仙亞杰，王 斐，謝雙全，陳喜鳳，沈海濤，李鴻彬

(石河子大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 新疆植物藥資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子 832003)

烏拉爾甘草(Glycyrrhizauralensis)是一種重要的藥用植物，其根和根莖中含有的次生代謝物質(zhì)是主要的藥用成分[1-2]。甘草抗逆性以及逆境環(huán)境與次生代謝物合成與積累的相關(guān)研究已開展了一些工作[3-4]。在水分虧缺的生長(zhǎng)環(huán)境中，甘草側(cè)根可以延長(zhǎng)生長(zhǎng)到幾十米外去尋求水分[5]。烏拉爾甘草幼苗具有離子區(qū)隔化及平衡能力，在鹽脅迫條件下幼苗能促進(jìn)K+，抑制Na+向上部葉的運(yùn)輸，維持較高的K+/Na+比值，從而減少鹽害作用[6]。使用一定濃度的鹽溶液處理可以提高甘草產(chǎn)量及甘草中甘草酸的含量[7]。適當(dāng)?shù)母珊得{迫刺激不僅能促進(jìn)甘草體內(nèi)的糖代謝，加速物質(zhì)分解，還能促進(jìn)甘草酸的形成并在植物體內(nèi)大量積累[8-9]。

CIPK為植物所特有的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬第3類SnRK3激酶(SNF-1 related protein kinase 3, SnRK3)，具有N-端的激酶域和C-端的調(diào)節(jié)域[10-11]。目前在擬南芥(Arabidopisisthaliana)、水稻(Oryzasativa)、楊樹(Populuspoplars)、玉米(Zeamays)、油菜(Brassicanapus)和高粱(Sorghumbicolor)中已分別克隆鑒定出多個(gè)CIPK基因[12-15]。大量研究表明，CIPK基因的表達(dá)與逆境脅迫密切相關(guān)：水稻作物中OsCIPK3經(jīng)低溫誘導(dǎo)后其表達(dá)量上調(diào)，過表達(dá)OsCIPK12可增強(qiáng)水稻的耐旱性[16]；小麥TaCIPK7、TaCIPK15、TaCIP24、TaCIPK32基因參與誘導(dǎo)植物低溫脅迫應(yīng)答[17]。關(guān)于烏拉爾甘草GuCIPK基因信息及其參與逆境脅迫的表達(dá)與潛在功能的相關(guān)研究未見報(bào)道。

利用生物信息學(xué)方法從烏拉爾甘草全基因組中鑒定獲到22個(gè)GuCIPK基因，并對(duì)這些基因的染色體分布、基因結(jié)構(gòu)和基序、進(jìn)化關(guān)系和順式作用元件進(jìn)行系統(tǒng)分析，研究GuCIPK在非生物脅迫下的表達(dá)特征，為解析GuCIPK基因在非生物脅迫應(yīng)答和生長(zhǎng)發(fā)育中的功能和調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

甘草品種為石河子大學(xué)甘草研究所保存的野生藥用烏拉爾甘草(Glycyrrhizauralensis)，憑證標(biāo)本為李學(xué)禹(880124)。將甘草種子用98% H2SO4浸泡處理 25 min，無(wú)菌水沖洗3次，0.1% HgCl2消毒7 min后播種至基質(zhì)盆缽內(nèi)，溫度28 ℃/25 ℃(白天/黑夜)，光照周期16 h/8 h(光照/黑暗)進(jìn)行蛭石培養(yǎng)45 d。收集同一時(shí)期烏拉爾甘草的根、莖和葉片組織，置于-80 ℃?zhèn)溆?。選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗移至300 mL的水培瓶中，用1×Hoagland(去除Na+)營(yíng)養(yǎng)液水培3 d后進(jìn)行非生物脅迫處理。

