姚周麟, 章 虎, 吳韶輝, 林 媚, 王 強(qiáng), 李祖光

(1. 浙江工業(yè)大學(xué)，杭州 310014；2. 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，杭州 310021)

手性農(nóng)藥是新興且重要的一類農(nóng)用化學(xué)品[1-2]，通常含有一個(gè)或多個(gè)不對(duì)稱中心，大多手性農(nóng)藥是合成產(chǎn)物[3]。在手性農(nóng)藥中，以手性殺螨劑、殺線蟲劑和殺蟲劑較多，約占40.5%，其次是手性殺菌劑和手性除草劑[4]。手性農(nóng)藥在生物體和環(huán)境中的降解和積累具有立體選擇性，其中某種異構(gòu)體可能對(duì)人類健康和環(huán)境安全產(chǎn)生影響[5]，尤其是與其他手性分子 (如酶和生物受體[6]) 相互作用時(shí)，不同手性異構(gòu)體的生物有效性、毒性、環(huán)境性質(zhì)可能存在顯著差異[7-8]，如一個(gè)對(duì)映體易在環(huán)境中積累，而另一個(gè)對(duì)映體易發(fā)生降解[9]，對(duì)映體間的降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)也會(huì)不同[10]。為此，亟需從手性對(duì)映體水平建立農(nóng)藥殘留的分析方法，研究其在環(huán)境中的選擇性行為。

柑橘是中國重要的進(jìn)出口商品之一[11]，柑橘類水果在田間及采后極易受到微生物侵染而產(chǎn)生病害，最終導(dǎo)致果實(shí)腐爛，在中國由此造成的柑橘損失率高達(dá)20%～25%[12]。柑橘采后的主要病害為青霉病和綠霉病[13]，而傳統(tǒng)殺菌劑抑霉唑(imazalil) 可有效防治這兩種病害，降低腐爛率[14]。然而，殺菌劑不正當(dāng)使用可能導(dǎo)致柑橘及其加工產(chǎn)品中存在殺菌劑殘留超標(biāo)的問題，對(duì)人類健康和環(huán)境造成潛在危害。因此，很多國家均對(duì)柑橘上的殺菌劑殘留提出了相關(guān)限量要求，例如，中國和日本規(guī)定柑橘中抑霉唑的最大殘留限量 (MRL)均為5 mg/kg[15-16]。

抑霉唑及其代謝產(chǎn)物咪唑乙醇均為手性分子(圖式1)，各存在一對(duì)對(duì)映異構(gòu)體。由于生產(chǎn)和純化過程成本較高，因此包括抑霉唑在內(nèi)的大多數(shù)手性農(nóng)藥仍以外消旋混合物的形式出售和使用[5]。手性農(nóng)藥不僅對(duì)靶標(biāo)生物的作用可能存在不同，其在環(huán)境積累、細(xì)胞毒性、內(nèi)分泌干擾及致癌性方面也存在差異。有研究表明：S-(+)-己唑醇對(duì)蚯蚓的急性毒性高于R-(?)-己唑醇，48 h 的LC50值分別為8.62 和22.35 μg/cm2[17]；丙溴磷對(duì)映體在柑橘中的降解存在明顯的選擇性，(+)-丙溴磷和 (?)-丙溴磷的降解半衰期分別為 12.53 d 和14.14 d[18]；S-(?)-抑霉唑比R-(+)-抑霉唑具有更快的降解速率、更高生物活性和生態(tài)毒性[19]。

圖式 1 抑霉唑及其代謝產(chǎn)物咪唑乙醇的結(jié)構(gòu)式Scheme 1 The structural formulas of imazalil and its metabolite imidazole ethanol

