魏玲玲, 葉凱霞, 李嘉欣, 趙慶新

(鹽城師范學(xué)院 鹽城市蛋白工程技術(shù)研究中心，鹽城 224051)

擴(kuò)張蛋白(Expansin)可以削弱或斷裂植物細(xì)胞壁纖維素與半纖維素之間和半纖維素相互之間的氫鍵，從而使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)疏松得以伸展[1-3]。Expansin 蛋白超級(jí)家族包含4個(gè)家族(Expansin A、Expansin B、Expansin like A和Expansin like B)[4-6]。Cosgrove實(shí)驗(yàn)室于1992年首次采用重組法從黃瓜下胚軸細(xì)胞壁中分離到分子質(zhì)量分別為30 ku和29 ku的兩個(gè)蛋白，它們能使滅活的Ⅰ型細(xì)胞壁恢復(fù)酸生長，但對(duì)Ⅱ型細(xì)胞壁無效，這兩個(gè)蛋白都被命名為α-Expansin[3]。Cosgrove實(shí)驗(yàn)室又從玉米花粉中分離到能恢復(fù)Ⅱ型細(xì)胞壁酸生長但對(duì)I型細(xì)胞壁無效的β-expansin[7]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，植物Expansin基因普遍存在于陸生植物的各個(gè)生長器官與組織中[8-9]。在與植物關(guān)系密切的線蟲體[4]、真菌[10]和細(xì)菌[11]等生物體內(nèi)相繼發(fā)現(xiàn)Expansin類似蛋白。

Expansin對(duì)細(xì)胞壁的作用非常微妙，Expansin沒有細(xì)胞壁水解酶活性，但共同作用可提高各細(xì)胞壁多糖水解酶的活性[2-3]。在多糖糖化工藝中，擴(kuò)張蛋白可以協(xié)同纖維素酶[12]、半纖維素酶[13-14]和果膠酶[15-16]等多糖降解酶降解多糖，提高可發(fā)酵性糖類產(chǎn)量[17]；另外，醫(yī)藥領(lǐng)域和多糖降解酶聯(lián)用，可提高功能性藥物成分的提取效率[18]。枯草芽孢桿菌Expansin基因的發(fā)現(xiàn)[11]，為通過基因工程技術(shù)構(gòu)建Expansin的高效表達(dá)原核工程菌研究提供有效的備選基因。目前，枯草芽孢桿菌 Expansin 的重組表達(dá)在表達(dá)效率、活性和穩(wěn)定性等方面，還存在諸多需要改進(jìn)和提高之處。Kim等[11]在該蛋白的C-terminus 添加 6-His tag進(jìn)行原核表達(dá)，測得與纖維素酶的協(xié)同活性為 240%，但產(chǎn)量并不高。Chen 等[19]對(duì)多種細(xì)菌來源的Expansin進(jìn)行了重組表達(dá)，包括枯草芽孢桿菌Expansin，得到的重組蛋白與纖維素酶之間的協(xié)同效率為15%～42%。LIN 等[20]采用了相同的方法進(jìn)行 BsEXLX1 的重組表達(dá)，重組的BsEXLX1蛋白產(chǎn)量雖有所提高，但與纖維素酶的協(xié)同活性低于80%。葉凱霞等[21]在枯草芽孢桿菌Expansin蛋白兩端分別添加6-His tag，將表達(dá)量提高到約為 1.2 mg/mL，重組蛋白與纖維素酶、木聚糖酶和果膠酸水解酶的協(xié)同效率分別為171%、62%和230%。

為進(jìn)一步提高Expansin促進(jìn)植物細(xì)胞壁降解和多糖糖化，以構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)果膠酸裂解酶(Pectate lyase A，PelA)基因[22]構(gòu)建的融合表達(dá)載體pelA-pET28-a(+)，研究PelA-Expansin融合蛋白的表達(dá)，同時(shí)具備果膠酶的功能，為植物細(xì)胞壁降解和多糖糖化提供更好的輔助蛋白因子。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與菌株

