張 揚(yáng)，楊 靖，高建萍，陳 毅，孔英俊，夏磊磊，張貴鋒，李勇超

(1.河南科技學(xué)院 生命科技學(xué)院, 新鄉(xiāng) 453003；2.中國科學(xué)院過程工程研究所生化工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100190；3.北京博輝瑞進(jìn)生物科技有限公司, 北京 100026)

山茱萸為山茱萸科山茱萸屬植物山茱萸(CornusofficinalisSieb.etZucc.)的干燥成熟果肉，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為我國傳統(tǒng)珍貴中藥材，主產(chǎn)于我國河南、山西、陜西和浙江地區(qū)[1-2]。山茱萸主要成分由環(huán)烯醚萜苷、黃酮、鞣質(zhì)、有機(jī)酸、多糖和蛋白質(zhì)等組成。環(huán)烯醚萜類(Cornusiridoid glycosides, CIG)化合物是山茱萸的特征性成分，在山茱萸中含量較高并具有多種生物活性。CIG具有提高免疫力、抗氧化、抗腫瘤、神經(jīng)保護(hù)和心肌保護(hù)等作用。隨著心腦血管疾病的高發(fā)，其抑制血栓形成的作用也越來越受到重視[3-8]。

CIG作為山茱萸主要藥效成分，其提取、分離純化和活性驗(yàn)證等研究愈來愈多。CIG易溶于甲醇和水，可溶于乙醇，因此甲醇回流提取法、超聲提取法等被廣泛應(yīng)用于提取CIG[9-10]。D101大孔樹脂、SP825型大孔樹脂等可用于富集山茱萸提取液中的CIG[10-11]。HPLC指紋圖譜的建立是鑒定CIG最常用的方法，此外還有HPLC-MS、核磁共振等方法。有研究[12-15]通過大鼠灌胃、體外血栓形成、細(xì)胞培養(yǎng)等多種方法探究某種或多種環(huán)烯醚萜苷類成分對血栓形成的抑制作用。張麗等[16]發(fā)現(xiàn)CIG總提取液可顯著抑制大鼠體內(nèi)血栓形成，減小體外血栓的直徑，并影響凝血酶原時間和凝血酶時間。Yao等[12]將不同劑量CIG灌胃給大鼠，通過使用免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)CIG可促進(jìn)大鼠缺血后神經(jīng)發(fā)生和血管生成。沈紅勝等[17]發(fā)現(xiàn)山茱萸環(huán)烯醚萜苷類特征成分馬錢苷、莫諾苷對晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)導(dǎo)致的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷具有明顯的保護(hù)作用。CIG對血管的作用在細(xì)胞水平上的研究較少。本研究通過超聲提取法對山茱萸果實(shí)進(jìn)行提取，利用D101大孔樹脂富集CIG，并通過HPLC、HPLC-MS對CIG提取物進(jìn)行鑒定，同時探究CIG對小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、凋亡及形態(tài)的影響。該研究為山茱萸用于血栓相關(guān)疾病的防治工作提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

山茱萸果實(shí)由河南仲景宛西制藥股份有限公司提供；血管內(nèi)皮細(xì)胞b.end.3購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清和青鏈霉素雙抗均購自以色列BI公司；CCK-8檢測試劑盒購自上海東仁科技有限公司；DAPI溶液購自北京Solarbio科技有限公司；Actin-Tracker Green購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；AnnexinⅤ-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自北京富百科生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(HPLC-MS)由美國Agilent公司1100液相色譜和美國Thermo Fisher公司LCQ DecaXP電噴霧質(zhì)譜組成，數(shù)據(jù)采集與處理軟件為Xcalibur 3.1；超分辨共聚焦顯微鏡(Leica SP8 STED 3X)，德國Leica公司；流式細(xì)胞儀(CytoFLEX LX)，美國Beckman Coulter公司；LGJ-100F真空冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技發(fā)展有限公司。

1.3 試劑配制

PBS溶液：分別稱取8 g NaCl、0.2 g KCl、0.2 g KH2PO4和2.9 g Na2HPO4·12 H2O(或1.44 g Na2HPO4)，用去離子水定容至1 L，磁力攪拌混勻，溶液pH值調(diào)至7.4后過0.45 μm水系濾膜去除雜質(zhì)，將過濾后的PBS溶液進(jìn)行高壓蒸汽滅菌。

