趙行行，程玉梅，陳 嫻，崔古貞，齊曉嵐，洪 偉

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué) 附屬醫(yī)院ICU，貴陽 550004；3.青島大學(xué)附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科，青島 266061；4.貴州醫(yī)科大學(xué) 微生物學(xué)教研室，貴陽 550025)

在大腸桿菌中fliC基因編碼的鞭毛蛋白是細(xì)菌鞭毛的主要結(jié)構(gòu)亞基，其在細(xì)菌感染、免疫以及分類學(xué)鑒定等方面起重要作用[1]。鞭毛作為大部分細(xì)菌最主要的運(yùn)動(dòng)器官，除具有調(diào)控細(xì)菌運(yùn)動(dòng)的作用外，還能夠介導(dǎo)細(xì)菌的黏附、趨化、侵襲等能力[2-3]。它能使細(xì)菌附著在宿主體內(nèi)并獲取營養(yǎng)物質(zhì)，也參與一系列致病過程,如機(jī)體的炎癥反應(yīng)、損壞機(jī)體器官、引起氧化應(yīng)激等[4]。對(duì)該基因的研究，在大腸桿菌中fliC基因的缺失對(duì)細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)、黏附、侵襲、毒力因子的表達(dá)等均有影響[5-7]。除此之外，fliC基因在大腸桿菌生物被膜的形成及成熟過程中具有促進(jìn)作用。生物被膜是由細(xì)菌菌群及自身分泌的胞外基質(zhì)組成，同時(shí)也是細(xì)菌為維持自身生命所發(fā)生形態(tài)學(xué)上的變化，從而增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)外界環(huán)境的抵抗力[8]。細(xì)菌生物被膜的存在可以抵抗人體的免疫清除及臨床抗生素的作用，最終導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性升高、致病能力增強(qiáng)，引起人體嚴(yán)重感染，對(duì)人類的健康造成重大危害[9]。據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院統(tǒng)計(jì)，約有65%的微生物感染和80%的慢性感染與生物被膜相關(guān)[10]。

Thermotargetron基因編輯技術(shù)(TMT，圖1)由嗜熱二型內(nèi)含子RNA(TeI3c/4c)和逆轉(zhuǎn)錄酶(Reverse transcriptase，RT)編碼基因組成[11]。通過“歸巢(Retrohoming)”效應(yīng)實(shí)現(xiàn)靶基因的失活。首先，TeI3c/4c和RT共同形成的核糖核蛋白復(fù)合體(RNP)，TeI3c/4c通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原則識(shí)別基因組中的靶位點(diǎn)；然后，RT發(fā)揮DNA核酸內(nèi)切酶和逆轉(zhuǎn)錄酶的活性[12]，切割雙鏈DNA靶位點(diǎn)并以內(nèi)含子RNA為模板合成cDNA插入其中；最后，DNA缺口由宿主DNA修復(fù)機(jī)制以cDNA為模板合成互補(bǔ)DNA，最終實(shí)現(xiàn)內(nèi)含子RNA在靶基因位點(diǎn)的“歸巢(Retrohoming)”。

(a)RNP由TeI3c/4c及RT酶組成，RNP通過堿基互補(bǔ)配對(duì)的原理識(shí)別靶向DNA；(b)反向剪接將TeI3c/4c序列反轉(zhuǎn)錄成cDNA并插入靶位點(diǎn)；(c)DNA缺口由宿主DNA修復(fù)機(jī)制修補(bǔ)。

研究應(yīng)用TMT系統(tǒng)構(gòu)建fliC基因失活突變株，在生物被膜形成能力明顯降低的情況下，通過自溶、pH敏感性、抗生素耐受性等試驗(yàn)探討該基因失活后對(duì)大腸桿菌在應(yīng)激狀態(tài)下的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基與試劑

Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基：酵母提取物(Yeast extract)5 g/L、氯化鈉(NaCl)10 g/L、胰蛋白胨(Tryptone)10 g/L。

