李曉貝, 吳海平, 趙曉燕, 陳 磊*,,周昌艷, 李健英, 何香偉

(1. 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，上海 201403；2. 普研(上海)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)股份有限公司，上海 201318)

據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織 (FAO) 報告[1]，2019 年中國大陸地區(qū)葡萄種植面積為74.6 萬公頃，產(chǎn)量1437萬噸，草莓種植面積12.6 萬公頃，產(chǎn)量322 萬噸，是世界上最大的葡萄和草莓生產(chǎn)國及消費(fèi)國，2019 年中國的草莓消費(fèi)量是世界排名第二的美國的2 倍[2]。近年來，植物生長調(diào)節(jié)劑 (plant growth regulators，PGRs) 已被廣泛應(yīng)用于葡萄及草莓的生產(chǎn)中，用于提高植株的成活率、抗病性和果實(shí)的座果率、成熟度、耐貯性、單果重，以及抑制枝蔓瘋長、促進(jìn)葡萄無籽化形成等[3-4]。

雖然我國目前已對60 多種PGRs 有效成分進(jìn)行了登記[5]，但登記用于草莓上的僅2,4-表蕓苔素內(nèi)酯及噻苯隆2 種，在葡萄上登記的有赤霉酸、氯吡脲、脫落酸等15 種，且多數(shù)尚未制定相應(yīng)的最大殘留限量 (MRL) 。PGRs 在生產(chǎn)中的必要性和監(jiān)管的不足，使得濫用及不規(guī)范使用現(xiàn)象日益突出。楊桂玲等[6]對浙江省290 批次葡萄樣品中的77 種農(nóng)藥 (包括6 種PGRs) 殘留進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示，檢出率最高的農(nóng)藥品種為復(fù)硝酚鈉和脫落酸，其中復(fù)硝酚鈉的長期膳食攝入風(fēng)險高于0.01%。2015 年，歐洲食品安全局 (European Food Safety Authority，EFSA)[7]所提交的農(nóng)藥殘留報告顯示，葡萄中乙烯利超標(biāo)率為19.8% (MRL 值為0.7 mg/kg) ，2018年[8]的報告顯示，乙烯利在葡萄中的短期膳食攝入風(fēng)險商最大值為161%。班思凡等[9]對北京、河北、山東、安徽和遼寧的120 個草莓樣品進(jìn)行了農(nóng)藥殘留檢測，共檢出復(fù)硝酚鈉、蕓苔素內(nèi)酯、多效唑、赤霉酸及氯吡脲5 種PGRs，其中復(fù)硝酚鈉檢出率為99.2%。目前我國關(guān)于葡萄和草莓中農(nóng)藥殘留風(fēng)險的研究中，以PGRs為焦點(diǎn)的報道極少。

作為上海市的特色種植產(chǎn)品，2018 年上海葡萄產(chǎn)量為6.57 萬噸，草莓產(chǎn)量為2.58 萬噸[10]，且連續(xù)幾年種植面積及產(chǎn)量均相對穩(wěn)定，以鮮食及本地消費(fèi)為主，但是關(guān)于上海地產(chǎn)葡萄、草莓中PGRs 的使用及殘留風(fēng)險等情況卻尚未見報道。筆者實(shí)地調(diào)研發(fā)現(xiàn)，上海市葡萄生產(chǎn)中施用PGRs已呈常態(tài)化，而草莓中 “膨大劑”、“激素” 等的安全問題亦是消費(fèi)者關(guān)注的焦點(diǎn)。鑒于此，本研究對上海市主產(chǎn)區(qū)及代表性消費(fèi)區(qū)域的葡萄和草莓產(chǎn)品中的PGRs 開展了調(diào)研與殘留監(jiān)測，并初步對其膳食攝入風(fēng)險進(jìn)行了評估，旨在明確上海市地產(chǎn)葡萄、草莓中PGRs 的實(shí)際使用情況及殘留風(fēng)險，為進(jìn)一步提高上海市葡萄、草莓的安全生產(chǎn)水平及降低消費(fèi)者的膳食攝入風(fēng)險提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 葡萄及草莓樣品 根據(jù)上海市葡萄和草莓的生產(chǎn)及種植情況，通過實(shí)地調(diào)研方式，于2018–2019 年分別在上海市葡萄、草莓主要生產(chǎn)基地共采集樣品243 份。其中葡萄樣品152 份，采集自奉賢區(qū)、嘉定區(qū)、金山區(qū)及浦東新區(qū)的26 個葡萄生產(chǎn)基地，主要為巨峰、醉金香、夏黑、巨玫瑰、金手指等主栽品種；草莓樣品91 份，采集自奉賢區(qū)、嘉定區(qū)、金山區(qū)、青浦區(qū)及浦東新區(qū)的53 個草莓生產(chǎn)基地，主要品種為章姬和紅顏。

