彭鴻碧，賈 婷，王政昆，朱萬(wàn)龍

(1.云南省高校西南山地生態(tài)系統(tǒng)動(dòng)植物生態(tài)適應(yīng)進(jìn)化及保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，昆明 650500; 2.云南經(jīng)濟(jì)管理學(xué)院，昆明 650106)

環(huán)境光及其物理特性是影響動(dòng)物大腦功能和認(rèn)知的主要因子[1]。光照強(qiáng)度可以調(diào)節(jié)動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)記憶能力[2]，也可以對(duì)動(dòng)物的行為和生理產(chǎn)生廣泛的影響[3]。光可以通過(guò)調(diào)節(jié)睡眠和晝夜節(jié)律來(lái)調(diào)節(jié)行為和學(xué)習(xí)記憶能力(間接途徑)，也可以直接影響行為和認(rèn)知功能，而不會(huì)擾亂睡眠或造成晝夜節(jié)律失常(直接途徑)，從而影響動(dòng)物的體重和攝食量[4]。視網(wǎng)膜是哺乳動(dòng)物唯一的感光器官，光直接投射到參與行為反應(yīng)的大腦區(qū)域，其中包括杏仁核、紋狀床核和導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)[5]。已知其中一些區(qū)域的活動(dòng)是光以波長(zhǎng)依賴的方式劇烈調(diào)節(jié)的[6]。異常的光照會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物體學(xué)習(xí)記憶能力下降[7]。

氧化劑和抗氧化劑之間的平衡向氧化劑轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)變被稱為氧化應(yīng)激[8]。研究氧化應(yīng)激最常用的生物標(biāo)記物是丙二醛(Malondialdehyde，MDA)濃度、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)濃度和活性的測(cè)定。MDA是主要的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，可與蛋白質(zhì)、磷脂和核酸的游離氨基反應(yīng)并引起其結(jié)構(gòu)修飾，MDA具有細(xì)胞毒性，其濃度水平升高會(huì)加劇膜的損傷，從而降低動(dòng)物體學(xué)習(xí)記憶水平[8]。SOD是生物體內(nèi)已知的最有效的抗氧化劑之一，是細(xì)胞抵御氧化應(yīng)激的重要組成部分，SOD能清除具有毒性而損壞細(xì)胞的超氧陰離子自由基，提高動(dòng)物體學(xué)習(xí)記憶能力[9]。乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase，AChE)是生物神經(jīng)傳導(dǎo)的關(guān)鍵酶，通過(guò)升高動(dòng)物體內(nèi)AChE活性，從而降低ACh水平，可以改善動(dòng)物體的學(xué)習(xí)記憶能力。一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase，NOS)主要參與腦的發(fā)育、學(xué)習(xí)和記憶過(guò)程。有研究表明，激活大鼠海馬區(qū)NOS活性，從而提高動(dòng)物體學(xué)習(xí)記憶水平[10]。

中緬樹(shù)鼩(Tupaiabelangeri)屬攀鼩目(Scandentia)樹(shù)鼩科(Tupaiidae)，分布于南亞、東南亞以及中國(guó)南部和西南部地區(qū)[11]。因其在生物學(xué)特征及生理生化等方面與人類較為相近，已被用作非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的替代模型廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究[12]。光照包括光周期、光照強(qiáng)度、波長(zhǎng)和光源等4個(gè)特性，迄今為止，大多數(shù)研究都集中在光周期的影響[13]。在動(dòng)物研究中，也有越來(lái)越多的證據(jù)表明強(qiáng)光照可以影響動(dòng)物的認(rèn)知[14]，然而很少有研究探討光照強(qiáng)度變化對(duì)動(dòng)物行為、學(xué)習(xí)記憶和氧化應(yīng)激的影響。本實(shí)驗(yàn)旨在探討不同光照強(qiáng)度是如何影響中緬樹(shù)鼩學(xué)習(xí)記憶能力以及行為，從而為進(jìn)一步研究不同強(qiáng)度光照影響中緬樹(shù)鼩學(xué)習(xí)和記憶的基本機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集及分組

中緬樹(shù)鼩均采自昆明市祿勸縣，共計(jì)24只成年非繁殖個(gè)體(143±2.2)g，捕捉后于云南師范大學(xué)動(dòng)物飼養(yǎng)房室內(nèi)單籠飼喂，在室溫為25 ℃±1 ℃、光(628)8 h/暗16 h循環(huán)、動(dòng)物自由取食條件下馴化1個(gè)月后，將試驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為3組：628、1 256和2 512 lx光照組，每組8只。分別將628、1 256和2 512 lx的白熾燈(散發(fā)白光)懸掛于距競(jìng)技場(chǎng)觀察箱上方120 cm處，每天9:00—17:00給予光照刺激，持續(xù)28 d。每天測(cè)定中緬樹(shù)鼩的體重和攝食量。

