楊雷 伍搏宇 熊輝齊 新宇 簡功輝 楊少鋒 聶穎 馬露

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長沙 410208）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種以關(guān)節(jié)破壞、骨質(zhì)增生和關(guān)節(jié)軟骨退行性病變?yōu)樘卣鞯穆约膊?。目前機制尚不清楚，多種因素均可導(dǎo)致OA［1-3］。既往認為OA是一種“磨損”疾病，而目前卻認為OA是一種免疫相關(guān)疾病，免疫復(fù)合物介導(dǎo)的補體激活、破骨細胞激活以及細胞因子平衡失調(diào)在OA病情進展中處于重要地位，備受關(guān)注［4-5］。早期OA患者影像學(xué)改變并不明顯，而滑膜炎卻是所有關(guān)節(jié)炎最早出現(xiàn)的共有特征［6］?；そM織作為OA免疫系統(tǒng)的損傷對象，是持續(xù)性關(guān)節(jié)退行性變的主要驅(qū)動因素，尤其免疫細胞浸潤，包括漿細胞、M2型巨噬細胞、活化樹突狀細胞等多種免疫細胞滑膜浸潤參與并介導(dǎo)了OA的自身免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)促炎細胞因子、趨化因子及蛋白酶分泌，擾亂免疫平衡進而加速軟骨和骨侵蝕，在OA發(fā)生發(fā)展、惡化過程中起重要作用［7-10］。因此，從免疫浸潤角度研究OA發(fā)病機制是針對OA早期治療、防止惡化的先決條件，可為OA精準靶向免疫治療提供新途徑。

生物信息學(xué)是分子生物學(xué)和信息技術(shù)的新興交叉學(xué)科，可揭示疾病分子機制?；蛐酒鳛橐环N新興技術(shù)，已被用于生物信息的高效、大規(guī)模獲取，可廣泛收集疾病表達譜數(shù)據(jù)，尤其對多種免疫細胞間的動態(tài)調(diào)節(jié)研究具有指導(dǎo)作用。本文采用生物信息學(xué)工具對通用基因芯片數(shù)據(jù)庫（gene expression omnibus，GEO）中OA患者和正常人群滑膜數(shù)據(jù)進行分析，通過CIBERSORT反卷積算法分析OA滑膜中的免疫浸潤情況，并根據(jù)差異的免疫浸潤基因預(yù)測相關(guān)免疫調(diào)節(jié)中藥，為OA免疫機制研究和免疫調(diào)節(jié)相關(guān)中藥篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1 芯片數(shù)據(jù)采用GEO（www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）數(shù)據(jù)庫搜索OA滑膜基因芯片數(shù)據(jù)，篩選GSE55235數(shù)據(jù)，由Thomas H?upl提供（包含10個正常人群滑膜組織、10個OA患者滑膜組織），設(shè)正?；閷φ战M，OA患者滑膜數(shù)據(jù)為實驗組，根據(jù)GPL96-57554（［HG-U133A］Affymetrix Human Genome U133A Array）平臺將探針轉(zhuǎn)換為基因名稱。

1.2 差異表達基因獲取通過R語言程序“l(fā)imma”安裝包對基因探針進行兩樣本t檢驗，并根據(jù)篩選條件|log2FC|≥1和校正P<0.05進行差異基因分析，其中l(wèi)og2FC<0代表基因表達下調(diào)，log2FC>0代表基因表達上調(diào)。

1.3 核心基因獲取和注釋將兩組差異基因通過在線平臺STRING（www.string-db.org/cgi/input.pl）獲取蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)模型，并將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件，采用Cytoscape插件工具cyto Hubba中的MCC方法識別重要基因，將重要基因進行可視化，并列出排名前10的作為核心基因。采用R語言cluster Profiler對差異基因進行基因本體論（genetic ontology，GO）分析與京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，并探究其潛在生物學(xué)過程（biological process，BP）、細胞成分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）及重要信號通路。