研究手性殺菌劑在采后柑橘中的選擇性降解規(guī)律可為柑橘中農(nóng)藥殘留的質(zhì)量安全評(píng)價(jià)提供技術(shù)支撐。常見殺菌劑肟菌酯、噻菌靈、嘧菌酯和嘧霉胺在柑橘貯藏期間的降解行為研究已有分析報(bào)道，這些與貯藏溫濕度、施藥劑量相關(guān)的殘留數(shù)據(jù)是柑橘質(zhì)量安全控制的重要參考信息[20-21]；而抑霉唑在柑橘貯藏過程中的選擇性降解變化及其代謝產(chǎn)物的積累情況尚未見系統(tǒng)報(bào)道。鑒于此，本研究采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 (UPLC-MS/MS)技術(shù)，建立抑霉唑及其代謝產(chǎn)物咪唑乙醇的手性分離分析技術(shù)，闡述其在柑橘保鮮中的立體選擇性殘留規(guī)律及其代謝產(chǎn)物積累情況，以完善柑橘中農(nóng)藥殘留的安全評(píng)價(jià)信息。

1 材料與方法

1.1 供試材料、試劑和儀器

供試柑橘品種為椪柑Citrus reticulataBlanco cv. Ponkan，由浙江省柑橘研究所 (浙江，臺(tái)州) 提供，樹齡30 a，砧木為枸頭橙，于果實(shí)成熟期(2020 年12 月9 日) 隨機(jī)采樣，要求果實(shí)大小相近，無病蟲害、無損傷。

抑霉唑 (imazalil，純度99.7%) 及其代謝產(chǎn)物咪唑乙醇 (imidazole ethanol，純度99.5%)標(biāo)準(zhǔn)品，均購于德國Dr. Ehrenstorfer GmbH 公司。將供試化合物溶于甲醇 (色譜級(jí))，配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用棕色瓶于 ?20 ℃下保存。抑霉唑?qū)τ丑wpeak 1 和peak 2，咪唑乙醇對(duì)映體peak 1 和peak 2 均由上海勤路公司提供。貯藏試驗(yàn)采用市售的22.2%抑霉唑乳油 (神越，山東東合生物科技)。

ExionLC AD System (UPLC)+AB Triple Quad-5500+超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測儀 (美國AB SCIEX 公司)。手性色譜柱分別為Lux Cellulose-2(150 mm × 2 mm，粒徑3 μm，美國Phenomenex公司)；固定相為纖維素-三 (3-氯-4-甲基-苯基-氨基甲酸酯)；Chiralpak IG-3 (150 mm × 2.1 mm，粒徑3 μm，大賽璐藥物手性技術(shù)有限公司)，固定相為直鏈淀粉-三 (3-氯-5-甲基苯基氨基甲酸酯)。具有可調(diào)節(jié)波長功能的Jasco J-815 圓二色光譜儀 (日本Jasco 公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理 稱取均質(zhì)后的柑橘 (果肉或全果15g、果皮5g) ，加入 15 mL 乙腈 (含體積分?jǐn)?shù)為1%的乙酸)渦旋1 min，超聲15 min?？焖偌尤? g 無水硫酸鎂和1.5 g 無水醋酸鈉，振搖5 min，于8000 r/min 下離心3 min；將上清有機(jī)相轉(zhuǎn)移至空離心管中，加入50 mg PSA、50 mg C18和150 mg 無水硫酸鎂，充分渦旋混合；上清液過0.22 μm 有機(jī)濾膜后待分析。

1.2.2 絕對(duì)構(gòu)型確定 手性化合物的對(duì)映體通常通過其絕對(duì)構(gòu)型或特定的圓二色性 (CD) 信號(hào)來區(qū)分。本研究中，在圓二色光譜儀上進(jìn)行ECD(電子圓二色譜，Electronic circular dichroism) 測定，光譜掃描范圍為210～300 nm，用ComputeVOA 得出對(duì)映體構(gòu)型的計(jì)算譜圖，在計(jì)算中需考慮溶劑的影響。

1.2.3 色譜與質(zhì)譜檢測條件 色譜條件：對(duì)于抑霉唑?qū)τ丑w，采用Lux Cellulose-2 手性色譜柱，流動(dòng)相為V(乙腈) :V(水) = 70 : 30，流速0.3 mL/min，進(jìn)樣量2 μL。對(duì)于咪唑乙醇對(duì)映體，采用Chiralpak IG-3 手性色譜柱，流動(dòng)相為V(甲醇) :V(水)=90 :10，流速0.6 mL/min，進(jìn)樣量2 μL。

