李秀環(huán), 禾麗菲, 李北興, 姜 林, 劉 峰, 慕 衛(wèi)*,

(1. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院/山東省蔬菜病蟲生物學(xué)重點實驗室/山東省高校農(nóng)藥毒理與應(yīng)用技術(shù)重點實驗室，山東 泰安 271018；2. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 化工與材料科學(xué)學(xué)院，山東 泰安 271018)

番茄葉霉病由真菌黃枝孢菌Passalora fulva(Cooke) U. Braun & Crous (syn.Cladosporium fulvum) 侵染葉片引起[1]，是危害番茄生產(chǎn)的世界性重要病害[2-4]。該病在保護(hù)地和露地均有發(fā)生，尤其是近年來隨著中國保護(hù)地番茄種植面積的增加，為該病發(fā)生和傳播提供了有利條件，對番茄產(chǎn)量和品質(zhì)帶來了嚴(yán)重威脅[5-6]。

化學(xué)防治是目前防治番茄葉霉病的主要手段，但國內(nèi)外已報道多種藥劑的防效不斷降低。如番茄葉霉病菌對代森錳鋅、多菌靈等藥劑均已產(chǎn)生不同程度的抗性[7-8]，遼寧省番茄葉霉病菌己經(jīng)對氟硅唑產(chǎn)生了不同程度的抗性[9]，在山東部分地區(qū)該菌對嘧菌酯等產(chǎn)生了抗性[10-11]。因此，亟待篩選新的防治藥劑。

由先正達(dá)作物保護(hù)公司開發(fā)的氟唑菌酰羥胺(圖式1) 作為首個苯基-乙基-吡唑-芳酰胺類琥珀酸脫氫酶抑制劑 (SDHI) 類殺菌劑的代表品種[12]，主要通過抑制呼吸鏈復(fù)合物II 中的泛醌還原反應(yīng)，進(jìn)而影響三羧酸循環(huán)以及菌體的呼吸作用而發(fā)揮效果。氟唑菌酰羥胺具有廣譜、內(nèi)吸和環(huán)境安全性高等優(yōu)點，對多種植物病原菌具有很好的抑制活性[13-14]，尤其是對大豆灰斑病菌Cercospora sojina、多主棒孢菌Corynespora cassiicola和油菜菌核菌Sclerotinia sclerotiorum等[12,15-16]防效優(yōu)異。該藥劑與苯醚甲環(huán)唑的混劑在中國于2020 年獲得登記，用于番茄葉霉病等的防治[17]，但目前尚未見關(guān)于番茄葉霉病菌對氟唑菌酰羥胺敏感性水平的相關(guān)報道。為此，本研究擬建立番茄葉霉病菌對氟唑菌酰羥胺的敏感基線，明確氟唑菌酰羥胺對番茄葉霉病菌的作用方式及田間防病效果，為指導(dǎo)合理使用該藥劑防治番茄葉霉病和進(jìn)一步開展抗性監(jiān)測提供依據(jù)。

圖式 1 氟唑菌酰羥胺化學(xué)結(jié)構(gòu)式Scheme 1 The structural formula of pydiflumetofen

1 材料與方法

1.1 材料

藥劑：98%氟唑菌酰羥胺 (pydiflumetofen) 原藥和200 g/L 氟唑菌酰羥胺懸浮劑(pydiflumetofen SC)，瑞士先正達(dá)作物保護(hù)有限公司；41.7%氟吡菌酰胺懸浮劑 (fluopyram SC)，拜耳作物科學(xué)(中國) 有限公司；70% 甲基硫菌靈可濕性粉劑(thiophanate-methyl WP)，江蘇龍燈化學(xué)有限公司。其中，氟唑菌酰羥胺原藥用二甲基亞砜溶解，配制成10000 mg/L 的母液，備用。

供試培養(yǎng)基：PDA 培養(yǎng)基 (馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g ，瓊脂粉15 g，用去離子水定容至1000 mL)；WA 培養(yǎng)基 (水瓊脂培養(yǎng)基：瓊脂粉15 g，葡萄糖20 g，用去離子水定容至1000 mL)。

