周帥輝, 王偉杰, 余 正, 任 和, 李帥鵬, 楊艷坤, 白仲虎

(1.江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室,無錫 214122；2.江蘇拜明生物技術(shù)有限公司,鹽城 224005)

PIC在機(jī)體纖溶系統(tǒng)激活時(shí)由α2-纖溶酶抑制劑(α2-plasmin inhibition，α2-PI)與纖溶酶(plasmin，P)所形成，PIC也稱為纖溶酶-α2-抗纖溶酶復(fù)合物(plasmin-α2-antiplasmin complex，PAP)，分子質(zhì)量約140 ku，該復(fù)合物的產(chǎn)生標(biāo)志著人體內(nèi)纖溶酶的形成與纖溶系統(tǒng)的變化情況，是血栓的重要標(biāo)志物[1-3]。在人體內(nèi)的生理狀況下AT會(huì)中和由Pro-T激活生成的T，從而形成摩爾比為1∶1的TAT，分子質(zhì)量為100 ku左右，TAT標(biāo)志著機(jī)體凝血系統(tǒng)激活和凝血酶的形成[4-5]。TAT與PIC的檢測逐漸受到關(guān)注，但試劑盒全部依賴日本希森美康(Sysmex)，價(jià)格昂貴，開發(fā)國產(chǎn)化高質(zhì)量、低成本的檢測方法迫在眉睫。

目前國內(nèi)外制備PIC的方法主要有兩種：第一種方法是在新鮮血漿中直接添加尿激酶激活生成PIC，采用親和層析分步洗脫純化PIC[6]；第二種方法首先純化α2-纖溶酶抑制劑，然后純化纖溶酶原其經(jīng)尿激酶的作用形成纖溶酶，最后兩者反應(yīng)形成PIC，經(jīng)親和層析獲得PIC。還未發(fā)現(xiàn)有采用一步洗脫法制備高純度的PIC。目前高純度的TAT還未商品化，國內(nèi)外研究使用過量AT與T在體外反應(yīng)，形成TAT混合物[4, 7]，但混合物的純度不高，對后續(xù)作為免疫原制備單克隆抗體與建立TAT的檢測方法有很大影響；獲得T主要的方法是通過激活Pro-T的方式，常用的激活劑有Ca2+、蛇毒；以往研究主要用Oxyuranus scutellatus蛇毒[7]、Tiger snake蛇毒[8]等來激活Pro-T，還未見報(bào)道使用Ecarin蛇毒激活。

PIC中纖溶酶A鏈由5個(gè)Kringle環(huán)構(gòu)成，在這些環(huán)狀結(jié)構(gòu)中含有Lysine結(jié)合部位[9]，本文據(jù)此采用Lysine-sepharose親和層柱吸附PIC，再利用EACA競爭洗脫獲得高純度PIC。利用依賴維生素K的凝血因子(Pro-T)被Ba2+吸附，將血漿中的AT與Pro-T分離，以Ecarin蛇毒激活Pro-T，由于AT與T結(jié)構(gòu)中有反應(yīng)中心環(huán)，存在肝素結(jié)合位點(diǎn)[10]，據(jù)此采用Heparin-sepharose親和柱獲得AT和T。二者反應(yīng)生成TAT混合物，AT通過與T的活性中心Ser結(jié)合，裂解AT的Arg393-Ser394，從而使兩者均發(fā)生一定的改變，導(dǎo)致TAT無法與肝素結(jié)合[4]，據(jù)此制備高純度TAT。為獲得相應(yīng)的單克隆抗體和建立檢測方法提供基礎(chǔ)抗原，同時(shí)也可作為分離富含肝素結(jié)合的其他凝血因子及含有Lysine結(jié)合部位蛋白的參考方法。

1 材料與方法

1.1 材料

高脂血漿由醫(yī)院饋贈(zèng)；尿激酶、抑肽酶、EACA購自上海阿拉丁；苯甲瞇、Ecarin蛇毒購自Sigma公司；分光光度計(jì)購自美國Quawell，AKTA蛋白純化儀器購自GE公司。

1.2 方法

1.2.1 PIC與TAT制備工藝流程(圖1)

圖1 TAT與PIC制備工藝流程圖

1.2.2 血漿預(yù)處理

取凍存的高脂血漿快速解凍，4 ℃ 8 500 r/min離心30 min，過濾。

1.2.3 PIC親和層析法制備[1,11]

(1)添加尿激酶。取上述處理的血漿，按0.1～3 mg尿激酶/100 mL血漿添加，37 ℃激活30 min，以1 mg抑肽酶/100 mL血漿的添加量加入以終止激活。取200 μL使用Sysmex試劑盒進(jìn)行PIC含量的檢測，由此確定最佳的尿激酶用量。

(2)激活與層析。取血漿200 mL，按上述最佳尿激酶用量添加，相同的激活和終止條件。通過0.22 μm濾膜，上Lysine-sepharose層析柱，以0.05 mol/L PB pH 7.5流速為1 mL/min，沖洗20 mL，以0.05 mol/L PB、0.5 mol/L NaCl pH 7.5洗去雜質(zhì)，再以0.05 mol/L PB、0.01 mol/L EACA pH 7.5洗脫，收集洗脫與洗雜液。