克隆載體pMD18-T購自TaKaRa公司；表達(dá)載體pelA-pET-28a(+)為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；大腸桿菌DH5α、大腸桿菌BL21(DE3)、工程菌expansin/pMD18-T/DH5α以及expansin/pET-28a(+)/DH5α等為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑與培養(yǎng)基

各種基因工程酶與抗生素均購自寶生物工程(大連)有限公司；相關(guān)纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶和木聚糖等多糖降解酶購自美國 Sigma-Aldrich 公司；木聚糖與果膠酸購自美國 Sigma-Aldrich公司；羧甲基纖維素鈉購自國藥集團(tuán)；鎳離子金屬鏊合柱(Ni-NTA)購自Novagen公司。

LB-Amp固體培養(yǎng)基制備：LB固體培養(yǎng)基滅菌后，冷卻至65 ℃以下，加入氨芐青霉素至終質(zhì)量濃度為100 μg/mL。LB-Kan固體培養(yǎng)基：LB固體培養(yǎng)基滅菌后，冷卻至65 ℃以下，加入卡納霉素至終質(zhì)量濃度為100 μg/mL。

1.2 方法

1.2.1 基因工程菌newexpansin/pMD18T/DH5α構(gòu)建

Bacillussubtilissubsp.subtilis str.168的expansin-YoaJ 基因(No: NC_000964.3)，全長699 bp，包含N-terminus 75 bp 的信號(hào)肽。酶切位點(diǎn)分析結(jié)果顯示第77～82個(gè)堿基為NdeI酶切位點(diǎn)(CATATG)，與表達(dá)載體pelA-pET-28a(+)上需要使用的NdeI位點(diǎn)重復(fù)，需要消除。在expansin基因合成上游引物設(shè)計(jì)中消除其內(nèi)部的NdeI，同時(shí)在上游引物的5′端添加NdeI位點(diǎn)，故上游引物為BsE1 5′-CATATGGCATACGACG-ACCTGCATGAAGG-3′(5′含NdeI)，下游引物為BsE2 5′-GAATTCTTCAGGAAACTGAACATGG-3′(5′含EcoR I)。過夜培養(yǎng)天然枯草桿菌expansin基因克隆工程菌(expansin/pMD18-T/DH5α)菌株，以提取質(zhì)粒(expansin/pMD18T)作為模板，使用引物 BsE1和BsE2，PCR 合成基因newexpansin；純化后與克隆載體 pMD18-T 連接，獲得克隆質(zhì)粒newexpansin/pMD18T，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，涂布于 100 μg/mL Amp 平板上以篩選轉(zhuǎn)化子，得到newexpansin/pMD18T/DH5α克隆工程菌；提取克隆質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切鑒定，并送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。

1.2.2 新擴(kuò)張蛋白目標(biāo)工程菌newexpansin/pelA-pET-28a(+)/BL21(DE3)的構(gòu)建

培養(yǎng)newexpansin/pMD18T/DH5α，提取newexpansin/pMD18T，用限制性內(nèi)切酶NdeI和EcoR I雙酶切，得到newexpansin片段。培養(yǎng)pelA-pET-28a(+)/DH5α，提取pelA-pET-28a(+)，用限制性內(nèi)切酶NdeI和EcoR I雙酶切，得到pelA-pET-28a(+)片段；pelA-pET-28a(+)與newexpansin連接，將連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，涂布于LB-Kan平板上，挑取陽性轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行菌落PCR鑒定以及提取重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，鑒定正確，得到工程菌newexpansin/pelA-pET-28a(+)/DH5α,提取newexpansin/pelA-pET-28a(+)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，得到新擴(kuò)張蛋白的目標(biāo)工程菌newexpansin/pelA-pET-28a(+)/BL21(DE3)(縮寫為pelA-expansin/BL21)。