1.2 方法

1.2.1 行為的測(cè)定

參考侯東敏等[15]對(duì)中緬樹(shù)鼩行為的研究，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定以下4種主要行為：活動(dòng)行為(主要以跑步、爬行、跳躍、攀援、空翻和轉(zhuǎn)圈等活動(dòng)為主)；休息行為(靜臥或靜坐，睡姿主要以蜷縮睡眠、伸頭睡眠和低頭睡眠為主)；修飾行為(通過(guò)牙、口清洗足、臉、四肢和梳理被毛等)；取食行為(攝食、飲水、咀嚼、吞咽和舔吮等，取食姿勢(shì)主要以坐式、捧式、蹲式、立式和臥式為主)。將每組試驗(yàn)動(dòng)物分別置于競(jìng)技場(chǎng)觀察箱(圖1)，競(jìng)技場(chǎng)觀察箱為3個(gè)相鄰的獨(dú)立飼養(yǎng)箱(規(guī)格為400 mm×400 mm×450 mm，材質(zhì)為透明亞克力板和不透明亞克力板)構(gòu)成，并裝有實(shí)時(shí)監(jiān)控?cái)z像頭，競(jìng)技場(chǎng)觀察箱上方120 cm處裝有不同瓦數(shù)的白熾燈用以行為觀察時(shí)的照明[15]。

圖1 競(jìng)技場(chǎng)觀察箱示意圖

對(duì)每只中緬樹(shù)鼩的行為監(jiān)測(cè)28 d，并對(duì)1、4、7、10、13、16、19、22、25和28 d所監(jiān)測(cè)的行為狀態(tài)進(jìn)行觀察記錄，選取1 min為一個(gè)有效單位，將1 min內(nèi)所觀測(cè)到的持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)的行為定義為有效行為，并統(tǒng)計(jì)各行為發(fā)生的頻次。目標(biāo)行為發(fā)生頻次=(目標(biāo)行為在監(jiān)測(cè)時(shí)間段內(nèi)所觀測(cè)到的總數(shù)/監(jiān)測(cè)時(shí)間段內(nèi)所觀測(cè)行為的總數(shù))×100%。每天監(jiān)測(cè)結(jié)束后，用75%酒精和清水清洗競(jìng)技場(chǎng)觀察箱內(nèi)壁，風(fēng)干用于下次監(jiān)測(cè)。

1.2.2 記憶能力的測(cè)定

Y-迷宮是由起始臂、安全區(qū)臂和危險(xiǎn)區(qū)臂組成的，一種應(yīng)用于研究動(dòng)物空間記憶的迷宮模型，一般用于動(dòng)物的學(xué)習(xí)和記憶能力的測(cè)定。開(kāi)始測(cè)試時(shí)，中緬樹(shù)鼩受到刺激可能會(huì)進(jìn)入危險(xiǎn)區(qū)，并在光照刺激作用下最終才跑至安全區(qū)(被動(dòng)回避反應(yīng))，因此會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤反應(yīng)，而在多次訓(xùn)練后，中緬樹(shù)鼩會(huì)立即進(jìn)入安全區(qū)，即形成明暗辨別條件反射[16]。本試驗(yàn)Y-型迷宮由底面及兩側(cè)面的鍍錫鐵皮(厚1.6 cm)制作，頂面端由透明亞克力板構(gòu)成(圖2)。Y-迷宮由適應(yīng)箱(40 cm×30 cm×30 cm)、公共臂(70 cm×30 cm×30 cm)、選擇臂(60 cm×30 cm×30 cm)、刺激源箱(40 cm×30 cm×30 cm)和空氣泵(平均風(fēng)速：38 L/min)組成[17]。刺激源箱由安全箱與危險(xiǎn)箱組成，危險(xiǎn)箱內(nèi)裝有不同瓦數(shù)的白熾燈(628、1 256和2 512 lx)，用作危險(xiǎn)區(qū)；安全箱內(nèi)裝有規(guī)格為(18 cm×8 cm×8 cm)的暗盒，用作安全區(qū)。測(cè)試(3 d一測(cè))時(shí)，將不同強(qiáng)度的光照刺激后的中緬樹(shù)鼩置于Y-型迷宮起始臂中適應(yīng)3～5 min，用木棍輕敲起始臂頂面端亞克力板，使中緬樹(shù)鼩到達(dá)安全區(qū)，以連續(xù)10次中有9次或以上正確反應(yīng)(正確反應(yīng)率≥90%)定為學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)[18]。正確反應(yīng)率表示中緬樹(shù)鼩空間反應(yīng)的學(xué)習(xí)記憶能力[19]。每次測(cè)試結(jié)束后，用75%酒精和清水清洗Y-型迷宮內(nèi)壁，風(fēng)干用于下次測(cè)試。

