張 銘, 張亞妮, 李 偉, 鄧淵鈺,

曹淑琳2, 孫海燕*,2, 陳懷谷*,1,2

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護學(xué)院，南京 210095；2. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護研究所，南京 210014)

病原菌對殺菌劑的抗性風(fēng)險主要與其遺傳特性、藥劑作用機制及特點、施藥方式和頻率以及發(fā)病環(huán)境條件等多方面因素相關(guān)，明確殺菌劑的抗性風(fēng)險，對于指導(dǎo)該藥劑的科學(xué)使用以及制定合理有效的抗性治理策略具有重要意義[1-2]。

由禾谷鐮孢菌Fusarium graminearum等侵染引起的小麥赤霉病是我國小麥生產(chǎn)上最具威脅的流行性病害之一[3]。該病害的流行不僅可造成小麥大幅減產(chǎn)，還可產(chǎn)生脫氧雪腐鐮孢菌烯醇 (DON)等多種毒素，污染谷物，威脅人和動物的健康[4-5]。目前生產(chǎn)中對該病害的防治主要以種植抗病品種和施用化學(xué)藥劑為主。我國自20 世紀(jì)70 年代以來一直使用苯并咪唑類殺菌劑多菌靈防治小麥赤霉病，由于長期依賴該藥劑，很多省份已經(jīng)出現(xiàn)抗藥性問題[6]。麥角甾醇脫甲基抑制劑類(DMIs)殺菌劑戊唑醇已被廣泛用于我國小麥赤霉病的防治，目前也已有抗性產(chǎn)生的相關(guān)報道[7-8]。氰烯菌酯是我國自主研發(fā)的一種新型氰基丙烯酸酯類殺菌劑，對小麥赤霉病有良好的防效，雖然目前還未見關(guān)于其田間抗性的報道，但已有研究表明小麥赤霉病菌對該藥劑存在較高的抗性風(fēng)險，不能長期單一使用[9]。因此，及時引進和開發(fā)新殺菌劑，對延緩小麥赤霉病菌抗藥性的產(chǎn)生和有效控制該病害具有重要意義。

DMIs 殺菌劑葉菌唑于2019 年起在我國登記用于小麥赤霉病防治，但目前尚未見關(guān)于其抗性水平及抗性風(fēng)險方面的系統(tǒng)報道。明確我國小麥赤霉病菌對葉菌唑的敏感性水平、抗性風(fēng)險和抗性機制，可為制定該藥劑的使用策略提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 用于測定敏感性水平的100 株小麥赤霉病菌于2012?2014 年采集自江蘇、安徽、山東和河南4 個省份的小麥穗部病樣，采用組織分離法分離獲得。菌株進行單孢分離后轉(zhuǎn)入PDA 斜面試管，于4 ℃冰箱中保存。所有菌株經(jīng)tef-1α基因擴增比對鑒定為禾谷鐮孢菌Fusarium graminearum，以F + 年份 + 序號進行命名。從中選取4 株菌株 (F1405、F1407、F1321 和F1330)以及本實驗室分離鑒定并保存的1 株小麥赤霉病菌株 (F1095，采自江蘇省) 用于藥劑馴化，經(jīng)測定這些菌株均對葉菌唑敏感。

1.1.2 供試小麥 品種為淮麥33，按照常規(guī)方法進行種植和田間管理。

1.1.3 藥劑及試劑 98%葉菌唑 (metconazole) 原藥，高郵市豐田農(nóng)藥有限公司；95%戊唑醇 (tebuconazole)原藥，拜耳 (中國) 有限公司；97% 丙硫菌唑(prothioconazole) 原藥，安徽久易農(nóng)業(yè)股份有限公司；97%咪鮮胺 (prochloraz) 原藥，江蘇輝豐農(nóng)化股份有限公司；95% 丙環(huán)唑 (propiconazole) 原藥，江蘇耕耘化學(xué)有限公司；95%三唑酮 (triadimefon)原藥，江蘇劍牌農(nóng)化股份有限公司；95%氰烯菌酯 (phenamacril) 原藥，江蘇農(nóng)藥研究所股份有限公司。所有原藥均用甲醇配制成1.0 × 104和1.0 ×103μg/mL 的母液備用。