1.2.4 TAT的制備

(1)T的制備。取按文獻(xiàn)[12]已處理的血漿200 mL，緩慢滴加16 mL 1 mol/L BaCl2，攪拌20 min；靜置30 min，8 500 r/min離心25 min，取沉淀。在沉淀中加pH 7.5 20 mmol/L Tris-HCl、0.15 mol/L NaCl、10 mmol/L BaCl2、5 mmol/L 苯甲脒、1 mmol/L EGTA溶液40 mL，8 500 r/min離心25 min，收集沉淀；pH 7.5 0.02 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L苯甲脒和0.15 mol/L NaCl透析過夜，5 300 r/min離心15 min，上清液滴加飽和(NH4)2SO4達(dá)35%，攪拌20 min，靜置30 min，離心25 min，上清液加飽和(NH4)2SO4達(dá)65%，攪拌20 min，7 400 r/min 離心30 min。收集沉淀，溶解于6 mL pH 7.5 0.02 mol/L Tris-HCl、0.025 mol/L檸檬酸鈉、1 mmol/L苯甲脒和0.1 mol/L NaCl；透析過夜，然后7 400 r/min離心30 min，收集上清液，加1 U/mL Ecarin蛇毒0.5 mL于37 ℃激活20 min，加10 mmol/L EDTA終止激活；上Heparin-sepharose層析柱，以0.02 mol/L Tris-HCl、0.1 mol/L NaCl pH 7.5沖洗20 mL，0.4 mol/L NaCl洗雜，以0.6 mol/L NaCl洗脫，收集各組分。

(2)抗凝血酶制備[4,13-15]。取上述經(jīng)BaCl2沉淀血漿的上清液，緩慢滴加飽和(NH4)2SO4達(dá)到35%，攪拌30 min，靜置20 min，4 ℃ 7 400 r/min離心30 min，上清液加pH 7.5 0.02 mol/L Tris-HCl、1 mmol/L苯甲脒、0.15 mol/L NaCl透析過夜，上Heparin-sepharose層析柱，采用pH 7.5 0.02 mol/L Tris-HCl、0.4 mol/L NaCl和2 mol/L NaCl洗雜與洗脫。

(3)TAT的親和層析制備。將T與AT按質(zhì)量比為0.3∶1～0.9∶1于37 ℃中反應(yīng)5 min；沸水浴3 min，以確定最佳制備條件。以pH 7.5 0.02 mol/L Tris-HCl、0.1 mol/L NaCl上Heparin-sepharose層析柱，以0.5 mol/L NaCl洗脫。

1.2.5 制備產(chǎn)物SDS-PAGE鑒定

將上述T、AT與TAT和PIC的各組分進(jìn)行SDS-PAGE鑒定：分離膠12%、濃縮膠4%(還原)；PIC電泳分離膠7.5%、濃縮膠4%(非還原)；采用Image Lab鑒定產(chǎn)物的純度。

1.2.6 純化產(chǎn)物的定量

2 結(jié)果與分析

2.1 PIC的激活

由圖2可知：隨著尿激酶用量的增加，PIC濃度先增加；當(dāng)添加量為200 μg/mL，PIC濃度達(dá)到最大，此時(shí)PIC激活較徹底，當(dāng)再提高尿激酶用量時(shí)，PIC的生成不再增加；纖溶酶原的激活程度決定了PIC的生成量及純度。綜合考慮PIC的激活條件為尿激酶添加量為200 μg/mL血漿時(shí)，37 ℃激活30 min。

1:50 μg/mL(血漿)；2：100 μg/mL(血漿)；3：200 μg/mL(血漿)；4：μg/mL(血漿)。

2.2 PIC親和層析及SDS-PAGE

激活的血漿經(jīng)Lysine-sepharose層析洗脫，對應(yīng)洗脫組分采用SDS-PAGE檢測，結(jié)果如圖3(a)和(b)所示：A組分洗脫是結(jié)合松散的雜蛋白，而B組分洗脫則是分子質(zhì)量為140 ku左右的蛋白，純度較高，經(jīng)活性鑒定此蛋白是PIC，且純度在90%以上，經(jīng)分析雜蛋白可能是P-α2-M。100 mL血漿可以制備(2.53±0.09)mg PIC，T含量為(2.17±0.11)mg，AT含量為(6.24±0.27)mg。PIC在稀釋1 000倍時(shí)仍具有很高的生物活性，說明PIC的純度較高，可作為免疫原。結(jié)果說明，一步EACA洗脫制備PIC切實(shí)可行。

(a)PIC層析,pH 7.5 0.05 mol/L PB(A：0.5 mol/L NaCl洗雜；B：0.01 mol/L EACA洗脫)。(b)各組分SDS-PAGE(1:A組分洗脫；2:B組分洗脫)。