瓊脂粉(Agar powder)、氯霉素(Chloramphenicol，Chl)、甲砜霉素(Thiamphenicol)、甲硝唑(Metronidazole)、氨芐青霉素(Ampicillin)、D-環(huán)絲氨酸(D-cycloserine)、紅霉素(Erythromycin)、鏈霉素(Streptomycin)、四環(huán)素(Tetracycline)、諾氟沙星(Norfloxacin)購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；SpeI-HF(R3553L)，BsiWI-HF(R3133L)購于北京New England BioLabs；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購于天根生化科技(北京)有限公司;大腸桿菌HMS174(DE3)細(xì)胞購自北京諾禾致源科技股份有限公司。所有引物合成及測序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.1.2 菌株與培養(yǎng)條件

質(zhì)粒構(gòu)建的宿主細(xì)胞為大腸桿菌NEBExpress高效感受態(tài)。在大腸桿菌HMS174(DE3)細(xì)胞中進(jìn)行fliC基因失活突變株的構(gòu)建。E.coliNEBExpress，E.coliHMS174菌株在LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)。質(zhì)量濃度為10 μg/mL氯霉素的LB培養(yǎng)基(LB-Chl)以篩選轉(zhuǎn)化子。

1.2 方法

1.2.1fliC基因打靶引物的設(shè)計(jì)

E.coliHMS174(DE3)菌株基因組序列從National Center for Biotechnology Information(NCBI)數(shù)據(jù)庫中獲取。根據(jù)TeI3c/4c識(shí)別位點(diǎn)規(guī)則“5′-AAnnnnnnnnnnnnnA-3′”設(shè)計(jì)HMS174fliC420s位點(diǎn)基因打靶載體構(gòu)建引物(表1)。

表1 引物

1.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建

通過兩次PCR和一次連接反應(yīng)進(jìn)行打靶質(zhì)粒的構(gòu)建。第一次PCR以IBS12與TeI3c-UNV、EBS2s與EBS1a作引物，pHK-TT1A質(zhì)粒為模板(表2)分別進(jìn)行擴(kuò)增；第二次PCR以IBS12與EBS1a作引物，上一次PCR產(chǎn)物為模板將第一次PCR產(chǎn)物連接成為具有與目標(biāo)基因互補(bǔ)配對(duì)的基因打靶片段。使用T5 exonuclease-dependent assembly方法(TEDA)將基因打靶片段與經(jīng)BsiWI-HF、SpeI-HF線性化的pHK-TT1A載體進(jìn)行重組連接[13]。重組體系轉(zhuǎn)化NEBExpress感受態(tài)細(xì)胞，使用質(zhì)粒提取試劑盒提取所攜帶質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子后，送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。

表2 菌株及質(zhì)粒

1.2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化及突變株篩選

Thermotargetron打靶質(zhì)粒經(jīng)測序驗(yàn)證構(gòu)建成功后轉(zhuǎn)化至HMS174感受態(tài)細(xì)胞，并涂布于LB-Chl平板。長出的單克隆挑取至LB-Chl培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)后轉(zhuǎn)移1 mL稀釋液至1.5 mL無菌離心管，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)1 h，隨后48 ℃ 熱激1 h(激活TeI3c/4c“歸巢”活性)。經(jīng)稀釋后涂布于LB-Chl平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜。

使用fliC檢測引物(表1)進(jìn)行菌落PCR，檢測上一步試驗(yàn)獲得的菌落是否發(fā)生插入突變。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min 20 s，循環(huán)30次；72 ℃再延伸5 min、4 ℃ 10 min?；蚴Щ钚?(突變株數(shù)量/總檢測菌株數(shù)量)×100%。

1.2.4 質(zhì)粒丟失

在無抗性培養(yǎng)基中連續(xù)傳代以丟失基因失活突變株的質(zhì)粒，具體方法：以1∶100的比例將突變株接種到無抗性LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)8 h，按此方法連續(xù)轉(zhuǎn)接10次，最后劃線于無抗性LB平板上。長出單克隆后，使用影印平板法[15]，將克隆挑取至LB-Chl和LB平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。質(zhì)粒丟失效率=丟失氯霉素抗性克隆數(shù)/總檢測克隆數(shù)×100%。

