孫志陽，馮 光，雷靜靜，唐鋮鋮，孫晨皓，王 令，路宏朝

(陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，漢中723000)

惡性黑色素瘤(malignant melanoma)簡稱惡黑，是一種來源于黑色素細(xì)胞的惡性腫瘤[1]，主要發(fā)生于皮膚、眼睛、黏膜表面、神經(jīng)系統(tǒng)等區(qū)域。其在惡性腫瘤中發(fā)病率增長最快，年增長率約5%[2-4]。其侵襲性高，易轉(zhuǎn)移、耐藥性強(qiáng)的特點(diǎn)導(dǎo)致死亡率較高[5]。因此，深入研究黑色素瘤發(fā)生發(fā)展的具體分子機(jī)制不僅能了解腫瘤的發(fā)生機(jī)制，還為其臨床診治提供有效靶點(diǎn)。盡管越來越多的文獻(xiàn)從基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、表觀遺傳學(xué)等層面去探究腫瘤的形成機(jī)制，但黑色素瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制仍未完全揭示[6]。

SHC(Src homology 2 domain containing)家族包含SHC A、SHC B、SHC C和SHC D等4個亞家族[7]。SHC是細(xì)胞表面受體銜接蛋白，激活多種生長因子受體(如表皮生長因子受體和成纖維細(xì)胞生長因子受體)信號傳導(dǎo)途徑，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長和分化[8]。SHCBP1(SHC SH2-domain binding protein 1)是SHC A的結(jié)合蛋白[9-10]，最早發(fā)現(xiàn)在T細(xì)胞活化過程中高表達(dá)。隨著研究深入，發(fā)現(xiàn)SHCBP1在多種實體腫瘤中表達(dá)顯著增高[11-13]。目前研究表明，SHCBP1參與調(diào)控肺癌、胃癌、前列腺癌等癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移等多種生物學(xué)過程[14-15]。SHCBP1通過Smad、Wnt、AKT等信號通路發(fā)揮生物學(xué)功能，如在肺癌中表皮生長因子(EGF)誘導(dǎo)SHCBP1蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，與β-連環(huán)蛋白結(jié)合激活Wnt信號進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖。Liu等[16]、Zhou等[17]和Peng等[18]在滑膜肉瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)SHCBP1通過Smad信號通路促進(jìn)細(xì)胞遷移。但是，SHCBP1在黑色素瘤中的功能仍未見報道。

目前，在哺乳動物的研究中常采用RNA干擾、慢病毒敲除/敲入和Cas9基因編輯等技術(shù)解析基因功能。其中，慢病毒敲除技術(shù)具有將目的基因整合到宿主基因組的功能，從而實現(xiàn)長時間表達(dá)的特點(diǎn)，因而被廣泛應(yīng)用[19]。實驗前期發(fā)現(xiàn)Shcbp1基因在小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞中高表達(dá)，初步推測Shcbp1基因可能作為一種促癌基因發(fā)揮作用。為了進(jìn)一步闡明SHCBP1對黑色素瘤細(xì)胞的增殖效應(yīng)，研究以小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞為材料，采用慢病毒干擾技術(shù)構(gòu)建Shcbp1基因的干擾載體，以獲得穩(wěn)定干擾Shcbp1基因表達(dá)的小鼠B16細(xì)胞株，揭示SHCBP1對B16細(xì)胞增殖的影響，為解析黑色素瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞、HEK293T細(xì)胞(上海賽百慷公司)；MMPCs(青旗生物技術(shù)發(fā)展有限公司)；包裝質(zhì)粒psPAX2、pMD2.G、pLKO.1-TRC(淼靈生物科技有限公司)，核酸內(nèi)切酶EcoR I和AgeI(NEB公司)；嘌呤霉素(Sigma公司)；質(zhì)粒提取試劑盒(博日公司)；0.45 μm過濾器(上海生工)；1640培養(yǎng)基(康寧公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)，T4DNA連接酶(NEB公司)；Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量檢測試劑盒(AG公司)；抗鼠HRP-GAPDH、SHCBP1、p-AKT、t-AKT、p21、p53、ERK1/2、p-ERK1/2一抗(proteintech公司)；HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗(西安壯志生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 設(shè)計干擾序列