完全培養(yǎng)基(DMEM)：吸取50 mL胎牛血清加到450 mL DMEM培養(yǎng)液中，并加入5 mL青鏈霉素雙抗，用移液槍吹打均勻，分裝使用。

1.4 方法

1.4.1 山茱萸CIG提取物制備

將山茱萸果實(shí)進(jìn)行真空干燥，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后置于干燥器中保存；稱取20 g山茱萸粉碎物，加入10倍體積80%甲醇，超聲提取90 min，過濾后棄去濾渣，濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后加水定容至20 mL。將該提取液通過D101大孔樹脂，超純水淋洗后用體積分?jǐn)?shù)為50%乙醇洗脫，收集洗脫液，干燥。

1.4.2 山茱萸CIG提取物鑒定

稱取5～10 mg CIG凍干粉和4種環(huán)烯醚萜苷標(biāo)準(zhǔn)品，用體積分?jǐn)?shù)為50%甲醇復(fù)溶后離心取上清液，HPLC-MS負(fù)離子模式檢測。

質(zhì)譜條件：色譜柱為Zorbax SB C18[150×2.1 mm(I.D.)，5 μm]；流動相A(超純水)，流動相B(純乙腈)；梯度0～25 min，5%～30% B；25～35 min，30%～50% B；進(jìn)樣量10 μL；流速0.2 mL/min。離子源噴霧電壓3.0 kV，毛細(xì)管溫度300 ℃，掃描范圍150～1 500 m/z，精確質(zhì)量數(shù)掃描和二級質(zhì)譜掃描均為數(shù)據(jù)依賴型掃描，碰撞能量為35%。

1.4.3 血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖系數(shù)檢測

將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞解離，配成1×104～2×104mL-1細(xì)胞懸液；96孔板中每個孔接種約103個細(xì)胞，每組設(shè)置5個平行；將細(xì)胞在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后，將原培養(yǎng)液分別換成100 μL普通培養(yǎng)液和添加不同劑量CIG的培養(yǎng)液(0.5～50 μg/mL)，培養(yǎng)24 h后每孔加入10 μL CCK-8試劑，培養(yǎng)1～2 h，通過酶標(biāo)儀在450 nm波長處檢測各孔的吸光度。通過OD值比較各組之間細(xì)胞增殖的差異并作顯著性差異分析。

1.4.4 高糖條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖系數(shù)檢測

細(xì)胞接種及檢測方法同1.4.3節(jié)，將原培養(yǎng)液分別換成100 μL普通培養(yǎng)液、100 mmol/L高糖培養(yǎng)液及添加不同劑量CIG的高糖培養(yǎng)液(0.5、5和50 μg/mL)。通過OD值比較各組之間細(xì)胞增殖的差異并作顯著性差異分析。

1.4.5 血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)觀察

將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞解離，配成1×104～2×104mL-1細(xì)胞懸液；每個共聚焦小皿中接種約103個細(xì)胞，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后，將培養(yǎng)液置換成不同的新鮮培養(yǎng)液；分別設(shè)置對照組、高糖組、DMSO組和低、中、高質(zhì)量濃度CIG加藥組(0.5、5和50 μg/mL)。

培養(yǎng)箱孵育24 h后倒掉培養(yǎng)液，PBS清洗3次，通過質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛固定液固定10 min；用體積分?jǐn)?shù)為0.1% Triton X-100的PBS洗滌2～3次，每次5 min；用含1% BSA和0.1% Triton X-100的PBS按照1∶50的比例稀釋Actin-Tracker Green染色液(激發(fā)波長496 nm，發(fā)射波長516 nm)，每個樣品滴加200 μL，室溫孵育20～60 min；用含0.1%Triton X-100的PBS洗滌2～3次；加入少量DAPI染色液(激發(fā)波長340 nm，發(fā)射波長488 nm)孵育2～3 min；PBS清洗2～3次，在激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍攝。