1.2.5 生長曲線的測定

取100 μL的野生型HMS174和ΔfliC420s菌液分別接種于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、250 r/min恒溫培養(yǎng)至兩者的OD600值均為0.8，各取100 μL加入新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、250 r/min恒溫培養(yǎng)，每間隔3 h測定OD600值，重復(fù)試驗(yàn)3次，取平均值，并繪制生長曲線。

1.2.6 運(yùn)動(dòng)能力檢測

將野生型HMS174與ΔfliC420 s分別用滅菌牙簽穿刺含5 g/L瓊脂粉的LB半固體培養(yǎng)基中，設(shè)置3個(gè)重復(fù)。正置于恒溫培箱，37 ℃培養(yǎng)過夜后，觀察并測量圓環(huán)直徑(細(xì)菌會(huì)依賴鞭毛以接種點(diǎn)為中心在培養(yǎng)基表面向周圍泳動(dòng)生長，并形成一個(gè)圓環(huán))。

1.2.7 生物被膜定量檢測

通過96孔微量板法檢測大腸桿菌生物被膜表型，將野生型HMS174和ΔfliC420s分別接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，230 r/min培養(yǎng)12 h，按1∶100的比例，用LB稀釋過夜培養(yǎng)物。再37 ℃ 230 r/min培養(yǎng)細(xì)菌OD600至0.8。取菌液200 μL加于96孔板中，置于恒溫培養(yǎng)箱，37 ℃培養(yǎng)24 h，M9作為空白對(duì)照。吸去培養(yǎng)基，用PBS洗液洗3次，用4%多聚甲醛固定15 min，結(jié)晶紫染色10 min，然后用去離子水洗凈，自然干燥后，加33%冰醋酸將結(jié)晶紫溶解，酶標(biāo)儀測OD600值。生物被膜判定標(biāo)準(zhǔn)：將空白對(duì)照平均D值(X)加上其3倍的標(biāo)準(zhǔn)差定義為臨界值(cut-off值，Dc)?；谂R界值Dc，菌株生物被膜可以分為D≤Dc為不黏附(-)；Dc3Dc強(qiáng)黏附(+++)[16]。

1.2.8 自溶試驗(yàn)

將野生型HMS174與ΔfliC420s的過夜培養(yǎng)物在LB中稀釋至OD600=0.05，再轉(zhuǎn)接新鮮LB液體培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)至OD600=0.8。收集菌體，洗滌兩次，將其懸浮于含0.01% Triton X-100的50 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH 7.0)中。然后每30 min檢測37 ℃培養(yǎng)的菌懸液OD600值，觀察細(xì)胞裂解情況。

1.2.9 pH敏感性試驗(yàn)

分別配制pH值為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12的LB液體培養(yǎng)基，滅菌冷卻后以1∶100比例接種已培養(yǎng)至OD600=0.8的野生型HMS174與ΔfliC420s，培養(yǎng)6 h，測量OD600值，判斷是否生長。

1.2.10 抗生素耐受性檢測

測定野生型HMS174與ΔfliC420s對(duì)甲砜霉素、甲硝唑、氨芐青霉素、D-環(huán)絲氨酸、紅霉素、鏈霉素、四環(huán)素、諾氟沙星的耐受性[17]。96孔板中含150 μL LB培養(yǎng)基，使用倍比稀釋法加入上述抗生素使其終質(zhì)量濃度為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5 μg/mL，菌株以5%接種率接至96孔板中，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。37 ℃培養(yǎng)24 h后測定OD600值處的吸光值，OD600≥0.1視為菌體生長。