1.2 方法

1.2.1 烏拉爾甘草CIPK基因家族成員鑒定與生物信息學(xué)分析

以擬南芥(25個(gè))和大豆(52個(gè))的CIPK氨基酸序列作為參考序列，使用Blastp比對(duì)烏拉爾甘草的蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(篩選條件：E-value<1e-10, identity>55%)，去除重復(fù)后根據(jù)CIPK蛋白的保守結(jié)構(gòu)域篩選甘草GuCIPK候選基因，并根據(jù)相應(yīng)的軟件進(jìn)行生物信息分析[18-19]。GuCIPK蛋白的等電點(diǎn)、分子質(zhì)量、亞細(xì)胞定位等分析由在線網(wǎng)站獲得(http:∥expasy.org/)。使用MEGA軟件采用鄰接法(Neighbor-Joining)分析將烏拉爾甘草、擬南芥、大豆CIPK基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化，校驗(yàn)參數(shù)1 000次重復(fù)?；蚪Y(jié)構(gòu)和保守基序分別使用GSDS(http:∥gsds.cbi.pku.edu.cn/)和MEME(http:∥meme-suite.org/index.html)在線分析，多序列比對(duì)使用Bioedit軟件進(jìn)行。染色體的分布和基因間的復(fù)制關(guān)系分析使用TBtool軟件(https:∥github.com/CJ-Chen/TBtools)完成。非同義突變Ka和同義突變Ks通過DnaSP 5.0軟件計(jì)算；共線性關(guān)系圖通過Graphics工具分析并繪制。提取GuCIPK基因上游約1 500 bp的啟動(dòng)子序列并通過PlantCARE(http:∥bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/)分析存在的順式作用元件。

1.2.2 材料處理

分別使用包含300 mmol/L NaCl、100 g/L PEG6000、2% H2O2的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液水培甘草進(jìn)行鹽、干旱以及超氧脅迫處理；將甘草苗放置于4 ℃和42 ℃的光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行低溫和高溫脅迫處理。分別收集處理0、6、12、24 h的根組織材料進(jìn)行液氮速凍并凍存于-80 ℃待用。

1.2.3 RNA提取與基因表達(dá)分析

使用天根公司(中國(guó)北京)的多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取不同甘草材料的總RNA，利用寶生物公司(中國(guó)北京)的ScriptTM RT試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。使用Primer Premier 5.0軟件[20]設(shè)計(jì)特異性引物(表1)，并由生工生物工程(中國(guó)上海)股份有限公司合成。甘草肌動(dòng)蛋白基因GuActin作為內(nèi)參基因。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)分析GuCIPK基因的表達(dá)特征，每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，相對(duì)表達(dá)值使用2-ΔΔCt法。熱圖制作及聚類分析使用MultiExperiment Viever軟件[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 烏拉爾甘草GuCIPK家族基因鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析

從烏拉爾甘草基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中初步鑒定到22個(gè)CIPK基因家族成員(GuCIPK1～GuCIPK22)，相關(guān)信息見表2。其中GuCIPK17為拼接錯(cuò)誤序列，對(duì)該序列設(shè)計(jì)引物(表1)并經(jīng)PCR擴(kuò)增和測(cè)序驗(yàn)證后獲得完整序列。結(jié)果顯示：所有GuCIPK基因家族成員分布在19個(gè)不同的染色體位置(圖1)。22個(gè)GuCIPK基因之間共檢測(cè)到GuCIPK1/GuCIPK17、GuCIPK9/GuCIPK21、GuCIPK5/GuCIPK15、GuCIPK6/GuCIPK19和GuCIPK4/GuCIPK22這5個(gè)片段重復(fù)事件基因?qū)Α?2個(gè)GuCIPK的開放閱讀框的列長(zhǎng)度分布在1 200～1 695 bp之間，編碼的蛋白質(zhì)序列長(zhǎng)度在393～564個(gè)氨基酸之間，理論分子質(zhì)量為44.23～64.15 ku，等電點(diǎn)分布為5.82～9.43。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示GuCIPK均定位在細(xì)胞外基質(zhì)(表2)。烏拉爾甘草與擬南芥和大豆CIPK之間的進(jìn)化分析顯示：CIPK聚類為Ⅰ～Ⅴ 5個(gè)組(圖2)，其中Ⅰ和Ⅴ組的成員最多，各有8個(gè)成員，Ⅱ組和Ⅲ組分別有2個(gè)和3個(gè)成員，Ⅳ組只有1個(gè)成員。

