì)胞出現(xiàn)特異性熒光，而對(duì)照正常細(xì)胞未觀察到如上現(xiàn)象（圖6）。17份陽性樣品的檢測(cè)結(jié)果見表6，兩種方法的操作流程比較如表7。

A：實(shí)時(shí)RPA對(duì)敏感性樣品檢測(cè)結(jié)果Results for sensitivity samples tested by real-time RPA；B：qPCR對(duì)敏感性樣品檢測(cè)結(jié)果Results for sensitivity samples tested by qPCR。1：陽性對(duì)照Positive Control；2：陰性對(duì)照 Negative Control；3—10：M1—M8

表5 實(shí)時(shí)RPA和qPCR對(duì)不同稀釋的臨床樣品檢測(cè)

“/”：無Ct值 No Ct value；“+”:陽性 Positive；“-”：陰性 Negative

3 討論

非洲豬瘟自1921年首次發(fā)現(xiàn)于非洲以來，已在非洲、歐洲、南美洲、亞洲、加勒比海地區(qū)等數(shù)十個(gè)國家和地區(qū)發(fā)生過流行，部分國家和地區(qū)通過撲殺和凈化的方式，已經(jīng)完成對(duì)該病的消除[25]。2018年8月，我國確認(rèn)了首例家豬非洲豬瘟疫情。由于非洲豬瘟臨床癥狀與經(jīng)典豬瘟等其他出血性疾病癥狀和病變極為相似，急性型、亞急性型和慢性型在臨床中較難區(qū)分，因此，建立及時(shí)、快速、準(zhǔn)確的診斷方法是精準(zhǔn)清除非洲豬瘟必不可少的手段。

A：正常PAMs Normal PAMs；B：出現(xiàn)病變的PAMs Infected PAMs with CPE；C：正常PAMs免疫熒光IFA of normal PAMs；D：感染PAMs免疫熒光 IFA of infected PAMs

表6 陽性臨床樣品檢測(cè)結(jié)果匯總

“+”：陽性 Positive；“-”：陰性 Negative

表7 實(shí)時(shí)RPA和實(shí)時(shí)PCR操作流程比較

RPA技術(shù)是由英國公司TwistDx Inc開發(fā)的一種可以替代傳統(tǒng)PCR的新型核酸檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)主要依賴重組酶、單鏈結(jié)合蛋白（SSB）和鏈置換DNA聚合酶[26]；將exo探針技術(shù)與核酸外切酶III結(jié)合起來，即可實(shí)現(xiàn)類似熒光定量PCR儀的實(shí)時(shí)讀取，同時(shí)對(duì)儀器的要求更低，可實(shí)現(xiàn)在37—42℃條件下等溫快速擴(kuò)增，目前也已應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域[27-28]。RPA分析的關(guān)鍵在于擴(kuò)增引物和探針設(shè)計(jì)。一般認(rèn)為，RPA引物應(yīng)比一般PCR引物長，達(dá)30—38個(gè)堿基， RPA引物過短會(huì)降低重組率，影響擴(kuò)增速度和檢測(cè)靈敏度，同時(shí)需要多次條件摸索進(jìn)行優(yōu)化[29-30]。但在本研究引物篩選時(shí)發(fā)現(xiàn)，RPA擴(kuò)增效率與多種因素有關(guān)，引物過長更易導(dǎo)致非特異性增加，縮短引物長度可在一定程度減少非特異反應(yīng)的產(chǎn)生，從而保證檢測(cè)的特異性。目前已有將較短的引物應(yīng)用于RPA技術(shù)的報(bào)道[31]。最終，本研究通過多組引物的篩選和測(cè)定，明確了一組較優(yōu)引物對(duì)和探針，具有較好的擴(kuò)增效果。