1.2 氟唑菌酰羥胺對番茄葉霉病菌的抑制活性

在所有供試菌株中隨機(jī)選擇3 株采自不同地區(qū)的番茄葉霉病菌[18]，用于測定氟唑菌酰羥胺對病原菌菌絲生長、分生孢子萌發(fā)和芽管伸長的抑制活性。

1.2.1 對菌絲生長的抑制活性 采用菌絲生長速率法[19]測定。將10000 mg/L 的氟唑菌酰羥胺母液用二甲基亞砜稀釋，與加熱冷卻至45～55 ℃、已滅菌的PDA 培養(yǎng)基混合，配制成氟唑菌酰羥胺質(zhì)量濃度為0.01、0.05、0.1、0.5、1、5 和10 μg/mL 的含藥平板。將培養(yǎng)20 d 的菌株用打孔器在菌落邊緣打取直徑5 mm 的菌餅，菌絲面朝下接種在含藥平板上，以含相同體積的二甲基亞砜與培養(yǎng)基混合作為空白對照。于25 ℃下培養(yǎng)20 d 后，用十字交叉法測量菌落直徑，每處理重復(fù)3 次，根據(jù)公式 (1) 計算各藥劑處理對菌絲生長的抑制率 (Id，%)。

式中：Dc為對照菌落直徑；Dt為藥劑處理菌落直徑。

1.2.2 對分生孢子萌發(fā)和芽管伸長的抑制活性

采用孢子萌發(fā)法[18]測定。供試菌株培養(yǎng)30 d后，用無菌去離子水將分生孢子洗下，用雙層紗布過濾得到孢子懸浮液，在顯微鏡下調(diào)節(jié)孢子濃度至1 × 105個/mL，備用。用無菌去離子水稀釋氟唑菌酰羥胺母液，與加熱冷卻至45～55 ℃的WA 培養(yǎng)基混勻，配制成藥劑質(zhì)量濃度為0.01、0.05、0.1、0.5、1、5 和10 μg/mL 的含藥平板。移取100 μL 孢子懸浮液均勻涂布在培養(yǎng)基表面，置于25 ℃生化培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，以含相同體積的二甲基亞砜為空白對照，每處理重復(fù)3 次。于培養(yǎng)16 h (20 h) 后在顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)情況 (以芽管長度大于孢子短半徑視為萌發(fā))，待空白對照組萌發(fā)率達(dá)到90%以上時，記錄各處理孢子萌發(fā)情況 (芽管長度)，每重復(fù)隨機(jī)調(diào)查100 個孢子。根據(jù)公式 (2) 和 (3) 計算各處理的孢子萌發(fā)抑制率(Ig，%) 和芽管伸長抑制率 (Ie，%)，并計算相應(yīng)的EC50值。

Topping和Ehly［6］把同伴協(xié)助學(xué)習(xí)定義為地位相等或水平相配的同伴共同幫助和支持來獲得知識和技能。這一廣義的定義讓我們更好地理解由Foot和Howe［7］做出的闡述：“總之，在教學(xué)實踐中協(xié)作學(xué)習(xí)和同伴指導(dǎo)(peer tutoring)進(jìn)一步鞏固了同伴協(xié)助學(xué)習(xí)過程中實際使用的相關(guān)技巧?！盨mith和Mac-Gregor［8］進(jìn)一步解釋了“合作學(xué)習(xí)體現(xiàn)出了協(xié)作學(xué)習(xí)精心構(gòu)架的最終目的”。合作學(xué)習(xí)在范圍上從屬于協(xié)作學(xué)習(xí)，而協(xié)作學(xué)習(xí)和相對獨立的同伴指導(dǎo)又從屬于同伴協(xié)助學(xué)習(xí)。

式中：Rc為空白對照孢子萌發(fā)率；Rt為藥劑處理孢子萌發(fā)率。

式中：Ec為空白對照芽管長度；Et為藥劑處理芽管長度。

1.3 不同地區(qū)番茄葉霉病菌對氟唑菌酰羥胺的敏感性

采用菌絲生長速率法[19]測定。參照1.2 節(jié)中的方法，對采集自山東省的106 株番茄葉霉病菌測定其對氟唑菌酰羥胺的敏感性，計算氟唑菌酰羥胺對各地區(qū)菌株的菌絲生長抑制率。采用DPS 7.05 軟件分析敏感性數(shù)據(jù)的異常值，剔除后建立敏感基線。