質(zhì)譜條件：采用多反應(yīng)監(jiān)測掃描 (MRM) 模式，電噴霧離子源ESI(+)，毛細(xì)管溫度350 ℃，噴霧電壓4500 V。錐孔氣體 (N2) 流速40 mL/min；碰撞氣體 (Ar) 流速0.15 mL/min。脫溶劑氣體(N2)流速12 mL/min，溫度500 ℃。質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 抑霉唑及其代謝產(chǎn)物咪唑乙醇的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters of imazalil and its metabolite imidazole ethanol

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線 將100 mg/L 的儲(chǔ)備液用甲醇逐級(jí)稀釋至外消旋質(zhì)量濃度分別為0.001、0.005、0.01、0.025、0.10、0.25、0.50 和1.0 mg/L 的溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液，用于測定抑霉唑和咪唑乙醇各對(duì)映體的溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線；同時(shí)采用柑橘基質(zhì) (全果、果肉和果皮) 配制抑霉唑及其代謝產(chǎn)物咪唑乙醇各對(duì)映體的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 基質(zhì)效應(yīng) 基質(zhì)效應(yīng) (matrix effect,Me) 會(huì)影響目標(biāo)化合物的定量分析結(jié)果，本研究通過參數(shù)Me評(píng)價(jià)抑霉唑及咪唑乙醇在不同柑橘基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)，按 (1) 式計(jì)算。

式中：km為基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，ks為溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。

當(dāng)Me>10%時(shí)，表明存在明顯的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；當(dāng)Me< ?10%時(shí)，表明存在明顯的基質(zhì)抑制效應(yīng)；?10%≤Me≤10%時(shí)，表明基質(zhì)效應(yīng)不顯著[22]。

1.2.6 方法的準(zhǔn)確度與精密度 在空白柑橘基質(zhì)(橘皮、橘肉和全果) 中添加不同水平的抑霉唑及其代謝產(chǎn)物咪唑乙醇對(duì)映體，測定各添加水平下的回收率。4 個(gè)對(duì)映體的添加水平分別為0.0005、0.05、0.125、0.25 mg/kg，每個(gè)水平重復(fù)5 次。分別添加到3 種基質(zhì)中，混勻后靜置1 h。前處理方法同1.2.1 節(jié)。

1.3 抑霉唑和咪唑乙醇在柑橘貯藏中的選擇性行為研究

1.3.1 貯藏試驗(yàn)場地 供試柑橘采集自浙江省柑橘研究所試驗(yàn)園 (臺(tái)州市黃巖區(qū))，試驗(yàn)橘樹在采收前未噴施任何保鮮劑。貯藏試驗(yàn)在柑橘貯藏倉庫內(nèi)進(jìn)行，于試驗(yàn)前10 d 進(jìn)行全面消毒。柑橘浸藥后置于塑料貯藏箱中，貯藏箱帶孔、內(nèi)部四周墊有紙張防潮。貯藏箱離地?cái)[放于倉庫的貨架上。庫房內(nèi)通風(fēng)透氣，利用開關(guān)通風(fēng)窗的自然換氣方法來調(diào)節(jié)室溫，各處理貯藏環(huán)境條件均一致。

1.3.2 貯藏試驗(yàn)處理和樣品采集 將22.2%抑霉唑乳油采用純凈水稀釋約150 倍，配制成質(zhì)量濃度約為1480 mg/L 的水溶液，將新采收的柑橘果實(shí)在溶液中浸泡1 min。分別于浸果后0 (2 h)、1、3、5、7、14、21、29、35、45、88、111 和120 d采集柑橘果實(shí) (全果) 10 個(gè)，每次取樣設(shè)3 次重復(fù)。采集的樣品無需清洗，操作時(shí)為避免污染須戴一次性塑料手套。樣品前處理采用1.2.1 節(jié)方法。

1.3.3 降解動(dòng)力學(xué)參數(shù) 根據(jù)降解動(dòng)態(tài)變化曲線計(jì)算獲得降解動(dòng)力學(xué)參數(shù) (公式2)，按公式 (3) 計(jì)算半衰期。