在針對(duì)臨床樣品檢測(cè)時(shí)，待檢樣品除血清、咽拭子等成分較為簡(jiǎn)單的體液以外，還常見組織、全血液、飼料等樣品。當(dāng)進(jìn)行傳統(tǒng)PCR、熒光定量PCR時(shí)，樣品中的雜蛋白可顯著抑制PCR反應(yīng)活性，因此通常需對(duì)樣品中的核酸進(jìn)行提取純化后再作為擴(kuò)增模板。但常規(guī)的柱提取法提取核酸過程成本高，耗時(shí)久，同時(shí)也增加了環(huán)境中或其他樣品交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)，易造成假陽性結(jié)果。磁珠法相對(duì)于層析柱提取法更為便捷，不依賴離心機(jī)，但同樣需要吸附、淋洗和洗脫等多步操作。RPA技術(shù)是基于常溫?cái)U(kuò)增的一種技術(shù)，其反應(yīng)中的關(guān)鍵酶對(duì)反應(yīng)微環(huán)境的耐受性較高[29]，同時(shí)，盡可能去除樣品中的雜蛋白無疑可提高擴(kuò)增反應(yīng)的靈敏性和特異性。因此，嘗試對(duì)樣品進(jìn)行不處理或粗處理的方法，以期在保證準(zhǔn)確性的前提下，減少操作步驟，縮短操作時(shí)間。結(jié)果證實(shí)，采用本課題組摸索的室溫裂解法提取后的產(chǎn)物可直接用于RPA擴(kuò)增，該方法不僅大大降低了樣品處理的時(shí)間和成本，也提高了檢測(cè)的敏感性和特異性。

前期報(bào)道了針對(duì)p72基因建立的RPA-LFD檢測(cè)方法[32]，該方法可在10 min實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸的擴(kuò)增，不需要特殊的儀器，僅需水浴條件即可完成，適合于臨床現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。但該方法在結(jié)果讀取時(shí)需打開擴(kuò)增管，將產(chǎn)物滴加到試紙條上，這一步驟容易產(chǎn)生氣溶膠，增加了擴(kuò)增產(chǎn)物污染的風(fēng)險(xiǎn)，因此其應(yīng)用范圍僅限于新發(fā)病豬場(chǎng)，在范圍上受到一定限制。本研究建立的實(shí)時(shí)熒光RPA檢測(cè)方法，對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器的兼容性強(qiáng)，既可采用配套的便攜式恒溫實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)儀，也可采用目前基層實(shí)驗(yàn)室或中大型養(yǎng)殖場(chǎng)普遍采用的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，使用者可根據(jù)自身?xiàng)l件選擇合適的儀器。同時(shí)，本方法給出了可在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RPA擴(kuò)增操作程序和判定標(biāo)準(zhǔn)，可固定條件，作為ASF臨床診斷的優(yōu)先選擇方法。

4 結(jié)論

建立了一種改進(jìn)的實(shí)時(shí)熒光RPA檢測(cè)方法，可在30 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)核酸提取、核酸擴(kuò)增和結(jié)果判定，檢測(cè)靈敏度達(dá)10拷貝/μL，對(duì)臨床樣品的檢測(cè)證實(shí)與OIE推薦的實(shí)時(shí)熒光定量方法、病毒分離具有完全的一致性。該方法操作便捷、耗時(shí)短、對(duì)儀器設(shè)備兼容性強(qiáng)，為ASF臨床快速診斷提供了一種新的實(shí)用方法。

[1] DIXON L K, STAHL K, JORI F, VIAL L, PFEIFFER D U. African swine fever epidemiology and control. Annual Review of Animal Biosciences, 2020, 8: 221-246. doi:10.1146/annurev-animal-021419- 083741.

[2] DIXON L, SUN H, ROBERTS H. African swine fever. Antiviral Research, 2019, 165:34-41. doi:10.1016/j.antiviral.2019.02.018.

[3] QUEMBO C J, JORI F, VOSLOO W, HEATH L. Genetic characterization of African swine fever virus isolates from soft ticks at the wildlife/domestic interface in Mozambique and identification of a novel genotype. Transboundary and Emerging Diseases, 2018, 65(2): 420-431. doi:10.1111/tbed.12700.

[4] BASTOS A D S, PENRITH M L, CRUCIèRE C, EDRICH J L, HUTCHINGS G, ROGER F, COUACY-HYMANN E, R THOMSON G. Genotyping field strains of African swine fever virus by partial p72 gene characterisation. Archives of Virology, 2003, 148(4): 693-706. doi:10.1007/s00705-002-0946-8.

[5] GARIGLIANY M, DESMECHT D, TIGNON M, CASSART D, LESENFANT C, PATERNOSTRE J, VOLPE R, CAY A B, VAN DEN BERG T, LINDEN A. Phylogeographic analysis of African swine fever virus, western Europe, 2018. Emerging Infectious Diseases, 2019, 25(1): 184-186. doi:10.3201/eid2501.181535.