1.4 氟唑菌酰羥胺對番茄葉霉病的田間防效

參照《農(nóng)藥田間藥效試驗準(zhǔn)則》中關(guān)于番茄葉霉病的部分進(jìn)行[20]。試驗分別于2018 年5 月和2019 年4 至5 月在泰安市岱岳區(qū)東大吳村蔬菜大棚進(jìn)行。供試番茄Solanum lycopersicum品種為金鵬11-8。供試藥劑為200 g/L 氟唑菌酰羥胺SC，設(shè)有效成分 100、150、200 g/hm23 個施藥劑量，對照藥劑為41.7%氟吡菌酰胺SC 有效成分 200 g/hm2和70%甲基硫菌靈WP 有效成分 540 g/hm2，以清水處理為空白對照。每小區(qū)28 m2，每個處理4 個小區(qū)，處理小區(qū)按照隨機(jī)區(qū)組設(shè)計并且設(shè)置保護(hù)行。使用WS-16 農(nóng)用背負(fù)式噴霧器施藥。

保護(hù)作用試驗于發(fā)病前開始施藥，施藥兩次，施藥間隔期7 d，于末次施藥后7 d 調(diào)查各處理病級，計算病情指數(shù)。治療作用試驗于發(fā)病初期開始施藥，施藥前調(diào)查各處理病級并計算病情指數(shù)，施藥3 次，于末次施藥后6 d 再調(diào)查各處理病級并計算病情指數(shù)。

病級調(diào)查方法：每小區(qū)取樣3 個點，每點調(diào)查5 株，每株調(diào)查上中下3 片復(fù)葉，以復(fù)葉上每張小葉片病斑面積占整個小葉片面積的百分率分級，分級標(biāo)準(zhǔn)[20]為：0 級，無病斑；1 級，病斑面積占整個小葉面積的5%以下；3 級，病斑面積占整個小葉面積的>5%～10%；5 級，病斑面積占整個小葉面積的>10%～20%；7 級，病斑面積占整個小葉面積的>20%～50%；9 級，病斑面積占整個小葉面積的50%以上。按公式 (4)～(6) 計算各處理病情指數(shù) (Di) 及田間防效 (Ep或Ec，%)。

式中：Na為各級病葉數(shù)；a為相對級數(shù)值(1，2，3，…，9)；n為葉片數(shù)。

式中：Ep為保護(hù)作用防治效果；Dic為對照區(qū)病情指數(shù)；Dit為處理區(qū)病情指數(shù)。

式中：Ec為治療作用防治效果；Dica為空白對照藥前的病情指數(shù)；Dicb為空白對照藥后的病情指數(shù)；Dita為藥劑處理藥前的病情指數(shù)；Ditb為藥劑處理藥后的病情指數(shù)。

田間防效數(shù)據(jù)通過反正弦轉(zhuǎn)換后，用Tukey法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)育階段番茄葉霉病菌對氟唑菌酰羥胺的敏感性

如圖1 所示，氟唑菌酰羥胺對3 株番茄葉霉病菌菌株的不同發(fā)育階段抑制活性均較高。其中，孢子萌發(fā)和芽管伸長階段相對較為敏感，EC50平均值分別為0.13 和0.09 μg/mL，在0.1 μg/mL 時的抑制率均達(dá)50%以上；而對菌絲生長的抑制活性相對較弱，平均EC50值為 0.66 μg/mL，在1.0 mg/L 時抑制率為60.3% 。

圖1 氟唑菌酰羥胺對番茄葉霉病菌不同發(fā)育階段的抑制活性Fig. 1 Inhibition activity of pydiflumetofen on P. fulva at different development stages

