魏征 王艷春 李歡 侯留法 崔偉鋒 張俊萍

（河南省中醫(yī)藥研究院，鄭州 450004）

肺癌是目前是病死率最高的癌癥之一，肺癌在癌癥新發(fā)病例和死亡病例中均占據(jù)第一位［1］。腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是制約肺癌術(shù)后生存率提高的主要因素，因此尋找和研發(fā)抑制肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的抗腫瘤藥物顯得非常重要［2］。腫瘤細胞產(chǎn)生能量的方式比較特別，健康細胞依靠線粒體氧化糖類分子釋放出大量能量，而大多數(shù)腫瘤細胞則通過產(chǎn)能率相對較低的糖酵解作用為自身供能，這就是Warburg效應(yīng)［3］。同樣在肺癌之中，Warburg效應(yīng)為其轉(zhuǎn)移提供能量基礎(chǔ)，而miR-143-3p的表達可以抑制Warburg效應(yīng)，從而阻礙肺癌細胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移。己糖激酶2（hexokinase 2，HK2）是催化己糖使之磷酸化，糖酵解途徑的第一個酶，也是Warburg效應(yīng)的限速酶，HK2促進腫瘤細胞的增殖，抑制細胞凋亡，促進細胞侵襲和轉(zhuǎn)移，對于快速生長的腫瘤代謝行為來說是至關(guān)重要的［4］。前期研究發(fā)現(xiàn)，健脾化瘀解毒方（Jianpi Huayu Jiedu recipe medicated serum，JHJRMS）處理非小細胞肺癌A549細胞株，可抑制其增殖和侵襲［5］。健脾化瘀解毒方如何調(diào)控miR-143-3p抑制Warburg效應(yīng)從而抑制肺癌侵襲轉(zhuǎn)移尚不清楚。本研究擬進一步闡明健脾化瘀解毒方通過調(diào)控肺癌細胞能量代謝抑制肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制，為健脾化瘀解毒方的臨床運用提供實驗依據(jù)，也為肺癌的臨床治療提供新的思路和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料為了保證試驗藥效的一致性，藥物來源使用配方顆粒劑，確保指紋圖譜的一致性。健脾化瘀解毒方配伍為生黃芪30 g（批號：1019012）、茯苓15 g（批號：1011882）、白術(shù)15 g（批號：1011542）、石見穿15 g（1017422）、半枝蓮30 g（批號：0126832）、夏枯草30 g（批號：1025232）、全蝎3 g（批號：1013452）、天龍3 g（批號：6117692）、三七粉3 g（批號：7050862），均購自廣東一方制藥有限公司。健康SPF級大耳白兔購自河南省實驗動物中心，許可證號：SCXK（豫）2015-0004。動物實驗經(jīng)河南省中醫(yī)藥研究院倫理委員會批準(zhǔn)（HNZYYYJY2018-0010）。人肺癌細胞株A549購自中國科學(xué)院上海細胞庫。RPMI1640培養(yǎng)基（Hyclone公司）；胰蛋白酶消化液（上海碧云天公司）；胎牛血清（Gibco公司）；反轉(zhuǎn)錄酶（TaKaRa公司）；Mix混合酶（羅氏公司）；HK2、E-cadherin、MMP-2、MMP-9抗體、β-actin抗體、HRP-標(biāo)記的二抗（Cell signaling公司）；乳酸檢測試劑盒（Abcam公司）。SERIES 8000 WJ型恒溫培養(yǎng)箱（Thermo公司）；倒置熒光顯微鏡（Olympus公司）；PCR儀（Roch公司）；Mini X25型垂直電泳儀、Universar HoodⅢ蛋白凝膠分析系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)人肺癌A549細胞用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)在恒溫培養(yǎng)箱中（CO2含量為5%，溫度為37℃）。使用對數(shù)生長期細胞，用胰蛋白酶消化，并重懸成單細胞懸液備用。