1.4 免疫細胞浸潤矩陣獲取采用R語言程序并鏈接CIBERSORT反卷積算法進行活化記憶性CD4 T細胞、漿細胞、活化NK細胞、調(diào)節(jié)性T細胞等22種免疫細胞轉(zhuǎn)錄特征的模擬計算［11］。為了結(jié)果準確，設(shè)定模擬次數(shù)為1 000次，采用Kruskal-Wallis秩和檢驗對P<0.05的數(shù)據(jù)進行后續(xù)分析。

1.5 免疫細胞相關(guān)性和差異分析為分析各類免疫細胞相關(guān)性，對CIBERSORT反卷積算法以P<0.05基礎(chǔ)上篩選的可信樣本數(shù)據(jù)中進行不同免疫細胞間Pearson相關(guān)系數(shù)計算，并采用秩和檢驗比較OA組與對照組差異。

1.6 OA免疫浸潤過程潛在中藥預(yù)測將兩組差異的核心靶基因和GO富集與免疫相關(guān)BP導(dǎo)入在線平臺（www.coremine.com/medical/），篩選具有潛在免疫調(diào)節(jié)作用的藥物，采用秩和檢驗，以P<0.01表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，并對中藥進行功效、歸經(jīng)統(tǒng)計。

1.7 主要觀察指標通過GEO數(shù)據(jù)庫獲取正常人群滑膜和OA患者滑膜組織差異基因及免疫細胞浸潤分布，并進行潛在中藥預(yù)測，主要觀察指標：①正?；そM織和OA滑膜組織免疫細胞浸潤的分布差異及相關(guān)性；②正?；そM織和OA滑膜組織差異的靶基因；③OA滑膜組織免疫浸潤相關(guān)BP和可能信號通路；④挖掘調(diào)節(jié)OA滑膜組織局部免疫微環(huán)境的潛在治療中藥。

2 結(jié)果

2.1 OA患者差異表達基因結(jié)果對來自GSE55235的微陣列進行篩選，共得到10個健康志愿者和10個OA患者滑膜組織芯片，正?；そM織和OA滑膜組織差異基因共716個，其中上調(diào)基因382個，下調(diào)基因334個（圖1）。

圖1 OA滑膜組織基因芯片差異表達基因熱圖和火山圖Fig.1 Heat map and volcano map of OA synovium-related differential expression genes

2.2 核心靶基因獲取結(jié)果將716個差異表達基因?qū)隨TRING繪制PPI，并將分析結(jié)果的TSV文件導(dǎo)入Cytoscape軟件進行可視化展示（圖2），經(jīng)cyto Hubba計算列取前10位作為核心基因，分別為IL-6、CXCL8、JUN、VEGFA、IL-1β、MMP9、ITGB2、FOS、APOB、CXCL12（表1）。

表1 PPI模型中OA組和正常組差異核心靶基因Tab.1 Core differential target genes in PPI networks of OA and normal groups

圖2 OA滑膜組織差異基因PPI及核心蛋白基因模塊Fig.2 OA synovium tissue differential gene PPI networks map and Hub genes

2.3 差異基因GO和KEGG富集分析采用R軟件cluster Profiler對OA差異基因進行BP和KEGG分析，上調(diào)和下調(diào)的差異基因分別為382、334個，GO分析得到BP 374、879條，上調(diào)基因共富集到34條通路，下調(diào)基因共富集到39條通路，對比上調(diào)基因和下調(diào)基因GO和KEGG富集分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)上調(diào)基因與免疫密切相關(guān)，GO主要涉及白細胞正向調(diào)節(jié)、吞噬作用、T細胞呈遞激活等BP（圖3A）。KEGG富集的相關(guān)通路主要涉及吞噬小體、TNF信號通路、IL-17信號通路等相關(guān)信號通路（圖3B），而下調(diào)基因GO主要涉及對氧水平的反應(yīng)、對氧水平下降的反應(yīng)、節(jié)律過程等非免疫BP（圖3C），相關(guān)信號通路主要涉及毒性心肌炎相關(guān)通路、利什曼病相關(guān)信號通路等轉(zhuǎn)導(dǎo)機制（圖3D）。

圖3 OA差異基因GO及KEGG富集分析Fig.3 GO and KEGG enrichment analysis of differential genes related to OA