1.1.4 供試培養(yǎng)基 PDA 培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂20 g，用蒸餾水定容至1000 mL，于121 ℃高溫高壓滅菌30 min。胡蘿卜培養(yǎng)基：胡蘿卜200 g，加蒸餾水500 mL 后于121 ℃高溫高壓滅菌10 min， 勻漿后加入20 g 瓊脂，用蒸餾水定容至1000 mL，再次于121 ℃高溫高壓滅菌30 min。6%綠豆湯培養(yǎng)基：綠豆60 g，煮沸后的綠豆湯經(jīng)4 層紗布過濾，用蒸餾水定容至1000 mL 并分裝，于115 ℃高溫高壓滅菌25 min。V8 培養(yǎng)基：V8 果汁160 mL，酶水解酪素 1 g, 碳酸鈣 1 g, 瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL，于121 ℃高溫高壓滅菌30 min。

1.1.5 基因檢測試劑 真菌DNA 提取試劑盒 (貨號：D2300-50) ，北京索萊寶科技有限公司；Trizol RNA 分離試劑 (貨號：15596026) ，Invitrogen-賽默飛世爾中國；PrimeScriptTM∏ 1st Strand cDNA Synthesis 試劑盒 (貨號：6210A) ，寶日醫(yī)生物技術(shù) (北京) 有限公司。

1.2 小麥赤霉病菌對葉菌唑的敏感性測定

采用菌絲生長速率法[10]。將藥劑與PDA 培養(yǎng)基混勻，配制成藥劑最終質(zhì)量濃度分別為0.03、0.1、0.3、1 和3 μg/mL 的含藥平板，以加入等體積甲醇的PDA 平板為對照。在預(yù)先培養(yǎng)好的小麥赤霉病菌近邊緣處制取直徑為5 mm 的菌碟，菌絲面向下接種于平板中央，25 ℃恒溫培養(yǎng)。每處理重復(fù)3 次。3 d 后采用十字交叉法測量各處理的菌落直徑，計算菌絲生長抑制率。根據(jù)濃度和抑制率，利用DPS 軟件計算EC50和r值。

1.3 抗性突變體馴化獲得及生存適合度研究

1.3.1 藥劑馴化 采用分生孢子萌發(fā)抑制法[10]測定葉菌唑?qū)τH本菌株孢子萌發(fā)的最小抑制濃度(MIC) 。收集分生孢子懸浮液，均勻涂布到含MIC 濃度藥劑的V8 平板上，每個平板涂布孢子量約為2 × 104個，每個菌株涂布50 個含藥平板。25 ℃恒溫培養(yǎng)，30 d 后挑取角變區(qū)或生長較大的菌落轉(zhuǎn)接到含相同濃度藥劑的V8 平板上，將能在含藥平板上快速生長的菌絲轉(zhuǎn)移到空白V8 平板上保存，即為疑似抗性突變體。疑似抗性突變體在空白V8 平板上轉(zhuǎn)接4 次后，如果抗性仍然存在，則確定為抗性突變體，將馴化所得抗性突變體在空白PDA 平板上再轉(zhuǎn)接4 次，進一步驗證其抗性遺傳穩(wěn)定性。按照 (1) 式計算抗性倍數(shù) (RI) 。

式中，EC50(R)為抗性突變體的EC50值，EC50(S)為親本菌株的EC50值。

按照 (2) 式計算用于區(qū)分敏感菌株和抗性突變體的抗性倍數(shù) (RID) 。

式中，EC50(A)為敏感性基線中最不敏感菌株的EC50值；EC50(M)為敏感性基線的平均EC50值。

抗性分級標(biāo)準(zhǔn)：R I ≤R ID為敏感菌株；RID50 為高抗菌株。

1.3.2 生存適合度研究

菌絲生長能力測定：在預(yù)培養(yǎng)2 ～ 3 d 的菌落近邊緣打取直徑5 mm 的菌碟，菌絲面向下轉(zhuǎn)接到空白PDA 平板中央，25 ℃下黑暗培養(yǎng)，3 d 后用十字交叉法測量菌落直徑。每個菌株重復(fù)3 次，試驗重復(fù)2 次。