2.3 T與AT親和層析及SDS-PAGE

從圖4(a)和圖5可知AT的洗脫條件為B液，此組分條帶單一，分子質(zhì)量約為60 ku，且純度非常高，幾乎無雜帶。從圖4(b)和圖5可知T的洗脫條件為C液，得到分子質(zhì)量約為36 ku的產(chǎn)物；而B液洗脫下的是結(jié)合松散的雜蛋白，經(jīng)分析可能是其他凝血因子，因?yàn)檫@些凝血因子都會(huì)被親和柱吸附；100 mL血漿得到2.17 mg T和6.24 mg AT，可進(jìn)一步制備TAT。結(jié)果說明，純化T與AT的方法可行，產(chǎn)物純度高。

(a)AT親和層析洗脫,pH 7.5 0.02 mol/L Tris-HCl(A: 0.4 mol/L NaCl，B：2 mol/L NaCl)。(b)T親和層析洗脫(A: 0.1 mol/L NaCl，B: 0.4 mol/L NaCl，C: 0.6 mol/L NaCl)。

M：Marker；1：抗凝血酶(B組分)；2：凝血酶(C液洗脫)。

2.4 TAT的制備

如圖6(a)和(b)所示，分別檢測在不同比例下的TAT生成情況，隨著T的添加量提高，TAT的生成先升高后下降，可能是游離的T作為絲氨酸蛋白酶水解生成的TAT，但適量的T被AT快速結(jié)合生成TAT，因此設(shè)置T與AT最佳比例為0.7∶1，此時(shí)生成的TAT含量最高。反應(yīng)生成TAT時(shí)還產(chǎn)生分子質(zhì)量約80 ku的雜蛋白，相較于前體分子T與AT分子中都未發(fā)現(xiàn)?？赡苁窃诜磻?yīng)過程中T水解生成的TAT形成的，因此控制前體分子反應(yīng)比例對制備高純度的TAT至關(guān)重要。

(a)不同T與AT比例的SDS-PAGE(M：Marker；1：0.6∶1；2：0.7∶1；3：0.8∶1；4：0.9∶1；5：1∶1)。(b)不同T與AT比例生成的TAT濃度(1～5分別對應(yīng)左圖的1～5號(hào)樣本)。

將上述0.7∶1混合液過Heparin-sepharose層析柱，經(jīng)SDS-PAGE鑒定，結(jié)果如圖7所示：經(jīng)過親和層析柱，收集流穿，得到分子質(zhì)量約100 ku的TAT，純度為80%。但圖7中還有少量其他雜帶，約80 ku，由于混合物中不僅存在未反應(yīng)的T與AT，還有T水解TAT形成的80 ku的雜蛋白，此蛋白不被層析柱吸附，因此與TAT存在流穿中。由表1可知，TAT在稀釋10 000倍后仍具有生物活性，因此說明TAT純度較高，符合免疫原的要求。這說明此方法能除去未反應(yīng)的凝血酶與抗凝血酶，并可以進(jìn)一步提高TAT的純度。

表1 PIC與TAT的含量

M：Marker；1：洗脫液；2：流穿液。

3 討論與結(jié)論

高純度PIC與TAT的制備為獲得相應(yīng)單克隆抗體和建立復(fù)合物的檢測方法提供了抗原。但目前國內(nèi)外未見報(bào)道制備高純度的TAT工藝，大多研究其前體分子T與AT的純化工藝。本研究首次以Ecarin蛇毒成功激活Pro-T，較其他蛇毒激活Pro-T得到的T在分子質(zhì)量上差異不大(都約為36 ku)，但生成其他產(chǎn)物略有不同，這是因?yàn)镋carin蛇毒激活機(jī)理[17]不同于Oxyuranus scutellatus、tiger snake等蛇毒，且不需要輔助因子(如Ca2+)，因此激活操作更簡便。不同比例的T與AT反應(yīng)生成不同的TAT，本文探究兩者反應(yīng)最佳比例為0.7∶1，這與目前研究報(bào)道結(jié)果[4]一致。利用TAT不與Heparin-sepharose層析柱結(jié)合，而T和AT與該層析柱結(jié)合緊密，成功除去反應(yīng)混合物中未反應(yīng)的T與AT，進(jìn)一步提高了TAT的純度(純度在80%以上)。

目前關(guān)于PIC的制備研究較多，主要集中在先采用尿激酶激活血漿，再利用EACA分布洗脫獲得PIC。尚未見報(bào)道采用EACA一步洗脫法獲得PIC。研究首先探究不同尿激酶添加量對PIC生成的影響，確定最佳尿激酶添加量為200 μg/mL血漿，較文獻(xiàn)用量大，PIC激活更徹底。采用一步EACA洗脫成功獲得PIC，與文獻(xiàn)采用分步EACA洗脫結(jié)果一致，獲得分子質(zhì)量約140 ku的產(chǎn)物，且操作更加簡便。獲得高純度的PIC(純度在90%以上)，可能是采用最佳尿激酶用量使纖溶酶原激活更徹底。