2 結(jié)果與分析

2.1 fliC基因打靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)

fliC基因(ECHMS174_01916)在大腸桿菌HMS174中的序列全長為1 497 bp,見圖2(a)。在fliC基因中選擇符合TeI3c/4c識(shí)別位點(diǎn)規(guī)則的fliC420s(5′-AAcgtgctggcaaaaA-3′)。利用PCR突變野生型TeI3c/4c IBS1/2，EBS1/2位點(diǎn)，構(gòu)建能特異性識(shí)別fliC420s位點(diǎn)的打靶質(zhì)粒pHK-TT1A-fliC420s，見圖2(b)。

(a)TMT的fliC420s靶向位點(diǎn)；(b)fliC420s靶向位點(diǎn)的堿基組成。

2.2 質(zhì)粒構(gòu)建

基于pHK-TT1A質(zhì)粒構(gòu)建打靶載體，此過程需要進(jìn)行兩次PCR和一次連接反應(yīng)(圖3)。首次PCR反應(yīng)以pHK-TT1A為模板，使用fliC420sIBS12/TeI3c-UNV，fliC420sEBS2s/fliC420sEBS1a為引物(表1)，通過PCR擴(kuò)增獲得含有296 bp(IBS1/2)、114 bp(EBS1/2)的突變片段,見圖4(a)。第二次PCR以上一步PCR獲得的IBS1/2，EBS1/2突變片段為模板，以fliC420sIBS12/fliC420sEBS1a為引物，通過重疊延伸PCR擴(kuò)增獲得具有特異性識(shí)別位點(diǎn)的片段(393 bp)，見圖4(b)。使用TEDA法將特異性識(shí)別位點(diǎn)片段與線性化的pHK-TT1A載體進(jìn)行重組連接[13]，以獲得pHK-TT1A-fliC420s打靶質(zhì)粒。

圖 3 Thermotargetron載體構(gòu)建

(a)含有突變的IBS1/2(296 bp)和EBS1/2(114 bp)位點(diǎn)的擴(kuò)增子；(b)重疊延伸PCR組裝IBS1/2和 EBS1/2擴(kuò)增子。

2.3 突變株篩選及測序驗(yàn)證

使用fliC基因檢測引物(DPfliC-F/DPfliC-R，表1)進(jìn)行菌落PCR鑒定經(jīng)“歸巢(Retrohoming)”后的轉(zhuǎn)化子，PCR擴(kuò)增條帶比野生型菌株增加839 bp，表明TeI3c/4c二型內(nèi)含子成功失活fliC基因[1 558和2 397 bp，圖5(a)]，獲得ΔfliC420s。ΔfliC420s基因失活效率為86%，見圖5(b)。測序結(jié)果表明，TeI3c/4c二型內(nèi)含子成功插入大腸桿菌HMS174 ΔfliC420s基因中的預(yù)期位點(diǎn)，見圖5(c)。

(a)PCR篩選ΔfliC420s(M：DNA marker，WT：野生型，ΔfliC：fliC420s突變株)；(b)基因失活效率為86%；(c)TeI3c/4c成功插入fliC基因靶位點(diǎn)。測序數(shù)據(jù)處理使用SnapGene 4.1.8(GSL Biotech LLC)。

2.4 質(zhì)粒丟失

初次篩選獲得的ΔfliC420s仍攜帶其基因打靶質(zhì)粒pHK-TT1A-fliC420s。將該突變株連續(xù)10次在無抗性培養(yǎng)傳代后，使用克隆平板法篩選。質(zhì)粒丟失的突變株表現(xiàn)為在有抗性的平板上不能生長，而在無抗性平板上能生長。如圖6所示，經(jīng)過10次連續(xù)在無抗性培養(yǎng)基中傳代后，質(zhì)粒丟失成功(質(zhì)粒丟失效率為93%，突變株檢測15個(gè)克隆)。

ΔfliC420s僅在LB平板上形成菌落，而在LB-Chl平板上不形成菌落，則表明對(duì)應(yīng)突變株的質(zhì)粒丟失，且質(zhì)粒丟失效率為93%。