圖2 Y-迷宮示意圖

1.2.3 腦組織不同物質(zhì)含量和活性測(cè)定

不同強(qiáng)度的光照刺激28 d后，處死中緬樹(shù)鼩，迅速剝離腦組織，并用4 ℃預(yù)冷的生理鹽水洗盡殘余血液，用吸水紙吸干水分，其后用PBS緩沖液(pH 7.4)研磨成10%的組織勻漿，將組織勻漿在3 000 r/min、4 ℃下離心10 min，收集上清液，并根據(jù)MDA、SOD、AChE和NOS的ELISA試劑盒的操作說(shuō)明測(cè)定其濃度水平，根據(jù)SOD、AChE和NOS的ELISA試劑盒的操作說(shuō)明測(cè)定其活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)數(shù)據(jù)分布進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)。體重、攝食量采用重復(fù)測(cè)量方差分析(Repeated Measurement ANOVA)；行為、記憶能力和腦組織不同物質(zhì)含量和活性變化采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 體重和攝食量

馴化1～28 d，628 lx光照組中緬樹(shù)鼩的體重變化差異不顯著(F=0.28，P>0.05)，但是1 256和2 512 lx光照強(qiáng)度對(duì)中緬樹(shù)鼩體重影響差異顯著(1 256 lx：F=1.67，P<0.05；2 512 lx：F=1.64，P<0.05)。第28天，3組之間體重差異顯著(F=4.16，P<0.05)，其中2 512 lx條件下中緬樹(shù)鼩體重較低(圖3)。不同光照強(qiáng)度對(duì)中緬樹(shù)鼩的攝食量有影響，高的光照強(qiáng)度會(huì)降低中緬樹(shù)鼩的攝食量。第28天，3組之間攝食量差異顯著(F=5.07，P<0.05)，其中2 512 lx條件下中緬樹(shù)鼩攝食量較低(圖4)。

圖3 不同光照強(qiáng)度對(duì)中緬樹(shù)鼩體重的影響

圖4 不同光照強(qiáng)度對(duì)中緬樹(shù)鼩攝食量的影響

2.2 行為和記憶能力

增加光照強(qiáng)度會(huì)明顯降低中緬樹(shù)鼩的取食行為，增加休息行為，但是對(duì)修飾行為和活動(dòng)行為的影響不顯著。第28天，2 512 lx組中緬樹(shù)鼩的取食行為顯著降低，休息行為顯著增加(取食行為：F=2.35，P<0.05；休息行為：F=3.02，P<0.05，圖5)。馴化1～28 d，相同光照組中緬樹(shù)鼩的識(shí)別正確率差異不顯著，但強(qiáng)光照會(huì)降低中緬樹(shù)鼩的識(shí)別的正確率，第28天時(shí)，3組之間識(shí)別正確率差異極顯著(F=10.05，P<0.01，圖6)。

圖5 不同光照強(qiáng)度對(duì)中緬樹(shù)鼩行為的影響

圖6 不同光照強(qiáng)度對(duì)中緬樹(shù)鼩正確反應(yīng)率的影響

2.3 腦組織不同物質(zhì)含量和活性

光照強(qiáng)度對(duì)MDA濃度影響差異極顯著(F=46.04，P<0.01)，見(jiàn)圖7(a)，其中2 512 lx光照組其濃度最高；628 lx組濃度最低。光照強(qiáng)度對(duì)SOD的濃度影響極顯著(F=22.14，P<0.01)見(jiàn)圖7(b)，其中2 512 lx組SOD濃度最低；628 lx組濃度最高，但是光照強(qiáng)度對(duì)NOS和AChE濃度沒(méi)有影響[P>0.05，圖7(c)和(d)]。光照強(qiáng)度對(duì)SOD活性影響極顯著(F=28.15，P<0.01)，見(jiàn)圖8(a)，對(duì)NOS和AChE活性影響極顯著(NOS：F=42.83，P<0.01；AChE：F=36.16，P<0.01)，見(jiàn)圖8(b)和(c)。

