甄 靜，李 磊，王繼雯，楊文玲，杜志敏，李亮亮，鞏 濤

(1.河南省微生物工程重點實驗室，鄭州 450008；2.河南省科學院生物研究所有限責任公司，鄭州 450008)

多環(huán)芳烴(PAHs)是一種廣泛存在于環(huán)境中的毒性有機化合物[1]，很多PAHs會在生物體內積累，通過細胞毒性、遺傳毒性和免疫毒性對生物體產生致癌、致畸、致突變作用[2-3]，對自然界生物安全和人類健康造成巨大威脅。多環(huán)芳烴主要來源于生活中有機物的不完全燃燒(原油和煤炭)和各項的工業(yè)活動(化石燃料的提煉過程)[4-5]。近幾年來由于城市化和工業(yè)化速度的不斷加快，多環(huán)芳烴的污染形勢更加嚴峻，而且多環(huán)芳烴具有易遷移、難降解和生物積累等特性，在生態(tài)系統(tǒng)中可以不斷循環(huán)。因此，如何有效治理多環(huán)芳烴污染一直是世界各國所面臨的重大環(huán)境問題。

在多環(huán)芳烴的污染土壤中，多環(huán)芳烴的污染形式逐漸趨于復雜化和多元化，污染物多以復合污染的形式存在。重金屬(heavy metal, HM)作為典型的無機污染物，不能被降解，只能被轉化，在環(huán)境中常與PAHs共存形成復合污染[6]。兩種污染物同時存在于同一環(huán)境時發(fā)生各種直接或間接的相互作用，使其毒性大于單一污染物所產生的效應之和[7]，進而增加多環(huán)芳烴污染修復的難度。

生物修復作為重金屬和多環(huán)芳烴單一污染的重要修復手段，在兩者復合污染的PAHs修復中同樣因其成本低、無二次污染等優(yōu)勢被人們所重視[8-9]，其中微生物的轉化和降解一直是被認為比較有效地去除和降解多環(huán)芳烴的實用方法[10]。研究發(fā)現(xiàn)在微生物修復復合污染PAHs的過程中，由于重金屬的毒性，微生物對復合污染中PAHs的去除和降解效果被減弱，有些微生物甚至不具備降解能力[11-12]。而且兩者復合污染位點經常伴隨著土壤酸堿度的變化或營養(yǎng)物質的缺乏，土壤酸堿的不確定性或營養(yǎng)物質缺乏通過影響修復位點的生理生化性質和生態(tài)系統(tǒng)進而影響微生物對復合污染物的修復和降解[13-15]。因此，篩選出在這些不良環(huán)境中能夠很好降解多環(huán)芳烴的菌株尤為重要，目前國內在這方面的研究少有報道。

在復合污染中，重金屬和多環(huán)芳烴的種類往往不止一種，所以本試驗根據實際污染情況有針對性地進行微生物降解菌株的篩選，選用多環(huán)芳烴菲和芘、重金屬Cu2+和Cr6+進行微生物菌株的篩選，并進一步篩選能夠耐受不良pH和營養(yǎng)物質缺乏的菌株，然后分析篩選菌株在這些不良環(huán)境中對多環(huán)芳烴菲和芘的降解效果。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 土樣

污染土樣采自南陽長期受石油污染的土壤。采集表層0～8 cm的土壤，裝入無菌自封袋中，封口并帶回實驗室，該污染土樣用于菌株的篩選。

1.1.2 培養(yǎng)基

M9液體培養(yǎng)基(1 L)[16-17]：Na2HPO46 g，KH2PO43 g，NaCl 0.5 g，NH4Cl 1 g，加入2.5 mL營養(yǎng)液，pH 7.2。營養(yǎng)液(1 L)組成：MgCl210.75 g，CaCO32.0 g，F(xiàn)eSO44.5 g，ZnSO41.44 g，MnSO41.12 g，CuSO40.25 g，CoSO40.24 g，H3BO40.06 g，HCL 51.3 mL。固體培養(yǎng)基加入1.5%瓊脂粉。菲和芘用正己烷配置成母液，用0.22 μm有機濾膜過濾滅菌后加入滅好菌的M9培養(yǎng)基中作為唯一碳源。

OMM培養(yǎng)基(1 L)[18]: KH2PO40.1 g，Na2HPO40.1 g，NH4NO30.5 g，NH4SO40.5 g，MgSO40.2 g，CaCl20.02 g，F(xiàn)eCl20.002 g，MnSO40.002 g，pH 6.5。