產(chǎn)分生孢子能力測定：在預(yù)培養(yǎng)2 ～ 3 d 的菌落近邊緣打取直徑5 mm 的菌碟，接種于6% 綠豆湯培養(yǎng)基中，每瓶接種3 個菌碟，于25 ℃、120 r/min 下振蕩培養(yǎng)，2 d 后用血球計數(shù)板測算孢子濃度。每個菌株設(shè)3 個重復(fù)，每個重復(fù)統(tǒng)計3 次分生孢子數(shù)，試驗重復(fù)2 次。

穗期致病力測定：于小麥揚花期采用單小花滴注接種法[11]接種濃度為1 × 105～ 2 × 105個/mL的病原菌分生孢子懸浮液。每個菌株接種10 個麥穗，每個麥穗接種10 μL 孢子懸浮液。接種后每天噴霧保濕，第28 天時統(tǒng)計發(fā)病小麥穗數(shù)。

1.4 交互抗性測定

采用菌絲生長速率法[10]，分別測定親本菌株和抗性突變體對DMIs 殺菌劑戊唑醇、丙環(huán)唑、丙硫菌唑、三唑酮、咪鮮胺和氰基丙烯酸酯類殺菌劑氰烯菌酯的敏感性，分析葉菌唑與這6 種殺菌劑之間有無交互抗性關(guān)系。

1.5 CYP51 基因序列以及基因表達分析

1.5.1 樣品收集與處理 菌株在空白PDA 平板上預(yù)培養(yǎng)4 d 后收集菌絲，按照DNA 提取試劑盒說明提取DNA，采用Trizol 提取總RNA，按照PrimeScriptTM∏ 1st Strand cDNA Synthesis 試劑盒說明書方法合成cDNA。

1.5.2 引物的設(shè)計合成 根據(jù)EnsemblFungi 基因庫中小麥赤霉病菌的14α-脫甲基酶P450 (CYP51)基因序列 (CYP51A，F(xiàn)GSG_04092；CYP51B，F(xiàn)GSG_01000；CYP51C，F(xiàn)GSG_11024) 設(shè)計基因開放閱讀框 (ORF) 和啟動子區(qū)域的擴增引物及熒光定量PCR 引物。所有引物由上海生工生物股份有限公司合成，引物序列以及擴增長度見表1。

表1 小麥赤霉病菌CYP51 基因擴增以及熒光定量分析引物Table 1 Primers used for amplifying CYP51 genes of Fusarium graminearum and qRT-PCR

1.5.3 PCR 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件 ORF 和啟動子區(qū)域擴增PCR 反應(yīng)體系為50 μL，包含：dd H2O 18 μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL, 10 mmol/L dNTP Mix 1 μL, 2 × Phanta Max Buffer 25 μL，10 μmol/L 上下游引物各2 μL，模板DNA 1 μL。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，退火15 s，72 ℃延伸(30 s/kb )，共35 個循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。擴增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測。使用Axy PreP TM DNA Gel Extraction Kit 回收目的擴增片段，將回收產(chǎn)物送上海生工生物股份有限公司測序，通過Blast 軟件進行親本和抗性突變體中CYP51基因序列比對。

qRT-PCR 反應(yīng)體系為20 μL，包含：dd H2O 6 μL，2 × SYBR Premix Ex Taq 10 μL (TaKaRa)，ROX reference dye ∏ 0.4 μL，10 μmol/L 上下游引物各0.8 μL，模板cDNA 2 μL。擴增曲線PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性20 s；95 ℃變性3 s，60 ℃退火30 s，循環(huán)40 次；72 ℃單點檢測信號。溶解曲線PCR 反應(yīng)條件：95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，95 ℃變性15 s，連續(xù)檢測信號。采用 2?△△Ct法對基因表達數(shù)據(jù)進行相對定量分析。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗結(jié)果數(shù)據(jù)采用DPS 處理系統(tǒng)的LSD 法進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥赤霉病菌對葉菌唑的敏感性