[6] PEJSAK Z, TRUSZCZY?SKI M, NIEMCZUK K, KOZAK E, MARKOWSKA-DANIEL I. Epidemiology of African Swine Fever in Poland since the detection of the first case. Polish Journal of Veterinary Sciences, 2014, 17(4): 665-672. DOI:10.2478/pjvs-2014- 0097.

[7] ZHOU X, LI N, LUO Y, LIU Y, MIAO F, CHEN T, ZHANG S, CAO P, LI X, TIAN K, QIU H J, HU R. Emergence of African swine fever in China, 2018. Transboundary and Emerging Diseases, 2018, 65(6): 1482-1484. doi:10.1111/tbed.12989.

[8] GE S, LI J, FAN X, LIU F, LI L, WANG Q, REN W, BAO J, LIU C, WANG H, LIU Y, ZHANG Y, XU T, WU X, WANG Z. Molecular characterization of African swine fever virus, China, 2018. Emerging Infectious Diseases, 2018, 24(11): 2131-2133. doi:10.3201/eid2411. 181274.

[9] LE V P, JEONG D G, YOON S W, KWON H M, TRINH T B N, NGUYEN T L, BUI T T N, OH J, KIM J B, CHEONG K M, VAN TUYEN N, BAE E, VU T T H, YEOM M, NA W, SONG D. Outbreak of African swine fever, Vietnam, 2019. Emerging Infectious Diseases, 2019, 25(7): 1433-1435. doi:10.3201/eid2507.190303.

[10] KIM H J, CHO K H, LEE S K, KIM D Y, NAH J J, KIM H J, KIM H J, HWANG J Y, SOHN H J, CHOI J G, KANG H E, KIM Y J. Outbreak of African swine fever in South Korea, 2019. Transboundary and Emerging Diseases, 2020, 67(2): 473-475. doi:10.1111/tbed. 13483.

[11] ENJUANES L, CARRASCOSA A, MORENO M, VI?UELA E. Titration of African swine fever (ASF) virus. The Journal of General virology, 1976, 32(3): 471-477.DOI:10.1099/0022-1317-32-3-471.

[12] PéREZ J, RODRíGUEZ F, FERNáNDEZ A, MARTíN DE LAS MULAS J, GóMEZ-VILLAMANDOS J, SIERRA M. Detection of African swine fever virus protein VP73 in tissues of experimentally and naturally infected pigs. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation: Official Publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc, 1994, 6(3): 360-365. doi:10.1177/104063879400600314.

[13] VIDAL M I, STIENE M, HENKEL J, BILITEWSKI U, COSTA J V, OLIVA A G. A solid-phase enzyme linked immunosorbent assay using monoclonal antibodies, for the detection of African swine fever virus antigens and antibodies. Journal of Virological Methods, 1997, 66(2): 211-218. doi:10.1016/s0166-0934(97)00059-1.

[14] 孫書華, 孫淑芳, 蔣正軍, 吳時(shí)友.多聚酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測(cè)非洲豬瘟. 中國獸醫(yī)科技, 1995, 11(25): 29. doi: 10.16656/j.issn.1673- 4696.1995.11.016.

SUN S H, SUN S F, JIANG Z J, WU S Y.Detection of African swine fever by polymerase chain reaction. Chinese Journal of Veterinary Science and Technology, 1995, 11(25): 29. doi: 10.16656/j.issn. 1673-4696.1995.11.016. (in Chinese)

[15] LUO Y Z, ATIM S A, SHAO L N, AYEBAZIBWE C, SUN Y, LIU Y, JI S W, MENG X Y, LI S, LI Y F, MASEMBE C, ST?HL K, WIDéN F, LIU L H, QIU H J. Development of an updated PCR assay for detection of African swine fever virus. Archives of Virology, 2017, 162(1): 191-199. doi:10.1007/s00705-016-3069-3.

[16] KING D P, REID S M, HUTCHINGS G H, GRIERSON S S, WILKINSON P J, DIXON L K, BASTOS A D, DREW T W. Development of a TaqMan PCR assay with internal amplification control for the detection of African swine fever virus. Journal of Virological Methods, 2003, 107(1): 53-61. doi:10.1016/s0166-0934 (02)00189-1.