1.1.2 藥劑及試劑 20 種植物生長調(diào)節(jié)劑標(biāo)準(zhǔn)品：2,4-滴 (2,4-D) 、多效唑 (paclobutrazol) 、赤霉酸 (gibberellic acid) 及丁酰肼 (daminozide) ，均為100 mg/L 甲醇溶液 ；二氯吡啶酸 (clopyralid) 、矮壯素 (chlormequat chloride) 、噻苯隆 (thidiazuron)、吲哚-3-乙酸 (indoleacetic acid) 及胺鮮酯 (diethyl aminoethyl hexanoate) ，均為100 mg/L 乙腈溶液；脫落酸 (abscisic acid) ，1000 mg/L 甲醇溶液；6-芐基腺嘌呤 (6-benzylaminopurine) ，100 mg/L 乙腈-丙酮溶液；氯吡脲 (forchlorfenuron) ，10 mg/L甲醇溶液；甲哌啶 (mepiquat chloride)，10 mg/L水溶液；4-氯苯氧乙酸鈉 (4-chlorophenoxyacetic acid)，純度 98.0%；萘乙酸 (1-naphthaleneacetic)，純度98.0% ；抗倒酯 (inabenfide)，1 000 mg/L 乙腈溶液；2,3,5-三碘苯甲酸 (2,3,5-triiodobenzoic acid)，純度 98.0%。以上購自德國Dr. Ehrenstorfer公司。烯效唑 (uniconazole) ，100 mg/L 甲醇溶液；蕓苔素內(nèi)酯 (brassinolide)，純度 ≥90.0%。購自上海安譜公司。乙烯利 (ethephon)，100 mg/L 甲醇溶液 ，北京Bepure 公司。甲醇和乙腈為色譜純，甲酸為優(yōu)級純，氯化鈉為化學(xué)純。

用甲醇分別將4 種固態(tài)標(biāo)準(zhǔn)品4-氯苯氧乙酸鈉、萘乙酸、2,3,5-三碘苯甲酸和蕓苔素內(nèi)酯溶解，配成1 000 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，于 –20 ℃ 保存。分別配制5 類PGRs 混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：1) 準(zhǔn)確量取1 000 mg/L 的脫落酸、抗倒酯、4-氯苯氧乙酸鈉、萘乙酸、2,3,5-三碘苯甲酸和蕓苔素內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)溶液各0.1 mL 于10 mL 容量瓶中，用甲醇定容，配成10 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液a (混標(biāo)a)。2) 取100 mg/L 的 2,4-滴、6-芐基腺嘌呤、多效唑、赤霉酸、矮壯素、二氯吡啶酸、吲哚-3-乙酸、噻苯隆、丁酰肼、胺鮮酯、烯效唑及乙烯利標(biāo)準(zhǔn)溶液各0.5 mL 于5 mL 容量瓶中，用甲醇定容，配成5 mg/L 的混標(biāo)b。3) 取10 mg/L 的氯吡脲和甲哌啶標(biāo)準(zhǔn)溶液各0.5 mL，合并，配成5 mg/L的混標(biāo)c。4) 按V(混標(biāo)a) :V(混標(biāo)b) :V(混標(biāo)c) :V(甲醇) =1 : 2 : 2 : 5 配得1 mg/L 的混標(biāo)d。5) 按V(混標(biāo)d) :V(甲醇) =1 : 1 配得0.5 mg/L 的混標(biāo)e。混標(biāo)a、b 于 –20 ℃ 保存，混標(biāo)c、d、e 現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 島津LC-20AD 高效液相色譜-AB Sciex API 4000 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(HPLC-MS/MS，美國AB Sciex 公司) ；明澈-D24UVMilli-Q 純水儀(德國默克Millipore 公司)；分析天平 [0.01 g 和0.000 1 g，梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海) 有限公司]。萃取鹽包 (2 g MgSO4，1 g NaOAc) 及QuEChERS 凈化管 (250 mg C18，750 mg MgSO4) ，北京迪科馬科技有限公司。