2.5 大腸桿菌ΔfliC生長曲線

野生型HMS174、ΔfliC420 s分別接種于液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，再各取100 μL加入新鮮的液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)，每隔3 h取樣測定1次OD600值，記錄并重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)3次，繪制生長曲線(圖 7)。結(jié)果顯示，突變株的生長速率與野生型菌株相似。

圖7 野生型HMS174與ΔfliC420s生長曲線

2.6 大腸桿菌ΔfliC運(yùn)動(dòng)能力檢測

對(duì)比野生型HMS174菌株與ΔfliC420s在半固體平板上的運(yùn)動(dòng)直徑范圍,見圖8(a)，ΔfliC420s基因失活菌株的泳動(dòng)能力顯著下降(***P<0.001)。野生型HMS174與ΔfliC420s在半固體培養(yǎng)基中形成的運(yùn)動(dòng)圓環(huán)的直徑分別為(6.6±0.57)mm 和(2.3±0.57)mm，見圖8(b)。

***為P<0.001。

2.7 大腸桿菌ΔfliC生物被膜表型檢測

經(jīng)96孔微量板篩選生物被膜結(jié)果(圖9)顯示，ΔfliC420s生物被膜形成能力明顯弱于野生型HMS174(***P<0.001)。

***為P<0.001。

2.8 大腸桿菌ΔfliC自溶速率

自溶試驗(yàn)結(jié)果(圖10)表明，在150 min后，野生型HMS174與ΔfliC420s相比，ΔfliC420s自溶速率快于野生型HMS174(**P<0.01，***P<0.001)。

**為P<0.01；***為P<0.001。

2.9 大腸桿菌ΔfliC pH敏感性

野生型HMS174與ΔfliC420s對(duì)pH的敏感性結(jié)果(圖11)表明，在pH值在4～8時(shí)，野生型和突變株均能生長，ΔfliC420s在pH 6時(shí)長勢劣于野生型HMS174菌株(*P<0.05)。

*為P<0.05。

2.10 大腸桿菌ΔfliC抗生素耐受性

抗生素耐受性試驗(yàn)(圖12)表明，野生型HMS174與ΔfliC420s對(duì)甲砜霉素、甲硝唑均耐受[圖12(a)和(b)]；野生型HMS174與ΔfliC420s在氨芐青霉素、鏈霉素和四環(huán)素的各個(gè)質(zhì)量濃度生長無差異[圖12(c)～(e)]；在D-環(huán)絲氨酸質(zhì)量濃度為32 μg/mL時(shí)[圖12(f)]，ΔfliC420s的生長量明顯低于野生型HMS174(***P<0.001)；在紅霉素質(zhì)量濃度為16 μg/mL時(shí)[圖12(g)]，ΔfliC420s的生長量明顯低于野生型HMS174(**P<0.01)；在諾氟沙星濃度為0.5 μg/mL時(shí)[圖12(h)]，ΔfliC420s的生長量明顯低于野生型HMS174(**P<0.01)且ΔfliC420s在此抗生素中均表現(xiàn)不耐受。

(a)甲砜霉素耐受性試驗(yàn)；(b)甲硝唑耐受性試驗(yàn)；(c)氨芐青霉素耐受性試驗(yàn)；(d)鏈霉素耐受性試驗(yàn)；(e)四環(huán)素耐受性試驗(yàn)；(f)D-環(huán)絲氨酸耐受性試驗(yàn)；(g)紅霉素耐受性試驗(yàn)；(h)諾氟沙星耐受性試驗(yàn)。