[17] FERNáNDEZ-PINERO J, GALLARDO C, ELIZALDE M, ROBLES A, GóMEZ C, BISHOP R, HEATH L, COUACY-HYMANN E, FASINA F O, PELAYO V, SOLER A, ARIAS M. Molecular diagnosis of African Swine Fever by a new real-time PCR using universal probe library. Veterinary Medicine and Science, 2013, 60(1): 48-58. doi:10.1111/j.1865-1682.2012.01317.x.

[18] JAMES H E, EBERT K, MCGONIGLE R, REID S M, BOONHAM N, TOMLINSON J A, HUTCHINGS G H, DENYER M, OURA C A, DUKES J P, KING D P. Detection of African swine fever virus by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods, 2010, 164(1/2): 68-74. doi:10.1016/j.jviromet.2009.11.034.

[19] WANG D, YU J, WANG Y, ZHANG M, LI P, LIU M, LIU Y. Development of a real-time loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay and visual LAMP assay for detection of African swine fever virus (ASFV). Journal of Virological Methods, 2020, 276: 13775. DOI:10.1016/j.jviromet.2019.113775

[20] 全國動(dòng)物衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì). 2019, 偽狂犬病診斷方法GB/T 18641-2018.

National Technical Standardization Committee of Animal Health. 2019, Diagnostic method for pseudorabies GB/T 18641-2018. (in Chinese)

[21] 全國動(dòng)物防疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì).2011, 豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法GB/T 27540-2011.

National Technical Standardization Committee of Animal Epidemic Prevention. 2011, Method of the real-time QPCR for the detection of classical swine fever virus GB/T 27540-2011. (in Chinese)

[22] 全國動(dòng)物防疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì).2008, 豬圓環(huán)病毒聚合酶鏈反應(yīng)試驗(yàn)方法GB/T 21674-2008.

National Technical Standardization Committee of Animal Epidemic Prevention. 2008, Detecting porcine circovirus with polymerase chain reaction GB/T 21674-2008. (in Chinese)

[23] 全國動(dòng)物防疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì).2011, 鑒別豬繁殖與呼吸綜合征病毒高致病性與經(jīng)典毒株復(fù)合RT-PCR方法 GB/T 27517-2011 .

National Technical Standardization Committee of Animal Epidemic Prevention. 2011, A multiplex QPCR method to differentiate the highly pathogenic and classical porcine reproductive and respiratory syndrome virus GB/T 27517-2011. (in Chinese)

[24] 國家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督委員會(huì).2007, 豬細(xì)小病毒病聚合酶鏈反應(yīng)操作規(guī)程SN/T 1874-2007.

Certification and Accreditation Administration of the P.R.C. 2007, Protocol of polymerase chain reaction for porcine parvovirus SN/T 1874-2007. (in Chinese)

[25] COSTARD S, WIELAND B, DE GLANVILLE W, JORI F, ROWLANDS R, VOSLOO W, ROGER F, PFEIFFER D, DIXON L. African swine fever: How can global spread be prevented?Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B, Biological Sciences, 2009, 364(1530): 2683-2696.DOI:10.1098/rstb. 2009.0098.

[26] PIEPENBURG O, WILLIAMS C H, STEMPLE D L, ARMES N A. DNA detection using recombination proteins. PLoS Biology, 2006, 4(7): e204. doi:10.1371/journal.pbio.0040204.

[27] CHAO C C, BELINSKAYA T, ZHANG Z, CHING W M. Development of recombinase polymerase amplification assays for detection ofor. PLoS Neglected Tropical Diseases, 2015, 9(7): e0003884. doi:10.1371/ journal.pntd.0003884.

[28] LI Y, LI L, FAN X, ZOU Y, ZHANG Y, WANG Q, SUN C, PAN S, WU X, WANG Z. Development of real-time reverse transcription recombinase polymerase amplification (RPA) for rapid detection of peste des petits ruminants virus in clinical samples and its comparison with real-time PCR test. Scientific Reports, 2018, 8(1): 17760. doi:10.1038/s41598-018-35636-5.