1.2.3 PelA-Expansin的表達(dá)與優(yōu)化

將工程菌pelA-expansin/BL21接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中(含100 μg/mL Kan)，于培養(yǎng)箱中37 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h以活化菌種。然后將已活化的菌液按1%的接種量轉(zhuǎn)接至100 mL的LB液體培養(yǎng)基中(含100 μg/mL Kan)，繼續(xù)在37 ℃、200 r/min的條件下培養(yǎng)一段時(shí)間，分別在不同條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。優(yōu)化OD600選擇0.4、0.6、0.8和1.0，以0.01 mmol/L IPTG誘導(dǎo)，15 ℃表達(dá)24 h。誘導(dǎo)劑IPTG濃度優(yōu)化選擇0.010、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6和0.8 mmol/L，在OD600為0.4時(shí)誘導(dǎo)，于15 ℃表達(dá)24 h。表達(dá)溫度優(yōu)化，誘導(dǎo)OD600為0.4時(shí)，加入0.01 mmol/L IPTG，分別于10 ℃、15 ℃和20 ℃表達(dá)24 h，于25 ℃和30 ℃表達(dá)12 h，于35 ℃和37 ℃表達(dá)6 h。表達(dá)時(shí)間優(yōu)化，菌濃OD600為0.4時(shí)，加入0.01 mmol/L的IPTG，15 ℃分別表達(dá)6、12、18、24、30、36、42和48 h。

1.2.4 PelA-Expansin融合蛋白活性的檢測

0.5 mL反應(yīng)液含 50 mmol/L 乙酸鈉(pH 5.0)、3 mg/mL羧甲基纖維素鈉、適量的纖維素酶及PelA-Expansin蛋白溶液，40 ℃反應(yīng) 12 h，加入0.5 mL的DNS試劑，100 ℃煮沸10 min，于540 nm 處檢測光吸收值[23]。配制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算反應(yīng)液中的還原糖(Reducing sugar，RS)產(chǎn)量。比較不同體系中還原糖的產(chǎn)生量。

1.2.5 PelA-Expansin融合蛋白的分離純化

將工程菌pelA-expansin/BL21于最佳表達(dá)條件進(jìn)行表達(dá)，結(jié)束后6 000 r/min離心10 min收集菌體進(jìn)行超聲破碎，將破碎液于4 ℃、10 000 r/min離心30 min取上清液，該上清液為含有融合蛋白PelA-Expansin的粗蛋白溶液。融合蛋白PelA-Expansin初步純化方法包含Ni-NTA Column制備、平衡、上樣、清洗和洗脫，參照說明書進(jìn)行，分類優(yōu)化后蛋白純化工藝中上樣、清洗和洗脫緩沖液中咪唑濃度分別為30、60和500 mmol/L。

1.2.6 SDS-PAGE

為了檢測重組菌表達(dá)的重組蛋白產(chǎn)物，采用SDS-PAGE凝膠電泳檢測，濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為35%，分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為11%，用考馬斯亮藍(lán)R250染色[24]。蛋白含量的測定參照Bradford的方法采用考馬斯亮藍(lán)G250法進(jìn)行可溶性蛋白含量測定[25]。以牛血清白蛋白(BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 newexpansin基因的定點(diǎn)突變與表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

以BsE1(包含NdeI位點(diǎn)的突變)、BsE2為引物，前期構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒expansin/pET-28a(+)為模板，PCR擴(kuò)增newexpansin基因，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，PCR所得產(chǎn)物條帶大小符合預(yù)期結(jié)果，共633 bp[圖1(a)]。待連接的表達(dá)載體質(zhì)粒newexpansin/pelA-pET-28a(+)的雙酶切見圖1(b)。

(a)M為DNA標(biāo)記; 1、2為newexpansin基因的PCR產(chǎn)物；(b)M為DNA標(biāo)記; 1為newexpansin/ pelA-pET-28a(+)對(duì)照；2、3為雙酶切newexpansin/pelA-pET-28a(+)(Nco I+Eco RⅠ)

2.2 融合蛋白PelA-Expansin的表達(dá)與優(yōu)化

在OD600為0.4，0.01 mmol/L IPTG，15 ℃和150 r/min條件下，表達(dá)24 h，融合蛋白產(chǎn)量約為3.0 mg/mL。

2.3 融合蛋白PelA-Expansin的純化

融合蛋白PelA-Expansin最佳純化條件為柱床體積為6 mL的條件下，上樣緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，30 mmol/L咪唑，pH 8.0)，用量為60 mL；清洗緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，60 mmol/L咪唑，pH 8.0)，用量為45 mL；洗脫緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，500 mmol/L咪唑，pH 8.0)，用量為30 mL。最終從1 L的菌液中分離純化得到了約225 mg融合蛋白PelA-Expansin，產(chǎn)量較前人研究有顯著提高，并且得到的融合蛋白PelA-Expansin純度高達(dá)95%[圖2(b)]，得率為75%。