3 討論

利用Thermotargetron系統(tǒng)成功構(gòu)建大腸桿菌fliC基因失活突變株，比較突變株與野生型菌株的生長速率、運(yùn)動(dòng)能力、生物被膜形成能力、自溶速率及對(duì)pH敏感性等生物學(xué)特征，并進(jìn)一步比較兩者對(duì)抗生素的耐受性，結(jié)果表明：大腸桿菌鞭毛素編碼基因fliC失活后，ΔfliC420s相比野生型菌株，生長曲線結(jié)果顯示兩者生長速率相當(dāng)；運(yùn)動(dòng)能力檢測ΔfliC420s在半固體平板中泳動(dòng)能力顯著下降；生物被膜表型檢測表明ΔfliC420s生物被膜形成能力明顯下降。這充分證明fliC基因在大腸桿菌運(yùn)動(dòng)能力方面及生物被膜形成過程中發(fā)揮的重要作用。在大腸桿菌中研究發(fā)現(xiàn)的fliC基因以上功能[18-20]，與本研究結(jié)果一致。此外，進(jìn)一步探究fliC基因失活突變株在應(yīng)激狀態(tài)下的生物學(xué)特征，自溶試驗(yàn)結(jié)果顯示：ΔfliC420s在細(xì)菌自溶試驗(yàn)的后期溶解速率加快；兩者對(duì)pH敏感性范圍一致，但ΔfliC420s在pH 6時(shí)長勢較弱。以上結(jié)果表明了fliC基因在細(xì)菌抵抗外界壓力時(shí)的重要作用。不僅如此，在抗生素耐受性試驗(yàn)中，ΔfliC420s對(duì)D-環(huán)絲氨酸、紅霉素、諾氟沙星等3類抗生素的耐受性顯著降低，即低質(zhì)量濃度的抗生素即可抑制大腸桿菌的生長，而對(duì)甲砜霉素、甲硝唑、氨芐青霉素、鏈霉素、四環(huán)素的耐受性與野生型菌株無差異。這一發(fā)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌耐藥研究具有一定意義，其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

Thermotargetron技術(shù)是不同于目前大腸桿菌基因編輯所用的技術(shù)。它是基于嗜熱聚球藻(Thermosynechococcuselongatus)嗜熱二型內(nèi)含子TeI3c/4c建立的靶向基因失活系統(tǒng)[14]。此技術(shù)具有誘導(dǎo)條件簡單(48 ℃溫度誘導(dǎo))、快速(熱激時(shí)間短)、易控(37 ℃時(shí)打靶元件失活)和穩(wěn)定(突變株穩(wěn)定)等優(yōu)點(diǎn)[14, 21]。本試驗(yàn)也驗(yàn)證了應(yīng)用Thermotargetron系統(tǒng)構(gòu)建基因失活突變株的可靠性，對(duì)大腸桿菌的基因編輯提供了新的技術(shù)方法。在構(gòu)建突變株的過程中，突變株的篩選和鑒定尤為重要，研究除了利用打靶載體上的氯霉素抗性標(biāo)記和菌落PCR進(jìn)行篩選鑒定外，還通過DNA測序技術(shù)鑒定突變株。檢測引物在靶基因的外側(cè)，若菌落PCR擴(kuò)增條帶的分子質(zhì)量比野生型菌株的增加839 bp，則表明TeI3c/4c二型內(nèi)含子成功插入fliC基因，再將此片段進(jìn)行DNA測序鑒定，通過分析比對(duì)后成功獲得fliC基因失活突變株。獲得突變株后，突變株在無抗性培養(yǎng)基中，37 ℃連續(xù)轉(zhuǎn)接10次以便將突變株中的Thermotargetron打靶質(zhì)粒丟失且經(jīng)過連續(xù)傳代的突變株可完全恢復(fù)熱激前狀態(tài)[22]。因此，由Thermotargetron構(gòu)建的基因失活突變株可用于后續(xù)的突變株表型分析，以研究靶基因的功能。

應(yīng)用Thermotargetron系統(tǒng)構(gòu)建大腸桿菌fliC基因失活突變株，探究該突變株在應(yīng)激狀態(tài)下的生物學(xué)特征，闡明了fliC基因具有增強(qiáng)大腸桿菌對(duì)外環(huán)境抵抗力的重要作用，特別是在抗生素耐受性方面，這對(duì)該基因的研究具有重要的延伸意義，也為大腸桿菌病的預(yù)防及疫苗的研發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。