1.2 檢測方法

1.2.1 樣品前處理 提取：稱取已勻漿的待測樣品5 g (精確至0.01 g) ，置于50 mL 離心管中，加入5 mL 含體積分?jǐn)?shù)1%乙酸的乙腈溶液，快速振蕩約30 s 后加入萃取鹽包，渦旋混勻約1 min后，于4 000 r/min 下離心5 min。凈化：取上層提取液于QuEChERS 凈化管中，渦旋1 min 后于4000 r/min 下離心5 min；取0.5 mL 上清液至2 mL 微量離心管中，加入0.5 mL 體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸水溶液，混勻后經(jīng)0.22 μm 有機(jī)微孔濾膜過濾，待HPLC-MS/MS 分析。

1.2.2 測定條件 色譜條件：Agilent Zorbax Eclipse Plus C18色譜柱 (100 mm × 2.1 mm，3.5 μm)，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量10 μL，流速0.2 mL/min，梯度洗脫條件見表1。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源 (ESI) ，多重反應(yīng)監(jiān)測 (MRM) 模式，20 種PGRs 的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Procedure of gradient elution

表2 植物生長調(diào)節(jié)劑質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass spectrum parameters of PGRs

1.3 膳食攝入風(fēng)險評估

采用點(diǎn)評估方法[11]進(jìn)行。1) 居民體重及膳食消費(fèi)數(shù)據(jù)來源：中國居民葡萄和草莓的平均消費(fèi)量參考王東群等[12]及延妮等[13]的數(shù)據(jù)，大份餐消費(fèi)量數(shù)據(jù)參考 WHO/FAO “全球環(huán)境污染物監(jiān)測規(guī)劃/食品污染監(jiān)測與評估項(xiàng)目 (GEMS/Food)” 中關(guān)于中國的數(shù)據(jù)[14]，結(jié)合GEMS/Food 中急性膳食消費(fèi)人群分類以及中國區(qū)葡萄、草莓消費(fèi)量數(shù)據(jù)和相應(yīng)的體重數(shù)據(jù)設(shè)置人群分類 (表3)，其中兒童及一般人群體重參考GEMS/ Food[14]，孕齡婦女體重參考文獻(xiàn)[15]。2) 殘留量數(shù)據(jù)來源：未檢出及低于檢出限 (LOD) 的PGRs 統(tǒng)一賦值1/2 LOD[16-17]；平均殘留量取賦值后葡萄和草莓樣品中PGRs 的殘留中值 (STMR) ；最高殘留值 (HR) 分別為賦值后葡萄和草莓樣品中PGRs 殘留量的97.5 百分位點(diǎn)值。3) PGRs 的每日允許攝入量 (ADI) 及急性參考劑量 (ARfD) ：以農(nóng)藥殘留專家聯(lián)席會議 (JMPR)的數(shù)據(jù)為主，若JMPR 尚未制定相關(guān)數(shù)據(jù)，則參考?xì)W盟、美國、日本等其他組織或國家的數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測方法驗(yàn)證