黑線代表片段重復(fù)基因?qū)Γ恢Ъ芤圆煌伾@示為圓形。

紅色、綠色和藍(lán)色分別表示烏拉爾甘草、擬南芥和大豆的CIPK蛋白。

表1 用于GuCIPK基因擴(kuò)增和表達(dá)分析的引物

表2 GuCIPK的詳細(xì)信息

2.2 烏拉爾甘草CIPK基因結(jié)構(gòu)及保守結(jié)構(gòu)域分析

為進(jìn)一步探究烏拉爾甘草CIPK的結(jié)構(gòu)特征，對(duì)CIPK的CDS序列和蛋白序列分別進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域分析(圖3)。GuCIPK家族成員可分為兩大類：內(nèi)含子富集的分支和內(nèi)含子缺失的分支。內(nèi)含子豐富的GuCIPK基因聚類在Ⅴ組中，而聚類在Ⅰ～Ⅳ組的GuCIPK成員包含內(nèi)含子較少[圖3(a)]。蛋白 motif分析結(jié)果顯示：GuCIPK共包含18個(gè)motif，其中 motif 9是CIPK蛋白NAF功能結(jié)構(gòu)域，廣泛分布于所有的GuCIPK蛋白中；另外，除GuCIPK7外的其他21個(gè)GuCIPK成員都含有1個(gè)ATP連接結(jié)構(gòu)域(motif 4)。所有GuCIPK都包含1個(gè)N端催化激酶結(jié)構(gòu)域和1個(gè)C端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，說明這些結(jié)構(gòu)域?qū)Φ鞍踪|(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用非常重要。本研究的所有GuCIPK的N端序列中含有1個(gè)激活域，C端序列中含有1個(gè)可與CBL蛋白結(jié)合的NAF結(jié)構(gòu)域及一段相對(duì)保守的可能與磷酸酶相結(jié)合的PPI結(jié)構(gòu)域(圖4)。

(a)CIPK基因外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)(墨綠色框和黑色線條分別代表外顯子和內(nèi)含子)；(b)CIPK蛋白保守基序分布(不同顏色的圖形表示不同的motif，基因組長(zhǎng)度顯示在底部)。

圖4 GuCIPK的多序列比對(duì)及保守結(jié)構(gòu)域分析

2.3 烏拉爾甘草CIPK基因家族順式作用元件分析

為了解烏拉爾甘草GuCIPK基因家族成員所包含的順式作用元件及可能的受調(diào)控情況，調(diào)取了22個(gè)GuCIPK家族成員上游1 500 bp的核酸序列進(jìn)行啟動(dòng)子元件預(yù)測(cè)分析(圖5)。結(jié)果顯示：4個(gè)成員具有TC-richment元件，說明這4個(gè)成員可能與防衛(wèi)和逆境應(yīng)答相關(guān)；15個(gè)成員具有HSE元件，說明這些成員的表達(dá)可能與響應(yīng)熱脅迫相關(guān)；8個(gè)成員具有LTR元件，說明它們可能與冷脅迫應(yīng)答相關(guān)；10個(gè)成員存在MBS元件，暗示它們的表達(dá)可能與干旱脅迫相關(guān)。在激素調(diào)控中，9個(gè)成員具有茉莉酸甲酯應(yīng)答元件，13個(gè)成員具有ABRE元件，6個(gè)基因具有TCA元件，說明這些成員可能與茉莉酸、脫落酸、水楊酸等激素響應(yīng)密切相關(guān)。