供試100 株小麥赤霉病菌對葉菌唑的敏感性分布見圖1。其中，EC50值最高為0.51 μg/mL，最低為0.04 μg/mL，相差12.75 倍；平均EC50值為(0.18 ± 0.09) μg/mL。供試菌株群體對葉菌唑的敏感性頻率分布呈近似正態(tài)的連續(xù)性單峰曲線，尚未出現(xiàn)抗藥性亞群體，因此可將所得平均EC50值作為其敏感性基線的參考值，用于監(jiān)測田間抗藥性的演化。

圖1 供試100 株小麥赤霉病菌對葉菌唑的敏感性頻率分布Fig. 1 Sensitivity distribution of 100 isolates of Fusarium graminearum to metconazole

同一省份中不同菌株對葉菌唑的敏感性存在差異，其中差異最大的是山東省的菌株，其EC50最大值和最小值相差9.9 倍；差異最小的是河南省的菌株，最大值和最小值相差3.9 倍。不同省份菌株之間對葉菌唑的敏感性差異不顯著，4 個省份菌株的平均EC50值范圍為0.15 ～ 0.20 μg/mL (表2) 。

表2 不同省份小麥赤霉病菌對葉菌唑的敏感性Table 2 Sensitivity of F. graminearum from different provinces to metconazole

2.2 抗性突變體及其抗性水平

葉菌唑?qū)? 株親本菌株分生孢子萌發(fā)的MIC值為2 μg/mL。通過藥劑馴化共獲得46 株疑似抗性突變體，在空白平板上轉(zhuǎn)接8 代后，有12 株仍表現(xiàn)為抗性，其中2 株抗性水平分別為14.20 和15.80 倍，表現(xiàn)為中抗，其余10 株抗性水平在3.25 ～ 9.05 倍之間，表現(xiàn)為低抗 (表3) 。

表3 抗性突變體及親本菌株對葉菌唑的敏感性Table 3 Sensitivity of mutants and their parent isolates to metconazole

2.3 抗性突變體的生存適合度

與親本菌株相比，部分抗性突變體的菌絲生長速率及產(chǎn)分生孢子能力下降，部分抗性突變體與親本菌株相似；所有抗性突變體對小麥穗的致病力均顯著降低，其中F1405-M1、F1405-M10和F1407-M1 菌株幾乎完全喪失了致病力 (表4) 。

表4 抗性突變體及親本菌株的生存適合度Table 4 Fitness of metconazole-resistant mutants and their parent isolates

2.4 交互抗性

在12 株葉菌唑抗性突變體中，由F1321 誘導(dǎo)獲得的4 株抗性突變體抗性倍數(shù)較高，因此選擇這4 株抗性突變體及其親本菌株進行交互抗性研究。結(jié)果 (表5) 表明：5 種DMIs 殺菌劑對親本菌株F1321 的抑制活性存在差異，其中，丙硫菌唑、戊唑醇和咪鮮胺活性較好，三唑酮活性較差。4 株葉菌唑抗性突變體對戊唑醇均表現(xiàn)為抗性，抗性倍數(shù)在3.68 ～ 16.73 之間；對丙硫菌唑和三唑酮均表現(xiàn)為敏感；F1321-M1 和F1321-M4 對丙環(huán)唑和咪鮮胺表現(xiàn)為抗性。所有抗性突變體對氰烯菌酯均表現(xiàn)為敏感。

表5 親本菌株F1321 及其葉菌唑抗性突變體對其他殺菌劑的敏感性Table 5 Sensitivity of parent isolate F1321 and its metconazole-resistant mutants to other fungicides

2.5 CYP51 基因序列及基因表達

與親本菌株F1321 相比，4 株抗性突變體的CYP51A、CYP51B和CYP51C基因的ORF 及啟動子區(qū)域序列均未發(fā)生突變。其中，CYP51C基因在親本菌株和抗性突變體中表達量均較低，無法定量進行差異分析；CYP51A基因在4 株抗性突變體中表達量均上調(diào)，上調(diào)倍數(shù)范圍為1.33 ～ 10.28；CYP51B基因在抗性突變體F1321-M1 中表達量上調(diào)，在F1321-M4、F1321-M5 及F1321-M6中表達量下調(diào) (圖2) 。