1.2.2 含藥血清的制備將配方顆粒劑生黃芪30 g、茯苓15 g、白術(shù)15 g、半枝蓮30 g、石見穿15 g、夏枯草30 g、全蝎3 g、天龍3 g、三七粉3 g換算成等效生藥量配伍比例后生理鹽水溶解，生藥濃度為6 g/ml，待用。取SPF級大耳白兔12只，實驗前禁食12 h，根據(jù)“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表”計算出大耳兔的灌胃劑量，取8只給予健脾化瘀解毒方藥30 g/（kg·d）劑量灌胃。對照組4只給予相同劑量的生理鹽水，1次/d，連續(xù)灌胃1周。于末次用藥后1 h，無菌條件下心臟采血，分離血清（其中包括含藥血清和對應(yīng)的對照血清），56℃、30 min下補體滅活，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)前期研究數(shù)據(jù)：JHJRMS對A549細胞24 h的IC50=6.5% JHJRMS，后期實驗采用濃度分組：低劑量組（含2%JHJRMS）、中劑量組（含4%JHJRMS）、高劑量組（含8%JHJRMS）和對照組（含8%對照組無藥兔血清）以便于后期深入研究（注：低劑量組和中劑量組分別補充不含藥血清6%和4%使最終每組的血清總含量一致，下同）。

1.2.3 HK2與肺癌患者預(yù)后生信分析選擇TCGA數(shù)據(jù)庫和GEPIA數(shù)據(jù)庫，登錄網(wǎng)站。從單基因分析方法進行研究，單基因選擇：HK2。Survival Plots研究設(shè)置如下篩選標(biāo)準(zhǔn)：Gene=HK2，Methods=Overall Survival，Group Cutoff=Quartile，Hazards Ratio（HR）=No，95% Confidence Interval=Yes，Axis Units=Days，Datasets Selection（Cancer name）=LUAD。按照上述條件導(dǎo)出生存曲線圖進行分析。

1.2.4 劃痕實驗檢測JHJRMS對肺癌細胞侵襲遷移能力的影響先用Marker筆在6孔板背后，用直尺比著，均勻劃橫線，大約每隔0.5~1 cm 1道，橫穿過孔。每孔至少穿過5條線。在孔中加入約5×105個細胞，掌握為過夜能鋪滿。第2天用槍頭比著直尺，盡量垂直于背后的橫線劃痕，槍頭要垂直，不能傾斜。用PBS洗細胞3次，去除劃下的細胞，加入無血清培養(yǎng)基。放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)，拍照。

1.2.5 RT-PCR檢測JHJRMS對miR-143-3p表達的影響正常培養(yǎng)人肺癌A549細胞，消化細胞均勻接種于6孔板中，孵育12 h后。用含不同濃度JHJRMS（2%、4%和8%JHJRMS）的RPMI1640處理，對照組加入含8%對照組無藥血清的培養(yǎng)基。繼續(xù)孵育24 h后，提取RAN，運用RT-PCR檢測不同組織中miR-143-3p的表情況。miR-143-3p的引物序列為F：5'-GGGGTGAGATGAAGCACTG-3'，R：5'-CAGTGCGT?GTCGTGGAGT-3'；U6引物序列為：F：5'-GCTTCG?GCAGCACATATACTAA-3'，R：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'，45個循環(huán)。對照組表達量標(biāo)準(zhǔn)化為1，取3次實驗均數(shù)進行統(tǒng)計分析并繪制相對RNA表達量圖。

1.2.6 Western blot檢測JHJRMS對肺癌細胞中HK2蛋白表達的影響正常培養(yǎng)細胞，消化后將A549肺癌細胞均勻接種于6孔培養(yǎng)皿中，用含不同濃度JHJRMS（2%、4%和8%JHJRMS）的RPMI1640處理，對照組加入含8%對照組無藥血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。分別提取每組處理過的細胞總蛋白質(zhì)，然后用SDS-PAGE在120 V恒定電壓下分離90 min。然后，將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，分別用抗體（HK2、E-cadherin、MMP-2、MMP-9和β-actin）進行孵育后，用對應(yīng)的二抗孵育，最后用凝膠成像分析系統(tǒng)檢測蛋白質(zhì)條帶。