在 5 g (精確至0.01 g) 葡萄和草莓空白樣品中分別添加 3 個水平的PGRs 混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：0.01 mg/kg (0.05 mL 混標(biāo) a + 0.1 mL 混標(biāo) b +0.1 mL 混標(biāo) c)、0.03 mg/kg (0.15 mL 混標(biāo) d) 及0.1 mg/kg (0.1 mL 混標(biāo) e) ，進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，每個添加水平重復(fù)6 次。采用空白樣品基質(zhì)提取液分別配制0.005 ～ 0.1 mg/L 系列質(zhì)量濃度的基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照1.2 節(jié)方法測定，繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果 (表3) 表明，在0.01、0.03 及0.1 mg/kg 3 個添加水平下，葡萄和草莓中20 種PGRs 的添加回收率在64%～115% 之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD) 為0.9%～9.1%，LOD 為0.0001～0.002 mg/kg，定量限 (LOQ) 為0.01 mg/kg，均滿足殘留檢測要求[18]。

表3 方法的添加回收率、檢出限 (LOD) 及定量限 (LOQ) (n=6)Table 3 Recovery, limit of detection (LOD) and limit of quantitation (LOQ) (n=6)

2.2 上海地產(chǎn)葡萄和草莓中植物生長調(diào)節(jié)劑殘留情況分析

152 份葡萄及91 份草莓樣品中的20 種PGRs殘留情況見表4，共檢出了赤霉酸、脫落酸、矮壯素及吲哚-3-乙酸 4 種PGRs。其中，檢出頻次最高的為脫落酸，其在葡萄及草莓樣品中均有檢出，平均殘留量分別為0.088 mg/kg 和 0.886 mg/kg，但目前針對葡萄和草莓均尚未制定脫落酸的MRL標(biāo)準(zhǔn)；其次為吲哚-3-乙酸，在草莓中檢出率為67.0%，賦值后平均殘留量為0.011 mg/kg，在葡萄中檢出率為5.9%，賦值后平均殘留量為0.011 mg/kg，目前亦尚未制定其MRL 標(biāo)準(zhǔn)；矮壯素在葡萄中檢出8 次，我國目前也尚未針對葡萄制定矮壯素的MRL 標(biāo)準(zhǔn)[19]，按照食品法典委員會 (CAC)[20]對葡萄中矮壯素的MRL 規(guī)定，有4 份樣品超標(biāo)，超標(biāo)率2.6%；赤霉酸僅在葡萄中檢出4 次，按日本[21]規(guī)定的葡萄中赤霉素 (含赤霉酸) 的MRL 標(biāo)準(zhǔn)，4 份樣品中的殘留量均超標(biāo)，超標(biāo)率為2.6%。

表4 葡萄及草莓樣品中植物生長調(diào)節(jié)劑的殘留檢出情況Table 4 PGRs detection of table grapes and strawberries

2.3 膳食攝入風(fēng)險評估結(jié)果

未查詢到吲哚-3-乙酸的ADI 值，故在此不對其進(jìn)行評估。根據(jù)居民的每日膳食攝入量 [14]以及赤霉酸、脫落酸和矮壯素在葡萄中的殘留量，分別計算我國成年人群 (平均體重61.8 kg)[15]的膳食攝入風(fēng)險。長期膳食攝入風(fēng)險評估結(jié)果 (表5) 顯示：通過葡萄攝入赤霉酸和矮壯素的 %ADI 值分別為0.0005%及0.004%，均遠(yuǎn)低于100%，其平均膳食水平下的長期攝入風(fēng)險可忽略；通過葡萄和草莓?dāng)z入脫落酸的總暴露量為1.63 × 10?4mg/(kg bw·d)，%ADI 值為0.001%，其平均水平下的長期膳食攝入風(fēng)險也極低。

表5 葡萄和草莓中3 種植物生長調(diào)節(jié)劑的長期膳食攝入風(fēng)險Table 5 Chronic risk exposure of three kinds of PGRs from the dietary of table grapes and strawberries