在Sigma公司(http:∥www.sigmaaldrich.com/life-science/functional-genomics-and-rnai/sirna/mission-predesigned-sirna.html)網(wǎng)站公布的shRNA庫中篩選鼠源SHCBP1兩條干擾序列、NC序列共3對短發(fā)卡RNA(shorthaiepin RNA shRNA)干擾序列，引物見表 1，由安徽通用生物公司合成。

表1 DNA寡聚核苷酸序列

1.2.2 構(gòu)建pLKO.1-SHCBP1-shRNA重組載體

pLKO.1-TRC經(jīng)AgeI和EcoR I雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳后，用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段。單鏈oligo DNA經(jīng)退火后形成雙鏈DNA，程序為95 ℃梯度降溫，每個循環(huán)降10 ℃ 5 min，降到4 ℃保存。在T4DNA連接酶作用下pLKO.1-TRC酶切產(chǎn)物與shRNA引物退火產(chǎn)物連接，過夜后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中并涂布至固體培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。隨機(jī)挑選平板上的單克隆進(jìn)行PCR鑒定，選取陽性克隆測序。

1.2.3 慢病毒包裝

將表達(dá)載體和慢病毒轉(zhuǎn)染輔助質(zhì)粒與Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑混勻，制備DNA/Lipofectamine混合物，室溫孵育20 min。將DNA/Lipofectamine復(fù)合物轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48、72 h分別收取細(xì)胞上清液，經(jīng)離心后收集病毒，-80 ℃保存。

1.2.4 慢病毒感染及穩(wěn)定表達(dá)SHCBP1-shRNA的細(xì)胞株篩選

用病毒原液感染狀態(tài)較好的B16細(xì)胞，加入感染增強(qiáng)液Polybrene，工作質(zhì)量濃度2 μg/mL。試驗設(shè)置SHCBP1干擾組(shRNA-1、shRNA-2)，無關(guān)序列組(shRNA-NC)，未感染病毒的細(xì)胞作為空白對照。感染24 h后更換新鮮培養(yǎng)基。感染2 d后，用含2 μg/mL嘌呤霉素(Puro)連續(xù)篩選7 d。擴(kuò)大培養(yǎng)陽性細(xì)胞用于后續(xù)試驗。

1.2.5 實時熒光定量PCR檢測

利用RNAiso Plus 法(按照說明書)分別提取細(xì)胞株的總RNA。再按照Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒說明書，將 RNA 逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA。用實時定量 PCR 儀運(yùn)行如下程序進(jìn)行RT-PCR：94 ℃ 預(yù)變性10 min；95 ℃ 變性15 s，60 ℃ 退火30 s，40個循環(huán)(定量引物見表 2)?；虻南鄬Ρ磉_(dá)水平以 β-肌動蛋白作為內(nèi)參對照，計算按照 2-ΔΔCt法。

表2 PCR引物信息

1.2.6 CCK-8檢測細(xì)胞增殖

將篩選的細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔2 000個細(xì)胞。設(shè)置5個重復(fù)孔和無細(xì)胞培養(yǎng)基對照。分別培養(yǎng)12、24、36、48 h后，每孔加入100 μL CCK-8工作液，37 ℃培養(yǎng)箱孵育1 h后測定A450 nm吸光度值，重復(fù)3次取平均值。

1.2.7 EDU摻入試驗

待細(xì)胞匯合度為70%～80%時，加入終濃度為10 μmol/L的EDU工作液繼續(xù)培養(yǎng)2 h。棄去培養(yǎng)液。4%多聚甲醛室溫固定15 min，棄去多聚甲醛，洗滌3次，通透15 min。加入Click液避光孵育30 min，吸去Click反應(yīng)液，于熒光顯微鏡下觀察。隨機(jī)選擇10個非重疊視野, 計算EDU陽性細(xì)胞數(shù), 計算平均值。

1.2.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期

收集試驗組shRNA-1，胰酶消化后離心收集細(xì)胞，70%乙醇4 ℃固定，12 h后離心收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS清洗，PI染液避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.9 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)