表示轉(zhuǎn)錄起始作用元件；?表示植物激素響應(yīng)元件；表示與環(huán)境脅迫相關(guān)的響應(yīng)元件；▽表示與植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控相關(guān)的順式作用元件。

2.4 烏拉爾甘草GuCIPK組織特異性表達(dá)分析

烏拉爾甘草GuCIPK基因在不同組織中的表達(dá)分析顯示：按照表達(dá)特征聚類分析，GuCIPK成員可分為4個(gè)組(圖6)。Ⅰ 組中GuCIPK基因家族成員在根中表達(dá)較低，在莖和葉中也有少量表達(dá)；Ⅱ 組中除GuCIPK8外的其他GuCIPK成員在根中表達(dá)較高；Ⅲ組中GuCIPK1、GuCIPK18和GuCIPK19這3個(gè)成員在根中表達(dá)較高，GuCIPK5和GuCIPK17在葉片組織中的表達(dá)最高；Ⅳ組中的GuCIPK家族成員在根、莖、葉中均有表達(dá)，但總體表達(dá)水平不高。這些結(jié)果表明GuCIPK成員可能在不同組織的發(fā)育過程中發(fā)揮著不同的作用。

圖6 烏拉爾甘草GuCIPK的組織特異性表達(dá)分析

2.5 GuCIPK響應(yīng)逆境脅迫的表達(dá)分析

為研究GuCIPK在不同逆境脅迫中的潛在功能，利用NaCl、PEG6000、H2O2，4 ℃和42 ℃分別對(duì)甘草進(jìn)行脅迫處理，并利用qRT-PCR分析GuCIPK的表達(dá)特征。結(jié)果顯示：在逆境脅迫處理下，不同GuCIPK成員表現(xiàn)出不同的表達(dá)特征，按照表達(dá)特征分類可分為4組，暗示它們?cè)陧憫?yīng)脅迫中可能具有不同的功能(圖7)。在300 mmol/L NaCl處理下，Ⅰ組和Ⅱ組的GuCIPK成員在處理6 h表達(dá)量最高，Ⅲ組中各GuCIPK成員在處理24 h表達(dá)量最高，Ⅳ組GuCIPK成員分別在處理6 h和12 h均有較高表達(dá)。H2O2脅迫處理結(jié)果顯示，Ⅰ組的GuCIPK成員在處理6 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，Ⅱ組GuCIPK成員分別在處理6 h和12 h均有較高表達(dá)，Ⅲ組成員在處理6～24 h過程中均持續(xù)高表達(dá)，Ⅳ組GuCIPK成員受脅迫處理后其表達(dá)量都受同等程度的下調(diào)。經(jīng)15% PEG6000處理后，Ⅰ組的GuCIPK成員在處理6～24 h過程中均受到顯著上調(diào)表達(dá)，Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組這3組中的GuCIPK成員僅在處理的某個(gè)時(shí)間點(diǎn)具有較高表達(dá)。經(jīng)4 ℃冷脅迫處理后，Ⅲ組成員在處理6 h和24 h具有較高表達(dá)，Ⅳ組成員在處理6 h和12 h表達(dá)量較高。42 ℃熱脅迫處理后，Ⅳ組的GuCIPK成員在6 h表達(dá)量顯著升高且達(dá)到最高。這些結(jié)果暗示GuCIPK可能在不同逆境脅迫響應(yīng)過程中發(fā)揮著不同的重要作用。