EFSA 認(rèn)為，無需制定赤霉酸及脫落酸的急性參考劑量，也不需要評估其短期膳食攝入風(fēng)險[22-23]。葡萄單果重為637 g (以串計) ，高于其大份餐消費(fèi)量，其短期攝入風(fēng)險評估時變異因子 (v) 取值3[14]，評估結(jié)果(表6)顯示：通過葡萄攝入矮壯素對各類人群的短期膳食暴露量 (IESTI) 最大值為2.73 ×10?4mg/(kg bw·d)，%ARfD 值為0.55%，遠(yuǎn)低于100%，因此其短期膳食攝入風(fēng)險在可接受范圍。

表6 通過葡萄攝入矮壯素的短期膳食風(fēng)險Table 6 Acute risk exposure to chlormequat chloride from table grape

3 討論與結(jié)論

3.1 植物生長調(diào)節(jié)劑使用及檢出情況

實(shí)地調(diào)研結(jié)果顯示，上海地產(chǎn)各品種葡萄種植中普遍施用赤霉酸和氯吡脲，一般每年施用2 次，第一次在開花前10 ～ 14 d 噴施全株，起到拉長果穗的作用，第二次在開花后噴施或浸潤果穗，起到保果、無籽、彭大顆粒等作用，直至采收 (2 ～ 3 個月后) 不再施用其他植物生長調(diào)節(jié)劑。檢測結(jié)果顯示，152 份葡萄樣品中均未檢出氯吡脲，僅檢出赤霉酸 4 次。赤霉酸是一種廣泛存在于高等植物中的生長激素，在萌發(fā)期的種子中含量最高，在果實(shí)成熟后期，游離態(tài)赤霉酸含量逐漸降低，主要以束縛型儲存于種子中[25-26]。赤霉酸具有拉長果穗、膨大果粒等作用，已廣泛用于葡萄的增產(chǎn)、提質(zhì)及無籽化等方面[3]。本研究中赤霉酸超標(biāo)的4 份樣品可能是由于不合規(guī)施用外源赤霉酸，也可能是由于果實(shí)成熟度不足因而內(nèi)源赤霉酸含量相對較高所致，因此需進(jìn)一步規(guī)范赤霉酸在葡萄日常生產(chǎn)中的使用方式及葡萄產(chǎn)品的采收標(biāo)準(zhǔn)。草莓基地的調(diào)研結(jié)果則顯示，上海地產(chǎn)草莓在生產(chǎn)全過程中均不施用PGRs。

脫落酸及吲哚-3-乙酸在葡萄和草莓中均有檢出，二者均可由植物內(nèi)源產(chǎn)生，且目前尚未制定這2 種PGRs 在葡萄和草莓中的MRL 標(biāo)準(zhǔn)。葡萄和草莓作為典型的非呼吸躍變型果實(shí)，對果實(shí)發(fā)育與成熟起調(diào)控作用的生長激素以吲哚-3-乙酸、赤霉素、脫落酸和蕓苔素內(nèi)酯等為主，沒有激增的乙烯峰和劇變的呼吸峰[4]。脫落酸可促進(jìn)果實(shí)的成熟，直接影響果實(shí)著色及香味形成等，在葡萄和草莓果實(shí)成熟后期具有相對穩(wěn)定的高含量[27]，本研究中脫落酸100% 的高檢出率結(jié)果與之一致。吲哚-3-乙酸的主要功能是促進(jìn)細(xì)胞分裂以及延緩植物衰老，在葡萄和草莓成熟后期會逐漸降低直至果實(shí)成熟。本研究中，整體成熟度相對較高的葡萄樣品中吲哚-3-乙酸檢出率為5.9%，而基地采集的草莓樣品中吲哚-3-乙酸檢出率為67.0%，主要原因可能是因?yàn)榛夭葺畼悠氛w成熟度不足而非外源施用。矮壯素是人工合成的生長抑制劑類物質(zhì)，可用于抑制枝梢旺長和新枝生長。陳國品等[28]的研究顯示，葡萄果實(shí)中矮壯素的殘留量與其施用濃度成正比。EFSA 的評估結(jié)果顯示，將施用過矮壯素的秸稈類原料制成培養(yǎng)料后，矮壯素仍能被食用菌吸收且高頻次檢出[29]，說明矮壯素在植物體內(nèi)具有良好的吸收性和穩(wěn)定性。雖然我國目前尚未制定矮壯素在葡萄和草莓上的MRL 標(biāo)準(zhǔn)，但其施用過量或時機(jī)不當(dāng)存在植株生長不良、果實(shí)品質(zhì)降低等風(fēng)險[30]， 因此在生產(chǎn)中需根據(jù)實(shí)際需要合理施用。