1.4 數(shù)據(jù)分析

文中數(shù)據(jù)采用Excel 2021 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑霉唑和咪唑乙醇對(duì)映體絕對(duì)構(gòu)型的確定及在色譜上的出峰順序

抑霉唑各對(duì)映體實(shí)驗(yàn)ECD 圖譜 (圖1-A) 與通過含時(shí)密度泛函理論 (TDDFT，圖1-B) 在乙腈溶劑中獲得的計(jì)算ECD 圖譜的積分曲線比較相似。用ComputeVOA 軟件進(jìn)行構(gòu)象搜索，取相對(duì)能量小于0.8 的構(gòu)象進(jìn)行進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)優(yōu)化，根據(jù)結(jié)構(gòu)優(yōu)化后優(yōu)勢構(gòu)象的熱力學(xué)數(shù)據(jù)，計(jì)算所有可能構(gòu)象的玻爾茲曼分布概率，并進(jìn)行疊加以得出對(duì)映體構(gòu)型的計(jì)算ECD 譜圖。結(jié)構(gòu)優(yōu)化采用ub3lyp 泛函/6-31+g(d, p) 基組，根據(jù)TDDFT 進(jìn)行ECD 譜圖的計(jì)算和擬合，計(jì)算過程中考慮到了溶劑乙腈的影響。同時(shí)，咪唑乙醇對(duì)映異構(gòu)體在乙腈溶劑中獲得的實(shí)驗(yàn)ECD 圖譜 (圖1-C) 和其計(jì)算圖譜(圖1-D) 也非常相似。用ComputeVOA 軟件進(jìn)行構(gòu)象搜索，取相對(duì)能量小于1.5 的構(gòu)象進(jìn)行進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)優(yōu)化和譜圖計(jì)算，其他參數(shù)與抑霉唑相同(計(jì)算過程中考慮了溶劑乙腈的影響)。因此可以確定，抑霉唑?qū)τ丑wpeak 1 和peak 2 絕對(duì)構(gòu)型分別為S-抑霉唑和R-抑霉唑，咪唑乙醇對(duì)映體peak 1和peak 2 絕對(duì)構(gòu)型分別為S-咪唑乙醇和R-咪唑乙醇。

圖1 抑霉唑和咪唑乙醇的實(shí)驗(yàn)ECD 光譜圖(A 和C) 和理論計(jì)算ECD 光譜圖(B 和D)Fig. 1 Experimental ECD spectra of imidazolium and imidazolium ethanol (A and C) and theoretical calculation of ECD spectra (B and D)

采用本研究的手性拆分方法將上述各已知絕對(duì)構(gòu)型的抑霉唑和咪唑乙醇單一對(duì)映體標(biāo)準(zhǔn)品，在手性柱上分別進(jìn)樣，確定各對(duì)映體的出峰順序。如圖2 所示：抑霉唑兩個(gè)對(duì)映體在Lux Cellulose-2柱上達(dá)到基線分離，出峰順序?yàn)镽-抑霉唑和S-抑霉唑，保留時(shí)間分別為3.54 和3.80 min；咪唑乙醇兩個(gè)對(duì)映體在手性柱Chiralpak IG-3 的出峰順序?yàn)镽-咪唑乙醇和S-咪唑乙醇，基線分離，且保留時(shí)間分別為1.08 和1.95 min。

圖2 抑霉唑及其代謝產(chǎn)物咪唑乙醇對(duì)映體的手性拆分質(zhì)譜圖Fig. 2 Chiral resolution chromatogram of imazalil and its metabolite imidazole ethanol enantiomers