1.4.6 血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡檢測

將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞解離，配成1×105～2×105mL-1細(xì)胞懸液；6孔板中每孔接種約105個細(xì)胞，振蕩均勻后靜置10 min，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)12 h。將培養(yǎng)液置換成不同組的新鮮培養(yǎng)液；分別設(shè)置對照組、高糖組、DMSO組和低、中、高質(zhì)量濃度CIG加藥組；繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，使用不含EDTA的Trypsin將細(xì)胞解離；2 000 r/min離心棄上清液，加2 mL預(yù)冷PBS繼續(xù)離心棄上清液，該步驟重復(fù)2次；用去離子水稀釋Binding Buffer，取250 μL重新懸浮細(xì)胞；取100 μL細(xì)胞懸液，加入5 μL AnnexinⅤ-FITC輕輕混勻，室溫避光孵育10 min；上機(jī)前5 min加入10 μL碘化丙啶溶液和400 μL PBS，輕輕混勻后避光保存；隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀(FACS)檢測。

1.4.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與討論

2.1 山茱萸提取與分析

將山茱萸果實(shí)提取液濃縮后得到深紅色提取液，靜置后有米黃色沉淀，凍干后極易吸潮黏稠。該沉淀易溶于乙醇，可溶于甲醇但難溶于水，推測沉淀含較多非環(huán)烯醚萜苷類成分。將提取液通過D101大孔樹脂純化，用超純水淋洗后以50%乙醇洗脫，洗脫液濃縮后紅色變淺，靜置后發(fā)現(xiàn)少量沉淀，凍干后樣品呈粉末狀。在提取過程中，高濃度甲醇可除去大部分的蛋白質(zhì)和糖，大孔樹脂除去的部分可能是色素、酯類和部分殘留的糖，洗脫部分通過HPLC-MS檢測。

圖1為CIG總提取物的總離子流圖，根據(jù)文獻(xiàn)報道的山茱萸環(huán)烯醚萜苷類化合物質(zhì)荷比進(jìn)行提取，對提取離子流圖和一級質(zhì)譜圖分析和比對，結(jié)果表明，提取物中主要有4種環(huán)烯醚萜苷類成分。圖2中A是莫諾苷在負(fù)離子模式下存在或者以結(jié)合甲酸或Cl-形式存在的質(zhì)譜圖，提取離子為m/z 405.15、441.05和451.15，但發(fā)現(xiàn)有莫諾苷以二聚體結(jié)合甲酸的形式存在，這可能是出現(xiàn)兩個峰的原因；圖2中B是獐牙菜苷在負(fù)離子模式下以結(jié)合甲酸形式存在的質(zhì)譜圖，提取離子為m/z 403.15，但也發(fā)現(xiàn)其以二聚體形式存在的m/z 760.83；圖2中C是馬錢苷在負(fù)離子模式下存在或以結(jié)合甲酸形式存在的質(zhì)譜圖，提取離子為m/z 389.38和435.15，發(fā)現(xiàn)其以二聚體形式存在的m/z 824.38；圖2中D是山茱萸新苷在負(fù)離子模式下存在或以結(jié)合甲酸形式存在的質(zhì)譜圖，提取離子為m/z 541.15和586.15，但也發(fā)現(xiàn)其二聚體形式存在的m/z 1 083.12。此外，還發(fā)現(xiàn)馬錢苷以馬錢苷酸二聚體形式存在，莫諾苷以脫氫莫諾苷糖苷元二聚體形式存在以及7-O甲基莫諾苷存在。