1.2.7 乳酸生成速率測定用含不同濃度JHJRMS（2%、4%和8%JHJRMS）的RPMI1640處理肺癌細胞24 h后，分別吸取每組細胞上清待測。標(biāo)準(zhǔn)液的稀釋：將100 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液用蒸餾水稀釋為10、5、2.5、1.25、0.625、0 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。將反應(yīng)混合物添加到樣品和標(biāo)準(zhǔn)孔中，37℃孵育30 min，用酶標(biāo)儀分析（波長450 nm）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理所有數(shù)據(jù)使用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行分析。所有數(shù)據(jù)均表示為±s，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，每個實驗重復(fù)至少3次。

2 結(jié)果

2.1 HK2與肺癌患者預(yù)后之間的相關(guān)性為了明確HK2在肺癌預(yù)后中的關(guān)系，利用TCGA和GEPIA數(shù)據(jù)庫調(diào)取肺癌患者信息進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KH2在肺癌組織中的表達略高于正常肺組織，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），在肺癌不同分期中的表達也無明顯差異（P>0.05）。HK2在生存率高的患者中多數(shù)低表達（P<0.01）。這提示HK2可能是一個不良預(yù)后的生物標(biāo)志物之一，抑制其表達可能會提高肺癌患者的生存率，如圖1所示。

圖1 HK2與肺癌預(yù)后之間的相關(guān)性圖表Fig.1 Correlation chart between HK2 and lung cancer prognosis

2.2 JHJRMS對肺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響為了探明JHJRMS對肺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，劃痕實驗用來檢測JHJRMS抑制肺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，JHJRMS處理后，肺癌細胞的傷口愈合速度明顯降低，并且呈一定的濃度依賴性，如圖2所示。

圖2 傷口愈合實驗照片F(xiàn)ig.2 Pictures of wound healing experiments

2.3 JHJRMS對肺癌細胞中HK2蛋白以及侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達的影響為了明確健脾化瘀解毒方對HK2蛋白表達的影響和再次驗證JHJRMS對于肺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響，用不同濃度的JHJRMS處理肺癌細胞，提取各組細胞的總蛋白進行Western blot檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，JHJRMS可顯著降低肺癌細胞中HK2的表達水平。侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白N-cadherin、MMP-2和MMP-9等顯著降低（P<0.001），如圖3所示。

圖3 侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達的檢測結(jié)果Fig.3 Results of invasion and metastasis related protein expression

2.4 JHJRMS可顯著增強miR-143-3p在肺癌細胞中的表達同時降低乳酸的生成為了進一步明確JHJRMS對miR-143-3p的表達影響，用不同濃度的JHJRMS對肺癌細胞進行處理，提取各組細胞的RNA進行PCR檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，JHJRMS可以明顯促進肺癌細胞中miR-143-3p的表達（P<0.01），如圖4A所示，同時檢測各組細胞的乳酸生成水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)JHJRMS可以明顯抑制肺癌細胞的乳酸生成（P<0.05），如圖4A所示。

圖4 JHJRMS對肺癌細胞中miR-143-3p表達和乳酸生成的影響Fig.4 Effect of JHJRMS on miR-143-3p expression and lactate production in lung cancer cells

2.5 miR-143-3p靶向調(diào)控HK2蛋白的有效結(jié)合位點及相關(guān)評分運用相關(guān)軟件（TargetScan，miRBase）預(yù)測miR-143-3p的靶標(biāo)蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-143-3p和HK2蛋白的mRNA存在多處互補鏈（如圖5），miR-143-3p很可能靶向調(diào)控HK2蛋白的表達。

圖5 miR-143-3p靶向調(diào)控HK2蛋白的有效結(jié)合位點及相關(guān)評分Fig.5 miR-143-3p targets and regulates effective binding site and related scores of HK2 protein