RIPA裂解液裂解細(xì)胞，制備蛋白質(zhì)樣品。用BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒檢測蛋白質(zhì)濃度。制備的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE，將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉, 加入一抗孵育過夜，HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗與一抗結(jié)合，TBST洗滌，與ECL試劑反應(yīng)、曝光。利用 Image J 軟件進(jìn)行灰度分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 11.5軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示統(tǒng)計分析結(jié)果，采用t檢驗比較各組數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)差異，差異顯著(P<0.05)，差異極顯著(P<0.01)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SHCBP1蛋白在B16細(xì)胞中的本底表達(dá)

為探究SHCBP1在黑色素瘤B16細(xì)胞中的表達(dá)水平，以黑色素前體MMPCs細(xì)胞為對照組，采用Western Blot檢測SHCBP1在兩種細(xì)胞中的蛋白表達(dá)量。結(jié)果顯示，與黑色素前體MMPCs細(xì)胞相比，SHCBP1在B16細(xì)胞中的蛋白表達(dá)量約為黑色素前體細(xì)胞的2.5倍(P<0.01)，見圖1，說明SHCBP1在B16細(xì)胞中處于高水平表達(dá)。

(a)Western Blot檢測SHCBP1的蛋白表達(dá)水平；(b)Western Blot結(jié)果的灰度分析(**為P<0.01)。

2.2 重組pLK O.1-SHCBP1-shRNA載體構(gòu)建

在Sigma公司公布的shRNA庫中篩選兩條干擾序列，通過SECentral軟件與SHCBP1mRNA比對，干擾靶點(diǎn)在第6個和第7個外顯子上(圖 2)。

圖2 shRNA設(shè)計位點(diǎn)示意圖

針對pLKO.1-TRC骨架載體用EcoR I和AgeI雙酶切，經(jīng)電泳檢測發(fā)現(xiàn)大小在7 000 bp和1 900 bp左右出現(xiàn)兩個片段,見圖3(a)，酶切產(chǎn)物條帶大小在7 kb左右與理論值一致。

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后，挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，在264 bp出現(xiàn)條帶與預(yù)期的大小相一致，見圖3(b)，說明已將ShRNA片段插入pLKO.1骨架載體中。挑取陽性菌落，搖菌提取質(zhì)粒測序，測序結(jié)果與目的片段一致，見圖3(c)，證明成功構(gòu)建NC和SHCBP1慢病毒干擾載體，見圖3(d)。

(a)Age I and EcoR I 雙酶切鑒定(M：Marker DL8000，1：pLKO.1 載體)；(b)菌落PCR鑒定(1～8：菌落PCR陽性結(jié)果，9：菌落PCR陰性對照，M：Marker DL2000)；(c)測序結(jié)果；(d)重組質(zhì)粒圖譜。

2.3 穩(wěn)定干擾Shcbp1細(xì)胞株的建立及干擾效率分析

待細(xì)胞生長密度到70%時，用攜帶shRNA-NC、shRNA-1和shRNA-2序列的慢病毒侵染B16細(xì)胞，細(xì)胞生長狀態(tài)良好，加入puro進(jìn)行篩選。收集穩(wěn)定干擾shRNA-NC、shRNA-1和shRNA-2的B16細(xì)胞，采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測Shcbp1干擾效率，與NC組相比，兩個干擾序列均能顯著下調(diào)Shcbp1的mRNA表達(dá)水平(P<0.01,n=3)，shRNA-1和shRNA-2的干擾效率分別達(dá)到90.2%、87.5%,見圖4(a)。Western Blot檢測SHCBP1蛋白表達(dá)顯示出相似的結(jié)果，見圖4(b)，通過對蛋白結(jié)果進(jìn)行灰度分析，計算干擾效率分別是97%和84%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,n=3)，見圖4(c)所示，由于shRNA-1干擾效率高于shRNA-2，后續(xù)實驗以shRNA-1為實驗材料。綜上結(jié)果，采用慢病毒包裝技術(shù)，能夠獲得穩(wěn)定干擾SHCBP1基因的B16細(xì)胞株。