2.2 方法線性關(guān)系與基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是農(nóng)藥殘留監(jiān)測中影響結(jié)果準(zhǔn)確性的重要因素之一，柑橘中成分復(fù)雜，其中的一些非待測組分對(duì)目標(biāo)化合物的質(zhì)量或濃度準(zhǔn)確測定會(huì)產(chǎn)生干擾[23]。本研究首先對(duì)抑霉唑及咪唑乙醇在甲醇溶劑和不同柑橘基質(zhì)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行了分析，結(jié)果如表2 所示，溶劑和基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系均較好，其中抑霉唑的R2> 0.9915，咪唑乙醇的R2> 0.9991。在實(shí)際樣品的數(shù)據(jù)分析中采用基質(zhì)校準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以有效消除基質(zhì)效應(yīng)，提高數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度。

表2 抑霉唑和咪唑乙醇對(duì)映體的標(biāo)準(zhǔn)曲線和基質(zhì)效應(yīng)Table 2 The matrices standard curves and matrix effects of imazalil and imidazole ethanol enantiomers

續(xù)表2Table 2 (Continued)

由表2 數(shù)據(jù)還可以看出，S-咪唑乙醇在柑橘果肉中存在明顯的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，R-抑霉唑和R-咪唑乙醇在柑橘果肉和全果中也存在明顯的基質(zhì)抑制效應(yīng)。抑霉唑和咪唑乙醇在柑橘果實(shí)不同部位的基質(zhì)效應(yīng)存在差異，如R-和S-抑霉唑在果皮中受到的基質(zhì)效應(yīng)顯著高于果肉；而R-咪唑乙醇在果肉和全果中的基質(zhì)效應(yīng)高達(dá) ?33.8%和 ?44.2%；S-咪唑乙醇在果肉中的基質(zhì)效應(yīng)達(dá)29.7%，顯著高于全果和果皮。

2.3 方法的基質(zhì)效應(yīng)分析

為了分析柑橘基質(zhì)對(duì)抑霉唑和咪唑乙醇檢測中的基質(zhì)效應(yīng)，采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，即分別向溶劑和基質(zhì)中添加定量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，計(jì)算基質(zhì)和溶劑中回收率的差異。結(jié)果 (表3) 表明：在4 個(gè)添加水平下，抑霉唑?qū)τ丑w在不同基質(zhì)中的回收率在78%～101%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差0.4%～2.9%；咪唑乙醇的回收率在73%～105%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差0.4%～5.6%。抑霉唑和咪唑乙醇對(duì)映體的LOQ為0.0005 mg/kg。

表3 抑霉唑及其代謝產(chǎn)物咪唑乙醇對(duì)映體在柑橘基質(zhì)中的回收率(n＝5)Table 3 Recoveries of imazalil and its metabolites imidazole ethanol enantiomers in orange matrix (n＝5)

2.4 抑霉唑和咪唑乙醇在柑橘貯藏中的選擇性降解行為

2.4.1 抑霉唑?qū)τ丑w在柑橘貯藏中的選擇性降解行為 抑霉唑?qū)τ丑w在柑橘貯藏過程的降解動(dòng)態(tài)曲線如圖3 所示?？梢悦黠@發(fā)現(xiàn)，果皮和全果中的R-和S-抑霉唑?qū)τ丑w均隨著貯藏時(shí)間的增加而逐漸降低。本試驗(yàn)采用新鮮的果實(shí)在抑霉唑水溶液中浸果，浸藥0 d (2 h) 的果皮中R-和S-抑霉唑在果皮中的殘留量高達(dá)1.752 和1.579 mg/kg FW，顯著高于全果和果肉；此時(shí)R-和S-抑霉唑在全果中含量分別為0.516 和0.458 mg/kg FW，而在果肉則僅0.01 和0.009 mg/kg FW，說明全果中的抑霉唑?qū)τ丑w含量主要來自果皮。通過計(jì)算抑霉唑降解率可以發(fā)現(xiàn)，貯藏45 d 后果皮中S-抑霉唑和R-抑霉唑的降解率分別為42.0%和33.6%，對(duì)映異構(gòu)體間存在顯著差異。

圖3 抑霉唑?qū)τ丑w在柑橘貯藏中的降解動(dòng)力學(xué)曲線Fig. 3 Degradation curves of imazalil enantiomers in citrus storage