圖1 山茱萸CIG提取液總離子流圖

A為莫諾苷；B為獐牙菜苷；C為馬錢苷；D為山茱萸新苷。

本試驗(yàn)初步斷定該提取物中有大量環(huán)烯醚萜苷類成分存在，但不排除有少量黃酮類及其他成分存在。環(huán)烯醚萜苷類中莫諾苷、馬錢苷和山茱萸新苷豐度較高，獐牙菜苷豐度相對較低。通過標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對4種環(huán)烯醚萜苷類成分進(jìn)行進(jìn)一步鑒別和定量，將標(biāo)準(zhǔn)樣品與CIG提取物的液相色譜和質(zhì)譜數(shù)據(jù)比對，樣品中各化合物的保留時間與標(biāo)準(zhǔn)品相同，其二級離子與標(biāo)準(zhǔn)品的二級質(zhì)譜圖匹配度較高，因此可確定CIG提取物檢測到的化合物為上述4種環(huán)烯醚萜苷類成分。通過對不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品檢測來確定其濃度與峰面積的線性回歸曲線，4種化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好。通過線性關(guān)系得到CIG提取物的含量，其中：莫諾苷28.5%，馬錢苷20.4%，山茱萸新苷4.5%，獐牙菜苷約2%，總含量超過55%。CIG提取物中其他成分可能為色素或者少量糖類，因此其凍干物呈紅色。

2.2 山茱萸果實(shí)提取物對血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用

2.2.1 CIG提取物對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響

通過CCK-8細(xì)胞增殖試驗(yàn)探究不同濃度CIG對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性的影響。將試驗(yàn)組1～6分別與對照組作顯著性差異分析，相較于對照組，加入CIG后細(xì)胞增殖更快。但試驗(yàn)組6細(xì)胞與對照組并無明顯差異，可能是CIG濃度超出了其最適范圍，對細(xì)胞的積極作用反而降低。結(jié)果表明適當(dāng)濃度的CIG可在一定程度上促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。

Control group為正常DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；Group 1～6為DMEM培養(yǎng)液分別加入CIG(0.5、1、5、10、20和50 μg/mL), *表示P<0.05，**表示P<0.01。

2.2.2 CIG提取物對血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響

通過添加最適濃度的CIG探究其對高糖引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響。將各組分別與試驗(yàn)組1作顯著性差異分析，試驗(yàn)組1細(xì)胞增殖率明顯低于對照組，證明在高糖條件下細(xì)胞增殖受到較大影響；試驗(yàn)組2～4與試驗(yàn)組1相比，細(xì)胞增殖率顯著升高。結(jié)果表明高糖培養(yǎng)液可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，但適當(dāng)濃度的CIG可改善此抑制效果。

Control group為正常DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；Group 1為含100 mmol/L葡萄糖的DMEM-H培養(yǎng)液；Group 2～4為100 mmol/L葡萄糖DMEM培養(yǎng)液分別加入CIG(0.5、5和50 μg/mL), *表示P<0.05，**表示P<0.01。

2.2.3 CIG提取物對血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)的影響

圖5為Actin-Tracker Green和DAPI雙染色及明場條件下合成的圖片，綠色熒光為細(xì)胞骨架染色，藍(lán)色熒光為細(xì)胞核染色，雙染色的方法可在激光共聚焦顯微鏡下明顯觀察到各組細(xì)胞形態(tài)差異。圖5(a)為在正常培養(yǎng)條件下生長的細(xì)胞，細(xì)胞間緊密相連，細(xì)胞飽滿呈鋪路石狀，符合血管內(nèi)皮細(xì)胞的正常形態(tài)；圖5(b)為陰性對照組，細(xì)胞數(shù)量較少且萎縮嚴(yán)重，可見10% DMSO可顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；圖5(c)為高糖組，細(xì)胞間隙較大，與圖5(a)相比細(xì)胞明顯萎縮，證明高濃度葡萄糖會影響血管內(nèi)皮細(xì)胞正常生長，與糖尿病、高血糖引起的血管疾病相關(guān)。圖5(d)和(e)為0.5、5 μg/mL的CIG組，相較于圖5(c)，細(xì)胞間隙較小，且細(xì)胞更加飽滿，幾乎恢復(fù)到圖5(a)水平，證明0.5～5 μg/mL 的CIG可顯著抑制高糖引起的細(xì)胞萎縮及凋亡。圖5(f)的細(xì)胞狀態(tài)雖達(dá)不到圖5(d)和(e)的效果，但細(xì)胞間隙及萎縮程度與圖5(c)相比有所改善。結(jié)果表明，添加適當(dāng)質(zhì)量濃度CIG可在一定程度上緩解因高糖引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞萎縮和凋亡，改善細(xì)胞活性，不僅可以防止血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老或脫落，還可以抑制對血液環(huán)境有害的代謝物的分泌，保護(hù)單層血管內(nèi)皮細(xì)胞的健康和完整性，避免細(xì)胞外基質(zhì)中膠原和不溶性纖維蛋白等凝血因子裸露引起的血小板凝集和血栓形成，從而起到保護(hù)血管的作用[18]。