圖2 CYP51A (FGSG_04092) 和CYP51B (FGSG_01000)在抗性突變體及其親本菌株中的相對表達量Fig. 2 Relative expression levels of CYP51A(FGSG_04092), and CYP51B (FGSG_01000) in metconazole-resistant mutants and their corresponding parental isolate

3 討論與結(jié)論

近十多年來，我國小麥赤霉病流行形勢仍然嚴(yán)峻，病害防控中主要還是依賴氰烯菌酯、戊唑醇和丙硫菌唑等殺菌劑，為了延緩現(xiàn)有殺菌劑的使用壽命，開發(fā)使用一些全新的或者還未在我國小麥赤霉病防治上登記使用的殺菌劑迫在眉睫。

建立病原菌對殺菌劑的敏感性基線對檢測田間菌株敏感性變化具有重要意義，目前已有一些關(guān)于小麥赤霉病菌對葉菌唑敏感性的研究報道。Spolti 等[12-13]的研究表明，葉菌唑?qū)?2009–2010 年采自巴西不同地區(qū)的50 株小麥赤霉病菌的EC50值范圍為0.001 ～ 0.324 μg/mL，對2011 年采自美國紐約州不同地區(qū)的50 株小麥赤霉病菌的EC50值范圍為0.05 ～ 0.86 μg/mL。段亞冰等[14]測得葉菌唑?qū)ξ覈K省67 株小麥赤霉病菌的EC50值范圍為0.02 ～ 0.08 μg/mL。本研究測定的100 株小麥赤霉病菌對葉菌唑的敏感性水平與Spolti 等和段亞冰等的結(jié)果相近，EC50值范圍為0.04 ～ 0.51 μg/mL。所測100 株小麥赤霉病菌對葉菌唑的敏感性頻率分布呈近似正態(tài)的連續(xù)性單峰曲線，尚未出現(xiàn)抗藥性亞群體，因此可將其平均EC50值作為田間小麥赤霉病菌對葉菌唑抗性監(jiān)測的參考指標(biāo)。本研究采用的菌株樣本覆蓋了我國多個小麥主產(chǎn)區(qū)省份，因此所建立的敏感性基線參考值具有更廣的適用性。

DMIs 具有廣譜的抗菌活性，常用于醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域多種真菌病害的防治。該類藥劑主要作用于細胞膜上麥角甾醇的合成過程，病原菌對其產(chǎn)生抗性與靶標(biāo)基因14α-脫甲基酶P450 基因(CYP51)的點突變或過量表達、ABC 和MFS 轉(zhuǎn)運蛋白的過量表達相關(guān)[15]。雖然殺菌劑抗性行動委員會 (FRAC) 把該類藥劑劃分為低到中等抗性風(fēng)險[15]，但由于長期重復(fù)使用，部分病原菌對其已經(jīng)產(chǎn)生抗性[7-8,16-21]。歐美等國家1990 年左右已將DMIs 藥劑廣泛用于小麥上病害的防治，其中葉菌唑、丙硫菌唑以及丙硫菌唑和戊唑醇的復(fù)配藥劑都被認為是防治小麥赤霉病的有效藥劑[22]。近幾年來，DMIs 在我國已被廣泛用于小麥赤霉病的防治，其中主要以戊唑醇單劑、咪鮮胺和戊唑醇復(fù)配藥劑以及氰烯菌酯和戊唑醇復(fù)配藥劑為主，但關(guān)于小麥赤霉病菌對DMIs 抗性的研究報道仍較少。Spolti 等[13]測定了50 株采自美國紐約地區(qū)的小麥赤霉病菌對戊唑醇和葉菌唑的敏感性，發(fā)現(xiàn)這50 株菌株對葉菌唑仍表現(xiàn)為敏感，其中2 株菌株對戊唑醇表現(xiàn)為低抗。尹燕妮等[7]于2009 年檢測了159 株小麥赤霉病菌對戊唑醇的敏感性，其中3 株表現(xiàn)為低抗。因此，根據(jù)已有報道看，小麥赤霉病菌對DMIs 的田間抗性風(fēng)險較小。本研究發(fā)現(xiàn)，部分葉菌唑抗性突變體對戊唑醇、丙環(huán)唑及咪鮮胺也表現(xiàn)為抗性，對丙硫菌唑和三唑酮則未表現(xiàn)抗性；部分突變體僅對戊唑醇表現(xiàn)為抗性，對其他DMIs 藥劑則不表現(xiàn)抗性，這種現(xiàn)象在已有的研究中也有報道。段亞冰等[14]測定了5 株葉菌唑抗性突變體對其他DMIs 藥劑的敏感性，發(fā)現(xiàn)有2 株對種菌唑 (ipconazole) 、咪鮮胺、氟環(huán)唑 (epoxiconazole) 、苯醚甲環(huán)唑和戊唑醇也表現(xiàn)為抗性，有3 株對種菌唑和咪鮮胺表現(xiàn)為敏感，對氟環(huán)唑、苯醚甲環(huán)唑和戊唑醇表現(xiàn)為抗性。Spolti 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，田間戊唑醇抗性菌株對葉菌唑表現(xiàn)為敏感。上述研究表明DMIs 藥劑之間存在復(fù)雜的交互抗性關(guān)系。本研究中獲得的4 株抗性突變體的CYP51A基因表達量均上調(diào)，但它們對其他DMIs 藥劑的交互抗性表現(xiàn)卻不一致，表明可能還存在其他的抗性機制。后續(xù)需要進一步針對DMIs 藥劑的抗性機制進行研究，以便進一步明確它們之間的交互抗性關(guān)系。