1.2 方法

1.2.1 菌株的篩選

(1)富集培養(yǎng)及分離。新鮮土壤樣品過2 mm篩子，準確稱取10.00 g，加入50 mL的M9液體培養(yǎng)基中，放入搖床180 r/min，25 ℃培養(yǎng)24 h，取5 mL上層培養(yǎng)液轉接于45 mL M9液體培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基中含有質量濃度各為250 mg/L的菲和芘，當看見微生物增長明顯時，再次取5 mL培養(yǎng)液轉接到含有菲和芘的新鮮的M9培養(yǎng)基中，經過幾次的轉接培養(yǎng)后梯度稀釋，取0.1 mL梯度稀釋的培養(yǎng)液涂布于M9固體培養(yǎng)基上，固體培養(yǎng)基含有100 mg/L菲和100 mg/L芘，放置于培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)。待長出菌落后挑取培養(yǎng)基上的細菌平板劃線得出細菌單菌落。

(2)耐不良環(huán)境菌株的篩選。重金屬分析：分別用去離子水配置10 g/L Cr6+和1 g/L Cu2+母液。挑取上述篩選出的單菌落接種于OMM固體培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)基中加0.5%葡萄糖作為唯一碳源，分別加入重金屬Cr6+和Cu2+，使Cr6+和Cu2+終質量濃度各為40 mg/L，于培養(yǎng)箱25℃培養(yǎng)1～3 d，觀察菌株的生長情況。

pH分析：用過濾滅菌的HCl將M9固體培養(yǎng)基的pH值調至7.4和5.0。挑取上述篩選出的單菌落接種于pH值分別為7.4和5.0的M9固體培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)基中加入0.5%葡萄糖作為唯一碳源，觀察菌株的生長情況。

營養(yǎng)缺乏分析：用Ca3(PO4)2代替M9固體培養(yǎng)基中的NH4Cl，pH 7.4，其他成分不變，培養(yǎng)基中加入0.5%葡萄糖作為唯一碳源。

1.2.2 菌株重金屬、pH和營養(yǎng)缺乏耐性分析

在上述研究的基礎上，考察重金屬、pH及營養(yǎng)缺乏對菌株生長的影響。180 r/min，25 ℃進行搖床培養(yǎng)，在不同時間段取培養(yǎng)液，用96孔板測定OD600以檢測菌株的生長情況。

1.2.3 菌株鑒定

挑取單菌落接種于LB培養(yǎng)基中，180 r/min，37 ℃培養(yǎng)24 h，用菌液直接進行PCR擴增。用于PCR擴增反應的引物序列：前引物 27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)，后引物 1492R(5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。

PCR擴增程序：95 ℃預變性10 min；94℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)。PCR 反應產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測后送華大基因公司進行測序分析。將測序結果在GenBank中用Blast進行同源性比較。

1.2.4 菌株在不良環(huán)境中對PAHs的降解分析

菌液的制備：從M9固體培養(yǎng)基中挑取菌株F3-1，接種于LB液體培養(yǎng)基中，180 r/min，37 ℃，搖床培養(yǎng)16～24 h后離心棄上清液，加入含有0.5%葡萄糖的M9液體培養(yǎng)基使菌液的OD600為1.0備用。該M9液體培養(yǎng)基中用Ca3(PO4)2代替NH4Cl，同時加入重金屬離子Cr6+和Cu2+，Cr6+和Cu2+終質量濃度各為20 mg/L，pH 5.0和7.4。

用正己烷分別配備質量濃度為150 mg/L的菲或芘標品，在棕色玻璃瓶中加入1 mL菲或芘標品溶液，待正己烷完全揮發(fā)后，取OD600=1.0的3 mL細胞菌液加入棕色玻璃瓶中，對照處理組為加入3 mL相同質量濃度的滅活菌液，置于25 ℃，180 r/min，恒溫搖床培養(yǎng)5 d進行降解實驗，每批樣品3組平行樣。降解率=(對照樣質量濃度-降解樣質量濃度)/對照樣質量濃度×100%。

1.2.5 樣品預處理及HPLC分析

液相樣品預處理：萃取相用色譜級的正己烷，每個樣品加入3 mL正己烷萃取，旋渦振蕩10 min，搖床振蕩20 min后靜置，待樣品分層穩(wěn)定后，取上層有機相并加入一定量的無水硫酸鈉脫水，然后將此有機相用0.22 μm的濾膜過濾。

HPLC分析：采用安捷倫 LC-1200 型高效液相色譜儀測定PAHs含量。樣品注入量為20 μL，分離柱為 ZORBAX SB-C18 column(0.46 mm×150 mm，安捷倫)，柱溫30 ℃，紫外檢測波長254 nm，流動相為乙腈和水(體積比為 80∶20)，流速1.0 mL/min。