表4 為抑霉唑?qū)τ丑w在柑橘中的降解動(dòng)態(tài)方程，降解符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，這與常見的農(nóng)藥如多菌靈、甲霜靈和噻菌靈在柑橘基質(zhì)中的降解動(dòng)力學(xué)情況相同，均符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程[24]。根據(jù)回歸方程計(jì)算結(jié)果表明，R-抑霉唑和S-抑霉唑兩個(gè)對(duì)映體在柑橘全果中的降解半衰期分別為136 和158 d，在果皮中的降解半衰期分別77 和82 d，即S-抑霉唑在柑橘全果和果皮中的降解速率明顯快于R-抑霉唑，這與Bagnall 等對(duì)抑霉唑降解的研究結(jié)果一致[19]。

表4 抑霉唑?qū)τ丑w在柑橘果實(shí)不同部位中的降解動(dòng)態(tài)方程Table 4 Dynamic equation of degradation of imazalil enantiomers in different parts of orange

圖4 為浸藥21 d 后抑霉唑及其代謝產(chǎn)物各對(duì)映體在柑橘果肉、全果和果皮中殘留的質(zhì)譜圖，其中由圖4-B 和4-C 均可以明顯看出，S-抑霉唑的含量低于R-抑霉唑。隨著用藥時(shí)間的推移，易造成柑橘果實(shí)中R-抑霉唑的富集。在貯藏試驗(yàn)中，藥劑直接作用于果皮，因此果肉中檢測到的R-和S-抑霉唑主要是通過果皮中的抑霉唑內(nèi)吸積累形成，如貯藏120 d，R-和S-抑霉唑含量僅為0.024 和0.017 mg/kg FW，變化無明顯規(guī)律。

圖4 抑霉唑和及其代謝產(chǎn)物咪唑乙醇各對(duì)映體在柑橘實(shí)際樣品中的譜圖(21 d)Fig. 4 Typical spectra of imazalil and its metabolite imidazole ethanol enantiomers in citrus samples (21 d)

手性農(nóng)藥的選擇性降解行為會(huì)受到環(huán)境 (如生物體內(nèi)的酶、微生物等)的影響，若構(gòu)成酶結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)具有手性特征，會(huì)導(dǎo)致手性農(nóng)藥的其中一個(gè)對(duì)映體優(yōu)先被降解。例如：在葉面噴施和土壤施藥的情況下，(?) 氯啶菌酯A 和 (?) 氯啶菌酯B 在番茄中的降解速率均快于其對(duì)映體[25]；S-(+)-苯霜靈在黃瓜中優(yōu)先降解[26]。此外，同一手性農(nóng)藥在不同作物上的選擇性降解行為也存在差異，如 (+)-丙環(huán)唑-B 和 (?)-丙環(huán)唑-A 在小麥植株上優(yōu)先降解[27]，然而在葡萄上的降解趨勢相反。因此，在不同作物、不同環(huán)境下開展手性農(nóng)藥的選擇性代謝研究具有重要意義。

2.4.2 咪唑乙醇對(duì)映體在柑橘貯藏中的選擇性降解行為 抑霉唑代謝產(chǎn)物咪唑乙醇在柑橘果實(shí)不同部位的積累動(dòng)態(tài)如圖5 所示，果實(shí)不同部位的R-咪唑乙醇和S-咪唑乙醇含量均隨著浸藥時(shí)間的推移逐漸增加，由于抑霉唑主要黏附在果皮上，導(dǎo)致果皮上產(chǎn)生的咪唑乙醇?xì)埩糨^高，如120 d 的果皮上R-和S-咪唑乙醇含量可達(dá)0.160 和0.440 mg/kg FW，而果肉中R-和S-咪唑乙醇僅為0.017和0.048 mg/kg FW。此外，在整個(gè)貯藏過程中，S-咪唑乙醇含量均高于R-咪唑乙醇，如圖4 所示，浸藥21 d 的柑橘果肉 (圖4-D)、全果 (圖4-E) 和果皮 (圖4-F) 中，S-咪唑乙醇含量均顯著高于R-咪唑乙醇，且隨著時(shí)間的推移，差異更加明顯，有選擇性積累行為。上述結(jié)果說明S-咪唑乙醇在柑橘果實(shí)中優(yōu)先代謝產(chǎn)生，易產(chǎn)生富集現(xiàn)象。