圖7 GuCIPK基因響應(yīng)NaCl、PEG、H2O2、冷和熱脅迫的表達(dá)特征分析

3 討論

關(guān)于CIPK家族功能的研究主要集中在模式植物和主要作物上，如擬南芥、水稻、大豆、番茄、楊樹等[22-24]。CIPK蛋白包括N-末端催化激酶結(jié)構(gòu)域和C-末端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，N-末端催化激酶域有一個(gè)ATP結(jié)合位點(diǎn)和一個(gè)活化環(huán)，C-末端調(diào)控域包含一個(gè)Asn-Ala-Phe(NAF)基序和PPI基序。NAF基序通過PPI基序介導(dǎo)CIPK和CBL之間的結(jié)合作用，以及CIPK和2C型蛋白磷酸鹽(PP2C)之間的相互作用[25-26]。研究鑒定到烏拉爾甘草基因組中有22個(gè)CIPK基因(圖1)。所有的GuCIPK在N端序列中含有一個(gè)激活域，在C端序列中含有一個(gè)NAF域(圖4)，這兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域可能與GuCIPK功能的發(fā)揮至關(guān)重要。

基因結(jié)構(gòu)如內(nèi)含子、外顯子分布和內(nèi)含子類型等是一些基因家族進(jìn)化的典型標(biāo)志[11]。擬南芥、水稻、玉米、楊樹和大豆的同一亞組CIPK基因的結(jié)構(gòu)都具有一定程度的相似性[23-24,27]。研究中同組GuCIPK的基因結(jié)構(gòu)具有較高的一致性，且Ⅰ～Ⅳ組成員與Ⅴ組成員相比內(nèi)含子較少或缺失(圖3)，表明內(nèi)含子的增加和缺失事件在CIPK家族的進(jìn)化過程中可能發(fā)揮著重要作用。

CIPK基因在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育和適應(yīng)環(huán)境脅迫方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[28]。研究發(fā)現(xiàn)AtCIPK3參與植物調(diào)節(jié)ABA和冷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程。非生物脅迫(低溫、干旱、高鹽、氧化、糖、強(qiáng)堿和低鉀等)可誘導(dǎo)多個(gè)擬南芥AtCIPK基因顯著上調(diào)表達(dá)[29]。在水稻和玉米等其他物種中也發(fā)現(xiàn)，CIPK基因能夠響應(yīng)低溫、高溫、干旱和高鹽等脅迫的應(yīng)答[16, 27]。研究表明，CIPK的過表達(dá)可以顯著增強(qiáng)植物的抗逆性，這種抗逆性的獲得與Na+的轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控、脯氨酸和糖等生理代謝物質(zhì)累積緊密相關(guān)[28]。CIPK可與CBL之間形成CBL-CIPK復(fù)合物，受膜上Na+信號(hào)及其調(diào)控的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca+濃度變化的影響，進(jìn)而參與植物對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)[12-13]。GuCIPK受到不同非生物脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)(圖7)，暗示GuCIPK的表達(dá)與離子轉(zhuǎn)運(yùn)平衡和細(xì)胞內(nèi)代謝物產(chǎn)生之間的密切聯(lián)系。另外，激素在植物響應(yīng)非生物脅迫過程中也發(fā)揮重要作用；ABA在非生物脅迫下可以顯著累積[30]；而擬南芥CIPK3受ABA信號(hào)調(diào)控參與鹽脅迫應(yīng)答[31]；CIPK與CBL形成復(fù)合體能夠調(diào)節(jié)植物對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)，并與ABA調(diào)控的氣孔變化和K+平衡緊密相關(guān)[32]。GuCIPK基因的啟動(dòng)子區(qū)含有ABA等多個(gè)激素響應(yīng)元件(圖5)，表明GuCIPK的表達(dá)可能受植物激素調(diào)控并進(jìn)一步參與非生物脅迫響應(yīng)。GuCIPK基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育及響應(yīng)逆境脅迫中可能的功能調(diào)控機(jī)制需要進(jìn)一步深入研究和驗(yàn)證。

4 結(jié)論

從烏拉爾甘草基因組中共鑒定獲得22個(gè)GuCIPK基因成員，它們具有典型的植物CIPK的特性，并在不同組織中具有不同的表達(dá)特征；GuCIPK啟動(dòng)子中含有多個(gè)響應(yīng)逆境脅迫的順式作用元件，GuCIPK成員受到不同逆境脅迫的顯著誘導(dǎo)表達(dá)。