2 結果與分析

2.1 菌株的篩選

通過多次的富集培養(yǎng)和分離純化，從污染土壤中共篩選出14株細菌，這些細菌能夠在以菲和芘為唯一碳源時生長。將各個菌株進行分子生物學鑒定，結果顯示，所分離的菌株分別屬于假單胞菌、副球菌屬、博代氏桿菌屬、無色桿菌屬、鮑特氏菌和根瘤菌屬。

為了能夠獲得耐受不良環(huán)境的實用性菌株，通過平板培養(yǎng)分析各個菌株的重金屬、pH和營養(yǎng)缺乏耐性，從中獲得2株較好的耐受3種不良環(huán)境菌株F3-1和B3-1，兩種菌株相比，F(xiàn)3-1在平板上的生長狀況優(yōu)于B3-1，所以選用F3-1進一步分析研究。菌株F3-1在培養(yǎng)基及顯微鏡下的形態(tài)見圖1和圖2。從圖1可以看出，菌株F3-1為白色的圓形菌落，邊緣平整，表面光滑濕潤，革蘭氏染色呈陰性，顯微鏡下菌落形態(tài)為短桿狀。為了進一步確定該菌的分類地位，在形態(tài)學的基礎上又進行了分子生物學鑒定，用設計的引物擴增并進行16S rDNA基因測序，將得到的序列與GenBank中已知序列進行對比，選取同源性較近的模式菌株進行系統(tǒng)發(fā)育分析，結果見圖2。序列對比表明，菌株F3-1與根瘤菌屬Rhizobiumpusense的序列相似性為99%，因此鑒定該菌株F3-1屬于根瘤菌。

圖1 菌株F3-1在LB培養(yǎng)基及顯微鏡下的形態(tài)(100×)

圖2 菌株F3-1與相關菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 菌株F3-1的重金屬、pH和營養(yǎng)缺乏耐性分析

2.2.1 菌株F3-1重金屬耐性分析

所選的重金屬Cr6+質量濃度為0、1、3、5、7、10、20、50和100 mg/L，考察該菌株對重金屬Cr6+的耐受性，結果見圖3。從圖3可以看出，菌株在Cr6+質量濃度為0～20 mg/L時均可以正常生長。當Cr2+質量濃度為50 mg/L時，菌株生長受到抑制；而當Cr6+質量濃度為100 mg/L時，菌株幾乎沒有生長?？梢钥闯?，菌株F3-1可以耐受重金屬Cr6+的質量濃度為20 mg/L。

圖3 菌株F3-1在不同Cr6+質量濃度下的生長曲線

Cu2+離子質量濃度分別設置為0、2、4、6、8、10、20和40 mg/L，結果見圖4。從圖4可以看出，菌株在Cu2+離子質量濃度為0～20 mg/L時均可以正常生長。當Cu2+質量濃度為40 mg/L時，菌株生長受到抑制。因此，菌株F3-1可以耐受Cu2+離子質量濃度為20 mg/L。

圖4 菌株F3-1在不同Cu2+質量濃度下的生長曲線

2.2.2 菌株F3-1 pH耐受性分析

考察菌株F3-1在強酸性(pH 5.0)和中性(pH 7.4)條件下的生長狀況，結果見圖5。從圖5可以看出，無論是強酸性環(huán)境還是中性環(huán)境，菌株F3-1均可以正常生長，說明該菌株F3-1能夠耐受酸性及中性的環(huán)境。

圖5 菌株F3-1在不同pH條件下的生長曲線

2.2.3 菌株F3-1 營養(yǎng)缺乏分析

根瘤菌在純培養(yǎng)中的自生固氮作用已有許多報道[15]，這種純培養(yǎng)的培養(yǎng)基均需有各種大量的和微量的無機鹽、碳源、維生素等。在缺乏氮源M9培養(yǎng)基上分析菌株的生長情況，結果見圖6。結果表明，菌株F3-1在缺乏氮源的液體培養(yǎng)基中可以正常生長，受氮源缺乏的影響較小。

圖6 菌株F3-1營養(yǎng)缺乏耐受性分析

2.3 菌株F3-1在不良環(huán)境中對PAHs降解效果

在缺乏氮源以及重金屬Cr6+和Cu2+終質量濃度各為20 mg/L的條件下，分析菌株F3-1在強酸性pH 5.0和中性pH 7.4條件下對菲和芘的降解效果，結果見圖7。從圖7可以看出，菌株F3-1在強酸性pH 5.0和中性pH 7.4條件下均可以降解菲和芘，但降解效果有一定的差異，菌株F3-1在中性條件下對菲表現(xiàn)出較好的降解能力，在強酸性條件下對芘的降解效果較好，5 d后菌株F3-1在pH 7.4時對菲的降解率為35.54%，在pH 5.0時對芘的降解率為53.43%。