相關(guān)報道表明，病原菌對DMIs 殺菌劑產(chǎn)生抗性的機制主要與CYP51基因的點突變或過量表達相關(guān)[15]。本研究對4 株葉菌唑抗性突變體的CYP51基因進行了檢測，發(fā)現(xiàn)4 株抗性突變體的CYP51A、CYP51B和CYP51C基因序列均未發(fā)生突變，但CYP51A基因表達量均有所上調(diào)，上調(diào)倍數(shù)最高為10.28。Schnabel 等[23]比較了未使用過和使用過多年DMIs 殺菌劑果園采集的蘋果黑腥病菌Venturia inaequalis CYP51A的表達量，發(fā)現(xiàn)抗性菌株的CYP51A表達量顯著高于敏感菌株，且部分抗性菌株的CYP51A啟動子區(qū)域有553 bp片段的插入。Stammler 等[24]研究發(fā)現(xiàn)，110 株小麥葉銹病菌Puccinia triticina對氟環(huán)唑的敏感性與其CYP51基因的表達具有一定相關(guān)性 (r=0.56)，部分對氟環(huán)唑敏感性下降的菌株其CYP51基因表達量高于敏感菌株。Liu 等[25]的研究表明，DMIs殺菌劑戊唑醇能夠激活病原菌體內(nèi)的高滲透甘油(H O G) 激酶信號途徑，該途徑上被激活的Hog1 激酶進入細胞核，進而磷酸化轉(zhuǎn)錄因子FgSR，磷酸化的FgSR 將染色質(zhì)重塑復(fù)合體SWI/SNF 插入到CYP51s基因的啟動子區(qū)域，從而引起CYP51A和CYP51B基因的高水平轉(zhuǎn)錄。本研究中4 株葉菌唑抗性突變體的3 個CYP51基因啟動子區(qū)域均未發(fā)生改變，其CYP51A和CYP51B基因表達量改變的機制還需進一步研究。

綜上所述，本研究通過藥劑馴化方法獲得小麥赤霉病菌抗葉菌唑突變體，并對突變體的適合度進行了研究，發(fā)現(xiàn)在離體條件下小麥赤霉病菌對葉菌唑易產(chǎn)生抗性，但抗性水平較低，且抗藥性菌株的適合度下降，表明小麥赤霉病菌對葉菌唑的抗性風(fēng)險較低。因此，葉菌唑可作為我國小麥赤霉病防治藥劑，但需做好其田間抗性監(jiān)測，建議與作用機制不同的藥劑混合或交替使用，以延緩抗性產(chǎn)生，延長藥劑使用壽命。