2.2 山東省不同地區(qū)番茄葉霉病菌對氟唑菌酰羥胺的敏感性

采自山東省8 個地區(qū)的106 株番茄葉霉病菌對氟唑菌酰羥胺的敏感性均較高，EC50值范圍為0.04～3.90 μg/mL，平均EC50值為0.72 μg/mL。其中淄博菌株對氟唑菌酰羥胺敏感性最低，平均EC50值為1.59 μg/mL，顯著高于其他地區(qū)，其最大EC50值為3.90 μg/mL；聊城菌株的敏感性最高，平均EC50值為0.57 μg/mL，但與其他敏感地區(qū)并無顯著差異；在所有菌株中，最敏感菌株來自泰安，其EC50值為0.04 μg/mL，與最大值相差90.84 倍 (圖2)。

圖2 山東省不同地區(qū)的番茄葉霉病菌對氟唑菌酰羥胺的敏感性Fig. 2 The sensitivity of P. fulva isolates collected from different regions of Shandong Province to pydiflumetofen

2.3 番茄葉霉病菌對氟唑菌酰羥胺的敏感基線

利用菌絲生長速率法測定了106 株番茄葉霉病菌對氟唑菌酰羥胺的敏感性，經(jīng)分析剔除3 個異常值，選擇其他103 株繪制敏感性頻率曲線。結(jié)果顯示：敏感性頻率分布呈單峰曲線，其EC50值分布范圍為0.04～1.74 μg/mL，平均值為 (0.67 ±0.41) μg/mL (圖3)，可以之作為山東地區(qū)番茄葉霉病菌對氟唑菌酰羥胺的敏感基線。

圖3 番茄葉霉病菌對氟唑菌酰羥胺的敏感性頻率分布Fig. 3 Sensitivity frequency distribution of P. fulva to pydiflumetofen

2.4 氟唑菌酰羥胺對番茄葉霉病的田間防治效果

2018 年的試驗結(jié)果顯示 (表1)：保護(hù)作用測定中，處理組氟唑菌酰羥胺和對照藥劑氟吡菌酰胺對番茄葉霉病的防效均達(dá)70%以上，顯著高于對照藥劑甲基硫菌靈的防效，其中200 g/L 氟唑菌酰羥胺SC 有效成分200 g/hm2施藥劑量下，防效為89.55%，顯著高于100 g/hm2下的防效，稍高于對照藥劑氟吡菌酰胺的防效，但差異并不顯著；而在治療作用測定中，最高劑量氟吡菌酰胺的防效顯著高于對照藥劑。

表1 氟唑菌酰羥胺對番茄葉霉病的田間防效Table 1 The field efficacy of pydiflumetofen in controlling tomato leaf mold

2019 年的試驗結(jié)果 (表1) 顯示：保護(hù)作用中，200 g/L 氟唑菌酰羥胺SC 有效成分150、200 g/hm2和對照藥劑氟吡菌酰胺150 g/hm2的防效均在80%以上，同等劑量下200 g/L 氟唑菌酰羥胺SC 與對照藥劑氟吡菌酰胺的防效差異不顯著；治療作用中，氟唑菌酰羥胺在最高劑量下的防效顯著高于其他處理組防效，且在同等劑量下，氟唑菌酰羥胺的防效顯著高于對照藥劑氟吡菌酰胺。由于第二年的治療作用試驗施藥后發(fā)病較重，致使所有處理組的防效普遍低于第一年的防效。

綜合兩年的試驗結(jié)果表明，氟唑菌酰羥胺的保護(hù)性防效高于治療性防效，且在安全劑量下，其防效與劑量呈正相關(guān)，并顯著高于對照藥劑甲基硫菌靈有效成分540 g/hm2的防效。

3 結(jié)論與討論

氟唑菌酰羥胺作為一種新型SDHI 類殺菌劑，對多種植物葉部病原菌(如小麥禾谷鐮刀菌、大豆葉斑病菌、多主棒孢、番茄灰霉病菌、蘋果黑星病菌等) 均有很好的活性[12-14,21-22]。本研究首次明確了該藥劑對番茄葉霉病菌有很高的毒力，其中對孢子萌發(fā)和芽管伸長的活性稍高于對菌絲生長的，并且該藥劑對不同生長階段番茄葉霉病菌的抑制活性存在一定差異，可能與不同發(fā)育階段對能量代謝的需求存在差異有關(guān)[18]。這與前人關(guān)于氟吡菌酰胺和吡唑萘菌胺等SDHI 類殺菌劑對番茄葉霉病菌具有較好抑制活性的研究結(jié)果一致[21]。