(a)M為蛋白質(zhì)標(biāo)記; 1為無IPTG培養(yǎng)物的可溶性片段; 2為最佳表達(dá)條件下培養(yǎng)的可溶性片段。(b)1為培養(yǎng)基中未添加IPTG的蛋白樣本；2為純化前總蛋白樣本；3為30mmol/L咪唑緩沖液洗脫純化后蛋白；4為60 mmol/L咪唑緩沖液(1×洗脫緩沖液)洗脫純化后蛋白；5～9分別為濃度為100、200、300、400及500 mmol/L咪唑緩沖液洗脫純化后的蛋白。

2.4 融合蛋白PelA-Expansin活性檢測

反應(yīng)條件為37 ℃、pH 5.0、反應(yīng)4 h，對(duì)照組為Buffer對(duì)照及PelA-Expansin對(duì)照，反應(yīng)組為PelA-Expansin與多糖酶協(xié)同反應(yīng)組和多糖酶獨(dú)立反應(yīng)組。融合蛋白PelA-Expansin融合蛋白協(xié)同纖維素酶、木聚糖酶和果膠酶聯(lián)合降解對(duì)應(yīng)多糖，降解效率分別提高300%、150%和125%(表1)。

圖3 OD600、IPTG、溫度和時(shí)間對(duì)融合蛋白PelA-Expansin表達(dá)的影響

表1 PelA-Expansion與多糖酶的協(xié)同效應(yīng)

3 討論與結(jié)論

PelA-Expansin表達(dá)量達(dá)到3.0 mg/mL，與6His-Expansi-6His的表達(dá)水平(1.2 mg/mL)相比較，提高了1.5倍[21]。PelA-Expansin、6His-Expansin-6His和Expansin-6His蛋白表達(dá)差異是PelA-Expansin表達(dá)產(chǎn)物無包涵體蛋白，6His-Expansin-6His表達(dá)產(chǎn)物有微量包涵體，Expansin-6His表達(dá)產(chǎn)物主要為包涵體，PelA可能有利于提高蛋白的可溶性。在PelA-Expansin表達(dá)優(yōu)化的過程中發(fā)現(xiàn)，低濃度的IPTG和低溫更利于融合蛋白PelA-Expansin表達(dá)。引起這種現(xiàn)象的原因是較高IPTG濃度和溫度使得目標(biāo)蛋白表達(dá)過快，大部分目標(biāo)蛋白雖然為可溶性狀態(tài)但尚未能正確折疊，導(dǎo)致大部分上清液中的蛋白不具備活性，低濃度IPTG和低溫可能更利于蛋白的有效折疊。

PelA-Expansin與纖維素酶的協(xié)同活性達(dá)到了300%，Kim等[11]表達(dá)的Expansin與纖維素酶的協(xié)同活性為240%，PelA-Expansin與纖維素酶的協(xié)同活性較高于前人的研究水平；PelA-Expansin與果膠酶的協(xié)同性在數(shù)據(jù)上低于葉凱霞等[21]的報(bào)道水平，其原因是PelA-Expansin本身就是果膠酶和Expansin的融合蛋白，能夠降解果膠酸水解酶的底物多聚半乳糖糖醛酸。

研究結(jié)果表明，構(gòu)巢曲霉果膠酸裂解酶A融合在枯草芽孢桿菌Expansin的N端，能有效改進(jìn)其在大腸桿菌中的表達(dá)(3.0 mg/mL)，PELA-Expansin融合蛋白與纖維素酶、木聚糖酶和果膠酸水解酶等多糖降解酶之間有較好的協(xié)同作用，建立的PELA-Expansin一步純化工藝所得的目標(biāo)蛋白純度較高(約95%)，得率較高(約75%)。本研究為枯草芽孢桿菌Expansin蛋白在食品、能源、醫(yī)藥及農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域的工業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。