(a)B16細(xì)胞中Shcbp1的mRNA水平表達(dá)；(b)B16細(xì)胞中SHCBP1的蛋白水平表達(dá)；(c)Western Blot結(jié)果的灰度分析。** 為P<0.01。

2.4 SHCBP1低表達(dá)對B16細(xì)胞增殖的影響

為探究SHCBP1對黑色素瘤B16細(xì)胞增殖的影響，選取shRNA-1為實驗對象，通過形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)干擾Shcbp1后細(xì)胞增殖明顯受到抑制,見圖5(a)。為進(jìn)一步了解細(xì)胞增殖期分布比例，用CCK-8法檢測干擾組細(xì)胞的增殖能力，發(fā)現(xiàn)SHCBP1的表達(dá)降低可以顯著抑制B16細(xì)胞增殖，檢測OD值在培養(yǎng)12 h(0.43±0.06)、24 h(0.48±0.045)、36 h(0.53±0.06)和48 h(0.99±0.1)都顯著抑制細(xì)胞增殖(P<0.05,n=3)，見圖5(b)。EDU檢測細(xì)胞增殖期細(xì)胞比率，與shRNA-NC相比，干擾SHCBP1的表達(dá)后B16增殖期的細(xì)胞明顯減少，見圖5(c)。細(xì)胞流式術(shù)也獲得相似的結(jié)果，B16細(xì)胞周期進(jìn)程明顯受到阻礙，見圖5(d)，與對照組相比，阻滯在G1期(45.3%±3.2%)細(xì)胞比例顯著增多(P<0.05,n=3)，而S期(13.8%±2%)細(xì)胞顯著減少(P<0.05,n=3)。結(jié)果說明，SHCBP1在黑色素瘤細(xì)胞中具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的功能，提示其在B16細(xì)胞中具有癌基因的潛力。

(a)顯微鏡10×觀察圖；(b)B16細(xì)胞的CCK-8細(xì)胞增殖測定；(c)EDU檢測細(xì)胞增殖；(d)EDU陽性細(xì)胞量化圖；(e)B16細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞周期測定。*為P<0.05，**為P<0.01。

2.5 SHCBP1 通過ERK1/2信號通路調(diào)節(jié)細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)變

為探究SHCBP1促進(jìn)B16細(xì)胞增殖的具體分子機(jī)制，收集穩(wěn)定干擾SHCBP1基因的B16細(xì)胞，用Western Blot檢測細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白變化,見圖6(a)。與對照相比，在干擾SHCBP1后細(xì)胞周期抑制因子P21蛋白明顯上調(diào)2倍多(P<0.01,n=3)，而轉(zhuǎn)錄因子P53并無明顯變化，見圖6(b)，推測SHCBP1通過抑制P21蛋白表達(dá)從而促進(jìn)細(xì)胞G1期到S期的轉(zhuǎn)變。

(a)Western Blot檢測SHCBP1、phosopho-ERK, phosopho-AKT、P21、P53的蛋白水平表達(dá)；(b)Western Blot結(jié)果的灰度分析(** 為P<0.01)。

利用Western Blot技術(shù)檢測SHCBP1的低水平表達(dá)對MAPK和AKT信號通路的影響。結(jié)果顯示：與shRNA-NC組相比，試驗組中AKT的磷酸化水平無明顯變化，而ERK1/2的磷酸化水平顯著降低，差異顯著(P<0.01,n=3)，見圖6(a)和(b)。這表明SHCBP1可能通過ERK信號通路影響B(tài)16細(xì)胞增殖效應(yīng)。

3 討論

黑色素瘤的增殖涉及多種信號通路，如余揚(yáng)[20]在人惡性黑素瘤A375細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)JAK2信號通路介導(dǎo)自噬和凋亡。此外Tang等[21]發(fā)現(xiàn)EGFL7沉默使Notch信號通路失活增強(qiáng)人皮膚黑色素瘤的細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞增殖。lncRNA MIAT表達(dá)調(diào)控PI3K/AKT信號通路抑制黑色素瘤的遷移和侵襲[22]。因此，充分認(rèn)識黑色素瘤的發(fā)病機(jī)制，鑒定更多可用的生物標(biāo)志物和新的治療靶標(biāo)是十分必要的。