圖7 菌株F3-1對PAH降解效果

3 討論與結論

目前高效降解PAHs的微生物菌株和菌群已有大量的研究報道，這些微生物在較短的時間內能夠達到很好的PAHs降解效果，但這些都依賴于環(huán)境中可行的物理條件，比如pH、溫度和充分營養(yǎng)條件等，因為只有在合適的環(huán)境中微生物才能夠正常生長和保持活性[19]。而在現(xiàn)實環(huán)境中往往受到各種不利條件的影響，如PAHs污染土壤的pH呈現(xiàn)從酸性到中性的變化，環(huán)境中其他污染物如重金屬能夠加劇多環(huán)芳烴對微生物細胞的毒害作用[20]，再者氮源的不足也降低微生物對多環(huán)芳烴的降解。因此，本研究利用多種培養(yǎng)基從多環(huán)芳烴污染土壤中篩選得到14株能夠以菲和芘為唯一碳源生長的細菌菌株，并從14株細菌中分離到1株較好的耐受重金屬、極端pH和營養(yǎng)缺乏的多功能細菌F3-1，通過形態(tài)學觀察和16 S rDNA基因序列比對確定該菌株與根瘤菌屬中Rhizobiumpusense的同源性最近，因此確定該菌株屬于根瘤菌。研究表明，根瘤菌不但具有較好的有機污染物降解和抗重金屬的能力，而且還可以誘導刺激其他降解菌的生存和降解能力，從而在更大程度上提高對污染物的降解效果[21]。

多環(huán)芳烴污染源的土壤大多以復合污染的形式存在，其中多環(huán)芳烴和重金屬屬于環(huán)境中最常見的復合污染。一方面，復合污染中重金屬的存在導致多環(huán)芳烴降解菌降解能力大大降低，甚至無法存活[22]，本研究選用OMM培養(yǎng)基分析各個菌株對Cr6+和Cu2+兩種重金屬的耐受性，與其它培養(yǎng)基相比，OMM培養(yǎng)基較少影響游離重金屬的毒性，從而使重金屬的毒性更大[6]，結果發(fā)現(xiàn)4株菌株能夠在質量濃度分別為40 mg/L的Cr6+和Cu2+中正常生長；另一方面，在重金屬污染區(qū)域往往存在養(yǎng)分不足的問題，營養(yǎng)成分的不足大大減少PAH降解菌的數(shù)量，營養(yǎng)物質已經被認為是影響多環(huán)芳烴生物降解的一個最重要因素，而氮素的極端不足又是養(yǎng)分不足的核心問題[23]。本研究考察各個菌株在氮源缺乏培養(yǎng)基的生長狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)有2株菌株能夠較好地生長，進一步分析這兩種菌株在酸性培養(yǎng)基上的生長狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)這兩種菌株也可以正常生長，綜合上述菌株在各個培養(yǎng)基的生長狀態(tài)，分離到1株較好的耐受重金屬、極端pH和營養(yǎng)缺乏的多功能菌株根瘤菌F3-1；進一步分析該根瘤菌F3-1在兩種重金屬Cr6+和Cu2+、氮源缺乏及極端pH環(huán)境中的生長曲線，結果表明根瘤菌F3-1在質量濃度為20 mg/L Cr6+和20 mg/L Cu2+的環(huán)境中正常生長，氮源缺乏對該菌株的生長影響也較小，根瘤菌F3-1能夠在強酸性(pH 5.0)和中性(pH 7.4)環(huán)境中正常生長。

本研究利用上述篩選到的耐受各種不良環(huán)境的根瘤菌F3-1，分析其在重金屬以及氮源缺乏等多種不利環(huán)境中對多環(huán)芳烴菲和芘的降解效果，結果表明，5 d后該根瘤菌F3-1在重金屬Cr6+和Cu2+(質量濃度均為20 mg/L)及缺乏氮源的情況下對菲和芘均有很好的降解效果，且根瘤菌F3-1在強酸性和中性環(huán)境中均可以降解菲和芘，但存在一定的差異性，在中性環(huán)境中對菲表現(xiàn)出較好的降解能力，在酸性環(huán)境中對芘的降解效果較好。目前在中性環(huán)境中菌株降解多環(huán)芳烴已經得到了廣泛的研究[24]，而微生物能夠在強酸性環(huán)境中降解多環(huán)芳烴的研究報道較少，本研究篩選的根瘤菌F3-1能夠在強酸性條件(pH 5.0)下降解菲和芘，為多環(huán)芳烴污染土壤的生物修復提供寶貴的微生物資源。