圖5 咪唑乙醇對(duì)映體在柑橘貯藏中的選擇性行為Fig. 5 Selective behavior of imidazole ethanol enantiomers in citrus storage

2.4.3 貯藏期間抑霉唑和咪唑乙醇的EF 變化 貯藏期間柑橘果實(shí)不同部位的抑霉唑?qū)τ丑w EF 值變化趨勢如圖 6-A 所示，發(fā)現(xiàn)全果和果皮中抑霉唑的EF 值隨著時(shí)間的推移逐漸增加，尤其浸藥45 d后增加相對(duì)較為明顯，此時(shí)抑霉唑在全果和果皮中的EF 分別為0.552 和0.560，各儲(chǔ)藏時(shí)間的EF 值均大于0.5，說明抑霉唑?qū)τ丑w在柑橘中存在選擇性降解，R-抑霉唑容易產(chǎn)生富集效果。

圖6 貯藏期間抑霉唑 (A) 和咪唑乙醇 (B) 對(duì)映體的EF 值變化Fig. 6 Curves of EF value of imazalil (A) and imidazole ethanol (B) enantiomers in citrus storage

隨著貯藏時(shí)間的推移，抑霉唑代謝產(chǎn)物咪唑乙醇的EF 值也整體呈升高的趨勢 (圖6-B)，120 d時(shí)，全果和果皮的EF 值分別為0.236 和0.267，數(shù)值較小，說明在貯藏期間，咪唑乙醇有顯著的選擇性行為，S-咪唑乙醇積累明顯較快。

3 結(jié)論

本研究建立了一種基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測柑橘果皮、果肉和全果中抑霉唑和咪唑乙醇對(duì)映體的手性拆分方法，利用本方法開展了柑橘(椪柑)貯藏中抑霉唑及其代謝產(chǎn)物咪唑乙醇對(duì)映體的選擇性降解行為研究。抑霉唑和咪唑乙醇對(duì)映體在0.0001～0.5 mg/kg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好 (R2>0.9915，>0.9991)，方法定量限 (LOQ) 為0.0005 mg/kg，4 個(gè)添加水平 (0.0005、0.05、0.125、0.25 mg/kg) 下抑霉唑和咪唑乙醇對(duì)映體在不同基質(zhì)中的平均回收率分別為78.4%～101.0%和73.0%～104.5%，符合中國NY/T 788—2004《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》要求。本方法樣品前處理操作簡便、溶劑消耗少，分析時(shí)間短，具有良好的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度，能夠滿足目前對(duì)柑橘果品中抑霉唑?qū)τ丑w殘留的檢測需要。

由柑橘貯藏試驗(yàn)結(jié)果可知，抑霉唑的降解符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程；半衰期和EF 值測定結(jié)果表明，S-抑霉唑在柑橘全果和果皮中優(yōu)先降解，降解速率快于R-抑霉唑；S-咪唑乙醇在柑橘果實(shí)各部位的積累速度顯著高于R-咪唑乙醇，說明抑霉唑的代謝主要以S-咪唑乙醇的形式在柑橘中累積。根據(jù)GB 2763—2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中柑、橘、橙、檸檬、柚的最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)為5 mg/kg，本試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，從柑橘果實(shí)浸藥開始，果肉和全果中的抑霉唑含量均低于5 mg/kg，未超標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，抑霉唑在柑橘中的半衰期較長，建議在生產(chǎn)中使用該化合物防治柑橘青、綠霉病時(shí)應(yīng)注意用藥濃度。今后亟需通過結(jié)合化學(xué)、生物學(xué)等技術(shù)，深入開展手性抑霉唑降解的影響因子研究，尤其是與人體健康密切相關(guān)的手性選擇性行為，真實(shí)、準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)抑霉唑?qū)τ丑w對(duì)環(huán)境與健康的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)也為抑霉唑等手性農(nóng)藥的正確使用和相關(guān)法規(guī)的制定提供依據(jù)。