3 討論

肺癌是全世界范圍內(nèi)病死率最高的癌癥，占癌癥死亡人數(shù)的21%。傳統(tǒng)中醫(yī)（traditional Chinese medicine，TCM）雖無肺癌之名，但其在肺癌臨床治療方面接受度越來越高。健脾化瘀解毒方源于中醫(yī)治療腫瘤的“扶正祛邪”法則，作為國家中醫(yī)藥管理局重點?？瞥Ｓ迷簝?nèi)制劑，前期臨床研究取得了良好的臨床療效［6］，前期課題組體外實驗證實健脾化瘀解毒方可抑制肺癌細胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移。多項國內(nèi)外研究表明，中醫(yī)藥可以通過調(diào)控miRNA的表達水平，抑制肺癌的發(fā)生發(fā)展［7］。miR-143-3p在多種腫瘤中均起到抑癌作用［8-10］，通過調(diào)控Warburg效應(yīng)抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但其中的具體作用機制尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)并證實了miR-143-3p抑制肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的靶蛋白HK2。而HK2是糖酵解途徑的第一個酶，也是Warburg效應(yīng)的限速酶，參與Warburg效應(yīng)［11］。HK2對于快速生長的腫瘤代謝行為至關(guān)重要，可以促進腫瘤細胞的增殖，抑制細胞凋亡，促進細胞侵襲和轉(zhuǎn)移［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，HK2是miR-143-3p的靶標(biāo)蛋白之一，鑒于JHJRMS可以促進miR-143-3p的表達豐度，而miR-143-3p可以負向調(diào)節(jié)HK2的表達。推測JHJRMS是否可以通過此途徑來降低HK2蛋白的表達從而抑制腫瘤的Warburg效應(yīng)呢？本研究首先分析了HK2與肺癌患者的預(yù)后關(guān)系，從側(cè)面觀察HK2在腫瘤代謝過程中的關(guān)鍵作用。經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)HK2與肺癌患者的預(yù)后密切相關(guān)，低表達HK2的肺癌患者群組擁有更長的生存期限，這說明HK2在肺癌發(fā)展中的關(guān)鍵作用，很可能是預(yù)測肺癌患者預(yù)后的重要生物學(xué)標(biāo)志［13］。傷口愈合實驗進一步發(fā)現(xiàn)，JHJRMS可明顯降低肺癌細胞的傷口愈合能力，抑制肺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。這說明JHJRMS對肺癌侵襲轉(zhuǎn)移能力具有明顯的抑制作用。因此推測JHJRMS是否可以通過調(diào)控miR-143-3p直接作用其靶蛋白HK2的表達，從而抑制肺癌細胞的Warburg效應(yīng)來達到抑制肺癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移呢？為了明確miR-143-3p和HK2在其中的作用，進一步檢測了miR-143-3p和HK2的表達情況。運用RT-PCR檢測JHJRMS對肺癌細胞中miR-143-3p表達的影響，結(jié)果顯示，隨著JHJRMS的加入，肺癌細胞中的miR-143-3p表達水平顯著升高，說明JHJRMS可以增加miR-143-3p的表達。為了尋找miR-143-3p的靶標(biāo)蛋白，利用TargetScan和miRBase兩個網(wǎng)站對其結(jié)合的潛在靶標(biāo)蛋白進行了預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，調(diào)控Warburg效應(yīng)的HK2蛋白的mRNA與miR-143-3p有多個互補位點，說明能夠有效靶向性調(diào)節(jié)HK2蛋白。為了證實上述調(diào)控關(guān)系，進行Western blot實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，JHJRMS可以明顯抑制HK2蛋白的表達，同時抑制肺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白N-cadherin和MMPs的表達。這也就是說，JHJRMS很可能是通過調(diào)控肺癌細胞中miR-143-3p的水平，抑制HK2蛋白的表達，從而抑制肺癌細胞的糖酵解過程進而抑制肺癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。

綜上所述，本研究通過一系列實驗證實了miR-143-3p的靶蛋白HK2和肺癌患者預(yù)后之間的關(guān)系，證實了JHJRMS可以在體外抑制肺癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移，其機制可能是通過上調(diào)肺癌細胞中miR-143-3p進而抑制其靶蛋白HK2的表達，抑制細胞的Warburg效應(yīng)，實現(xiàn)其抑制侵襲轉(zhuǎn)移的功能。該研究將為健脾化瘀解毒方的臨床運用提供有力的實驗依據(jù)，為抗肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的中藥開發(fā)奠定一定基礎(chǔ)。