3.2 膳食攝入風(fēng)險分析

據(jù)國家衛(wèi)健委發(fā)布的《中國居民營養(yǎng)與慢性病狀況報告》，我國居民一天的平均總膳食攝入量為969.2 g，其中水果消費(fèi)量僅占4.2%[15]。本研究中檢出的4 種PGRs 中，赤霉酸、吲哚-3-乙酸及矮壯素的平均殘留量均低于0.01 mg/kg，最大殘留量為0.50 mg/kg，整體殘留水平相對較低。按照我國對農(nóng)藥的毒性等級劃分標(biāo)準(zhǔn)，目前常用的PGRs 一般都屬于低毒或者微毒級[31-32]，且赤霉酸和吲哚-3-乙酸在美國均屬于豁免制定MRL的農(nóng)藥[33]。整體而言，葡萄及草莓本身的膳食攝入量低，測定表明上海地產(chǎn)葡萄和草莓中PGRs的殘留水平也較低，而其ADI 值相對較高，因此居民通過葡萄和草莓?dāng)z入PGRs 的膳食風(fēng)險可接受。

風(fēng)險評估通常具有一定的不確定性，在本研究中主要表現(xiàn)在3 個方面：1) 僅以葡萄和草莓為單一暴露途徑，未考慮由蔬菜、其他水果及糧食等其他食品暴露途徑引入的膳食風(fēng)險，即未能評估PGRs 的整體膳食攝入風(fēng)險。2) 所采用的大份餐消費(fèi)量數(shù)據(jù)來源于WHO/FAO 2012 年的統(tǒng)計結(jié)果，與當(dāng)前中國居民的實(shí)際消費(fèi)情況存在一定差異。3) 矮壯素的殘留量最大值取其97.5 百分位點(diǎn)值進(jìn)行計算，但是由于其檢出率相對較低，所得風(fēng)險估值可能低于其實(shí)際暴露水平。

3.3 結(jié)論

研究表明，上海地產(chǎn)葡萄和草莓中植物生長調(diào)節(jié)劑的整體殘留水平及膳食攝入風(fēng)險均較低。葡萄樣品中共檢出脫落酸、赤霉酸、矮壯素及吲哚-3-乙酸4 種PGRs 殘留，其中脫落酸的檢出率雖然高達(dá)100%，但其平均殘留量僅0.088 mg/kg；另外3 種PGRs 的檢出率則均低于6.0%，最大檢出值為0.500 mg/kg。草莓中共檢出了赤霉酸及吲哚-3-乙酸2 種PGRs 殘留，其中脫落酸的檢出率為100%，平均殘留量為0.886 mg/kg；吲哚-3-乙酸檢出率為67.0%，平均殘留量為0.011 mg/kg。我國居民通過食用上海地產(chǎn)葡萄和草莓?dāng)z入4 種PGRs 的長期膳食暴露風(fēng)險商 (%ADI) 最大值為0.004% (矮壯素)，遠(yuǎn)低于100%，長期膳食攝入風(fēng)險可忽略；所檢出的幾種PGRs 中，僅矮壯素需要評估其短期膳食風(fēng)險，結(jié)果表明，通過葡萄攝入矮壯素的短期膳食暴露風(fēng)險商 (%ARfD)最大值為0.55%，同樣遠(yuǎn)低于100%，其短期膳食攝入風(fēng)險亦可接受。