圖7 不同光照強(qiáng)度對(duì)中緬樹(shù)鼩腦組織中MDA、SOD、AChE和NOS濃度的影響

圖8 不同光照強(qiáng)度對(duì)中緬樹(shù)鼩腦組織中SOD、AChE和NOS活性的影響

3 討論與結(jié)論

光照強(qiáng)度可影響小型哺乳動(dòng)物的生長(zhǎng)和發(fā)育[1]。本研究結(jié)果表明，在1 256 lx和2 512 lx的刺激條件下中緬樹(shù)鼩體重明顯低于628光照組，其中在2 512 lx條件下中緬樹(shù)鼩體重最低，這可能與強(qiáng)光照導(dǎo)致中緬樹(shù)鼩攝食量下降有關(guān)，最終影響中緬樹(shù)鼩的生長(zhǎng)發(fā)育。

光照強(qiáng)度可以調(diào)節(jié)大腦對(duì)認(rèn)知任務(wù)的反應(yīng)，然后調(diào)節(jié)皮層區(qū)域的活動(dòng)，最終影響動(dòng)物的行為[20]。本研究中，強(qiáng)光照會(huì)明顯降低中緬樹(shù)鼩的取食行為，增加休息行為。強(qiáng)光照條件下取食行為的降低應(yīng)該是對(duì)強(qiáng)光照強(qiáng)度的適應(yīng)[21]，同時(shí)，中緬樹(shù)鼩會(huì)增加休息行為來(lái)減少不必要的能量消耗[22-23]。強(qiáng)光照條件下動(dòng)物的行為變化與其情緒有關(guān)[24]，長(zhǎng)期強(qiáng)光照刺激會(huì)誘發(fā)動(dòng)物情緒消極，導(dǎo)致取食行為降低，休息行為增加[25]。光照同樣可以影響動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶[26]。第28天時(shí)，與628 lx組相比，1 256 lx組中緬樹(shù)鼩識(shí)別的正確反應(yīng)率較低，而2 512 lx組最低，說(shuō)明強(qiáng)光照條件刺激會(huì)降低中緬樹(shù)鼩識(shí)別的正確率，提示其學(xué)習(xí)記憶能力下降，這說(shuō)明強(qiáng)光照可能會(huì)影響中緬樹(shù)鼩的晝夜節(jié)律和睡眠，并影響其學(xué)習(xí)記憶能力[27-28]。

研究氧化損傷和氧化應(yīng)激最常用的生物標(biāo)記物是MDA濃度、SOD活性和SOD濃度的測(cè)定[10]。本研究中，高強(qiáng)度的光照刺激導(dǎo)致中緬樹(shù)鼩學(xué)習(xí)記憶能力顯著下降，這可能和中緬樹(shù)鼩腦組織中MDA濃度水平升高有關(guān)[8]，表明在高強(qiáng)度的光照條件刺激下中緬樹(shù)鼩脂質(zhì)過(guò)氧化作用增加[29]。過(guò)度氧化應(yīng)激以及過(guò)氧化損傷與腦部機(jī)能障礙、認(rèn)知能力下降、空間學(xué)習(xí)和記憶減弱有關(guān)[9]。強(qiáng)光照組中緬樹(shù)鼩SOD濃度水平顯著下降，SOD活性顯著升高，這可能與中緬樹(shù)鼩腦組織中發(fā)生氧化損傷[30]和氧化應(yīng)激[31]有關(guān)。此外，強(qiáng)光照組中緬樹(shù)鼩腦組織中NOS和AChE活性顯著降低。NOS活性下降則可能導(dǎo)致NO含量下降，從而降低中緬樹(shù)鼩的學(xué)習(xí)記憶水平[32]。AChE活性的顯著下降可能會(huì)導(dǎo)致突觸裂隙中乙酰膽堿的減少，從而導(dǎo)致膽堿能活性的下降，進(jìn)而導(dǎo)致中緬樹(shù)鼩記憶能力下降[33]。

綜上所述，強(qiáng)光照會(huì)降低中緬樹(shù)鼩的體重和取食行為，增加休息行為，誘發(fā)中緬樹(shù)鼩認(rèn)知障礙，還會(huì)導(dǎo)致中緬樹(shù)鼩腦內(nèi)氧化應(yīng)激水平增加和出現(xiàn)不同程度的氧化損傷。