慢病毒干擾技術(shù)能夠高效、特異地沉默基因的表達(dá)，該技術(shù)已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，Sang等[23]在骨肉瘤細(xì)胞中利用慢病毒技術(shù)將CTHRC基因干擾，干擾效率達(dá)到86%。Ye等[24]在乳腺癌細(xì)胞中利用慢病毒技術(shù)將CEP55基因干擾，解析其與增殖相關(guān)的功能。本研究采用慢病毒干擾技術(shù)，獲得穩(wěn)定敲低Shcbp1基因的B16細(xì)胞系，在蛋白水平SHCBP1的干擾效率達(dá)到90%。

SHCBP1是SHC蛋白結(jié)合蛋白，在黑色素瘤B16細(xì)胞中高表達(dá)，并且與轉(zhuǎn)移潛能和預(yù)后不良有關(guān)。SHCBP1通過激活NF-κB信號通路促進(jìn)膠質(zhì)瘤的遷移和侵襲[25]。最新研究發(fā)現(xiàn)SHCBP1通過激活Wnt途徑促進(jìn)順鉑藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[26-27]。本研究構(gòu)建Shcbp1兩個干擾載體shRNA-1、shRNA-2，且shRNA-1比shRNA-2干擾效率高，后續(xù)試驗以shRNA-1作為試驗材料。結(jié)果顯示SHCBP1通過促進(jìn)細(xì)胞周期G1到S期轉(zhuǎn)變，而促進(jìn)B16細(xì)胞增殖。細(xì)胞增殖主要受細(xì)胞周期檢驗點(diǎn)控制，細(xì)胞周期檢驗點(diǎn)是對基因組穩(wěn)定性作出響應(yīng)的控制點(diǎn)。P53是一種十分重要的腫瘤抑制因子，在許多類型的腫瘤中有突變，P53能激活依賴性激酶抑制因子P21的轉(zhuǎn)錄，而P21又是CDK4、CDK1等的抑制因子[28]。通過這種抑制作用，P53-P21參與了G1/S和G2/M檢驗點(diǎn)的調(diào)控[29]。研究發(fā)現(xiàn)，SHCBP1通過抑制P21蛋白的表達(dá)，促進(jìn)B16細(xì)胞G1到S期的轉(zhuǎn)變，但與P53的表達(dá)無關(guān)。

絲氨酸/蘇氨酸激酶 AKT(又稱作蛋白激酶B或PKB)作為一種原癌基因，已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)界主要的關(guān)注熱點(diǎn)，這是因為它參與調(diào)控細(xì)胞的多種功能(包括代謝、生長、增殖、存活、轉(zhuǎn)錄以及蛋白質(zhì)合成)[30]。MAPK是一種胞外信號調(diào)節(jié)激酶，其參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)包括：胞外信號調(diào)節(jié)激酶ERK，p38促分裂原活化的蛋白激酶，c-Jun氨基末端激酶。其中ERK亞族主要包括ERK1和ERK2，在真核細(xì)胞中，ERK參與多達(dá)十幾條的信號通路，參與細(xì)胞生長、分化、增殖、凋亡的過程[31]。研究表明，ERK1和ERK2主要參與多種腫瘤細(xì)胞的增殖過程。Wang等[32]在結(jié)腸癌研究中發(fā)現(xiàn)AKT信號通路抑制P21加速細(xì)胞周期進(jìn)程。同時，ERK1/ERK2信號也通過影響P21的轉(zhuǎn)錄活性使細(xì)胞周期進(jìn)程停滯。研究發(fā)現(xiàn)Shcbp1干擾后t-AKT和p-AKT蛋白均無變化，說明Shcbp1沒有通過AKT信號通路發(fā)揮促增殖作用。但是，SHCBP1干擾后ERK1/2的磷酸化水平顯著降低，說明在B16細(xì)胞中SHCBP1通過ERK信號通路抑制P21的轉(zhuǎn)錄，從而加速細(xì)胞從G1到S期進(jìn)程。