(a)對照組為正常DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng);(b)陰性對照組為10% DMSO培養(yǎng)液;(c)含100 mmol/L葡萄糖的DMEM-H培養(yǎng)液;(d)～(f)低、中、高質(zhì)量濃度CIG組，即100 mmol/L葡萄糖DMEM培養(yǎng)液分別加入CIG 0.5、5和50 μg/mL。

2.2.4 CIG提取物對血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡早、晚期的影響

圖6所示，左上、左下、右上及右下象限分別為機(jī)械性損傷細(xì)胞、活細(xì)胞、晚期凋亡及壞死細(xì)胞和早期凋亡細(xì)胞。在機(jī)械性損傷不計(jì)的情況下，發(fā)現(xiàn)100、200 mmol/L葡萄糖均可不同程度地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在100 mmol/L高糖誘導(dǎo)條件下，50 μg/mL CIG[圖6(d)]抑制凋亡的作用并不明顯，但0.5、5 μg/mL的CIG[圖6(b)和(c)]可減輕細(xì)胞凋亡的程度，晚期凋亡和壞死細(xì)胞比例向早期凋亡細(xì)胞轉(zhuǎn)移。200 mmol/L高糖[圖6(f)]誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效果比100 mmol/L[圖6(a)]更明顯，3種質(zhì)量濃度CIG均可抑制該凋亡效果，但5 μg/mL質(zhì)量濃度[圖6(g)]條件下抑制效果最為明顯，50 μg/mL的CIG[圖6(h)]抑制效果強(qiáng)于0.5 μg/mL的CIG[圖6(f)]。該結(jié)果與100 mmol/L高糖條件下相反，可能是葡萄糖濃度升高，細(xì)胞損傷和凋亡更嚴(yán)重，需藥量增加的原因。從細(xì)胞凋亡比例、細(xì)胞凋亡早、晚期比例可以看出，CIG抑制高糖引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡屬于劑量依賴性，其可減輕細(xì)胞損傷或凋亡的嚴(yán)重程度，改善細(xì)胞活性。適當(dāng)濃度的CIG可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性，抑制高糖引起的細(xì)胞凋亡。血管內(nèi)皮細(xì)胞的健康是預(yù)防血栓形成的重要措施，是血管內(nèi)壁內(nèi)皮化的重要因素，提高內(nèi)皮細(xì)胞活性可改善高血糖對血管內(nèi)皮化的破壞。

Control為普通DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。(a)100 mmol/L高糖培養(yǎng)液組;(b)～(d)分別在高糖培養(yǎng)液中加入CIG 50、5和0.5 μg/mL；(e)200 mmol/L高糖培養(yǎng)液組;(f)～(h)分別在高糖培養(yǎng)液中加入CIG(50、5和0.5 μg/mL)。

3 結(jié)論

通過提取、富集等步驟得到CIG提取物，利用HPLC-MS對其進(jìn)行鑒定和定量；將該提取物加入細(xì)胞培養(yǎng)液中干預(yù)細(xì)胞生長，發(fā)現(xiàn)0.5～50 μg/mL的CIG提取物可顯著提高血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性，減輕高糖條件下細(xì)胞的萎縮，抑制高糖引起的細(xì)胞凋亡。綜上所述，CIG對高糖環(huán)境中的血管內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用。

血管內(nèi)皮細(xì)胞衰亡是血栓形成的重要原因，增強(qiáng)細(xì)胞活性、保護(hù)單層細(xì)胞完整性可促進(jìn)血管內(nèi)皮化，防止血管內(nèi)壁損傷。為進(jìn)一步佐證CIG具有保護(hù)血管的作用，后續(xù)研究還可對血管內(nèi)皮細(xì)胞蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測，通過蛋白差異性表達(dá)闡述CIG保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用。