[29] JAMES A, MACDONALD J. Recombinase polymerase amplification: Emergence as a critical molecular technology for rapid, low-resource diagnostics. Expert Review of Molecular Diagnostics, 2015, 15(11): 1475-1489. doi:10.1586/14737159.2015.1090877.

[30] LIU X Q, YAN Q Y, HUANG J F, CHEN J, GUO Z Y, LIU Z D, CAI L, LI R S, WANG Y, YANG G W, LAN Q X. Influence of design probe and sequence mismatches on the efficiency of fluorescent RPA. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2019, 35(6): 95. doi:10.1007/s11274-019-2620-2.

[31] WU L, YE L, WANG Z, CUI Y, WANG J. Utilization of recombinase polymerase amplification combined with a lateral flow strip for detection ofbeihaiensis in the oyster.Parasites & Vectors, 2019, 12(1): 360. doi:10.1186/s13071-019-3624-3.

[32] MIAO F, ZHANG J, LI N, CHEN T, WANG L, ZHANG F, MI L, ZHANG J, WANG S, WANG Y, ZHOU X, ZHANG Y, LI M, ZHANG S, HU R. Rapid and sensitive recombinase polymerase amplification combined with lateral flow strip for detecting African swine fever virus. Frontiers in Microbiology, 2019, 10: 1004. doi:10.3389/fmicb.2019.01004.

Development and Application of a Real-Time Fluorescent RPA Diagnostic Assay for African Swine Fever

1School of Life Sciences, Ningxia University, Yinchuan 750021;2Veterinary Research Institute, Institute of Military Medical Sciences, Academy of Military Sciences, Changchun 130122

【】After the first outbreak of African Swine Fever (ASF) in Shenyang, China in 2018, it has rapidly spread to the whole country, severely hitting the pig industry. This study aimed to establish an optimized nucleic acid testing technique for African Swine Fever Virus (ASFV), so as to provide a fast and accurate method for early diagnosis and accurate treatment of ASF outbreaks. 【】 Appropriate primers and probes were designed and screened for the conserved gene B646L (p72) of ASFV, and a real-time fluorescent RPA assay based on recombinase polymerase amplification (RPA) was established. The reaction system, reaction conditions and sample treatment steps were optimized. Specificity and sensitivity of the optimized detection method were evaluated by using quality controls. In addition, 1 009 clinical samples were tested by the optimized real-time RPA, after which the results were further confirmed by the real time PCR recommended by OIE and through virus isolation. 【】 A pair of primers-probe combinations was successfully screened, and a real-time fluorescence RPA for detection of ASFV p72 gene was developed. The total volume of optimized reaction system was 25 μL. The reaction conditions were set as 39℃ 10 s, 39℃ 20 s, 40 cycles on the fluorescence quantitative PCR instrument, and the whole amplification reaction needs about 20 min. The analysis method at room temperature could replace the traditional nucleic acid extraction method, thus the whole process of sample treatment, nucleic acid amplification and result reading could be completed in 30 min. Specific evaluation showed that the real-time RPA was negative for porcine parvovirus (PPV), pseudorabies virus (PRV), circovirus type1/2 (PCV1/2), classical swine fever virus (CSFV) and porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV); the sensitivity evaluation showed that the assay could detect type I/II/IX ASFV samples, and could detect 10 copies/μL of ASFV positive simulated blood samples and 1﹕103.0dilution of positive clinical samples, which was as sensitive as the OIE-recommended qPCR method. Seventeen out of 1 009 clinical samples were tested positive using the real-time RPA, with the same results as by qPCR, 17 positive cultures were obtained from virus isolation. 【】 A real-time RPA diagnostic method for ASF was developed, which was proved to be simple, less time consuming with high sensitivity and specificity, providing a new, simple, specific and rapid diagnostic method for ASF.

African swine fever virus; recombinase polymerase amplification; real-time fluorescent RPA; nucleic acid detection; diagnosis

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.01.016

2020-11-16；

2021-02-03

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2017YFD0502300）、國家自然科學(xué)基金專項(xiàng)（31941016）

張靜遠(yuǎn)，E-mail：zjyuanff27@163.com。通信作者李敏，E-mail：lim@nxu.edu.cn。通信作者扈榮良，E-mail：ronglianghu@hotmail.com

（責(zé)任編輯 林鑒非）