本研究結(jié)果顯示，在供試菌株中，氟唑菌酰羥胺對淄博地區(qū)番茄葉霉病菌的平均EC50值顯著高于對其他地區(qū)的，而這些采集地均未曾使用過該藥劑，因此推測這可能與不同地理來源菌株的遺傳背景差異有關(guān)[18，23]。在相同的用藥條件下，淄博地區(qū)的菌株是否對該藥劑或同類藥劑更容易產(chǎn)生抗性有待進(jìn)一步研究，實際生產(chǎn)過程中應(yīng)重視對菌株的抗性監(jiān)測。

由于作用位點單一，病原菌容易發(fā)生抗性突變，SDHI 類藥劑已被國際殺菌劑抗性行動委員會(FRAC) 列為中等抗性風(fēng)險藥劑[24]。而氟唑菌酰羥胺殺菌譜廣，未來應(yīng)用廣泛，因此建立其敏感基線對監(jiān)測病原菌的敏感性變化和抗藥性治理具有重要價值。目前已有啶酰菌胺、氟唑菌酰胺、氟吡菌酰胺等SDHI 類藥劑登記并應(yīng)用在番茄上防治番茄灰霉病、早疫病、葉霉病以及番茄根結(jié)線蟲等[17]，這在一定程度上增加了SDHI 類藥劑對田間番茄葉霉病菌的選擇壓，使得田間容易出現(xiàn)抗性菌株。因此在建立殺菌劑的敏感基線時，菌株來源、藥劑使用背景、菌株數(shù)和測定敏感性的試驗方法等非常關(guān)鍵[25]。本研究中使用的103 株番茄葉霉病菌來自山東省的8 個地區(qū)，分布相對均勻且采集地未曾使用過SDHI 類藥劑，具有一定的代表性，其平均EC50值 (0.67 ± 0.41) μg/mL 可以作為山東地區(qū)番茄葉霉病菌對氟唑菌酰羥胺的敏感基線，用于未來田間的抗性監(jiān)測。

He 等建立了山東省番茄灰霉病菌對氟唑菌酰羥胺的敏感性基線，認(rèn)為氟唑菌酰羥胺防治灰霉病具有潛在的抗性風(fēng)險[21]。Hou 等建立了禾谷鐮刀菌對氟唑菌酰羥胺的敏感性基線，并指出氟唑菌酰羥胺與苯并咪唑類殺菌劑之間無交互抗性[13]。由于SDHI 類藥劑獨特的作用方式，與其他類型藥劑間通常不存在交互抗性，且有研究表明即使同為SDHI 類品種，部分藥劑之間也可能不存在交互抗性，如啶酰菌胺和氟吡菌酰胺[26-27]。王曉坤等報道，多種三唑類殺菌劑對葉霉病的毒力很高[28]。因此，將氟唑菌酰羥胺與苯醚甲環(huán)唑復(fù)配[17]防治番茄葉霉病是可行的，同時對番茄灰霉病、灰葉斑病可能具有較好的兼治作用。

多數(shù)研究往往只注重殺菌劑的保護(hù)作用或者治療作用，而殺菌劑的保護(hù)和治療作用在田間應(yīng)用時很難得到嚴(yán)格控制和設(shè)計，因此，在殺菌劑的應(yīng)用中同時研究保護(hù)和治療作用非常重要[29]。兩年的田間防治試驗結(jié)果表明，氟唑菌酰羥胺的施用劑量越大，防效越高，且在發(fā)病前施藥的保護(hù)作用效果遠(yuǎn)高于發(fā)病后再施藥的治療效果，且發(fā)病越重，防效也會降低，這可能與氟唑菌酰羥胺對葉霉病菌的孢子萌發(fā)和芽管伸長具有較強(qiáng)的抑制活性，能夠有效阻止病原菌入侵和擴(kuò)散有關(guān)，因此，建議在發(fā)病前或發(fā)病初期施藥。與對照藥劑氟吡菌酰胺相比，同等劑量下，氟唑菌酰羥胺的防效稍高但并不顯著；而甲基硫菌靈防效很低，因此不建議以單劑形式使用。