2.4 免疫浸潤細胞分布采用CIBERSORT反卷積法以P<0.05為篩選條件對芯片進行篩選，共得到20個可信樣本，熱圖左側(cè)10個為正常滑膜組織，右側(cè)10個為OA滑膜組，未活化的記憶CD4 T細胞和活化的肥大細胞含量在OA滑膜組織中不同程度減少，而M0型巨噬細胞、未活化的肥大細胞含量在OA滑膜中均出現(xiàn)不同程度增加（圖4A），圖4B進一步展示了22種免疫細胞在各樣本中的含量分布。

圖4 正常人群和OA患者免疫細胞浸潤分布Fig.4 Infiltration of immune-associated cells in normal and OA samples

2.5 免疫細胞相關(guān)性及差異分析未活化的CD4記憶T細胞和活化的肥大細胞（r=0.66）、未活化的樹突狀細胞和M1型巨噬細胞（r=0.54）、M1型巨噬細胞和活化的CD4記憶T細胞（r=0.49）呈正相關(guān)；而未活化的肥大細胞和活化的肥大細胞（r=-0.78）、記憶B細胞和活化的B細胞（r=-0.67）、未活化的CD4記憶T細胞和M2型巨噬細胞（r=-0.62）呈負相關(guān)（圖5A）。通過小提琴圖較為直觀地展現(xiàn)正常人群和OA患者滑膜組織免疫浸潤細胞差異，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義，漿細胞（P=0.019）、M0型巨噬細胞（P=0.038）和未活化的肥大細胞（P<0.001）在OA滑膜組織中含量較高，而未活化的CD4記憶T細胞（P<0.001）、活化的NK細胞（P=0.026）、活化的肥大細胞（P<0.001）在OA滑膜組織中均出現(xiàn)不同程度降低（圖5B）。

圖5 OA組織中免疫浸潤細胞相關(guān)性及差異小提琴圖Fig.5 Correlation analysis and violin plot of differences of immune cells in OA group

2.6 干預(yù)OA滑膜組織免疫浸潤機制的中藥挖掘通過Coremine Medical預(yù)測和挖掘潛在干預(yù)OA免疫浸潤的中藥，以P<0.01作為篩選條件，共得到123味中藥，與白細胞黏附、白細胞增殖、吞噬作用、抗原呈遞與表達、T細胞呈遞等BP及IL-6、CXCL8、JUN、VEGFA、IL-1β、MMP9等核心靶基因密切相關(guān)，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape進行可視化分析，共得到節(jié)點137個，邊226條，青風(fēng)藤、姜黃、雷公藤、藤黃等度值較高，提示與OA免疫浸潤機制密切相關(guān)，將這些中藥進行歸經(jīng)，功效分析顯示OA免疫浸潤相關(guān)藥物均歸屬肝、腎、肺經(jīng)，藥物功效以清熱類、補虛類、祛風(fēng)濕類、活血化瘀類、解表類等為主，提示以上藥物可能作為OA免疫治療的潛在候選中藥（圖6）。

圖6 OA免疫浸潤機制潛在中藥功效及雷達圖Fig.6 Potential traditional Chinese medicine efficacy map and radar map of osteoarthritis immune infiltra?tion mechanism

3 討論

滑膜組織是OA免疫系統(tǒng)的主要入侵對象，本研究將正常人群和OA患者滑膜組織差異基因進行PPI分析，篩選出10個與OA免疫相關(guān)的核心靶基因IL-6、CXCL8、JUN、VEGFA、IL-1β、MMP9、ITGβ2、FOS、APOB、CXCL12，除ITGβ2和APOB基因未見報道以外，其他均發(fā)現(xiàn)參與OA滑膜免疫浸潤過程。VEGFA可介導(dǎo)早期OA滑膜中性粒細胞、淋巴細胞、肥大細胞浸潤誘導(dǎo)血管炎癥［12］；JUN和FOS在OA滑膜中高表達，參與炎癥細胞彌散浸潤［13］；MMP9參與CD4+T細胞調(diào)控巨噬細胞浸滑膜病程；IL在OA患者滑膜組織中主要由白細胞、巨噬細胞、滑膜纖維細胞等產(chǎn)生［14］，OA患者滑液、滑膜、軟骨下骨和軟骨中均不同程度增高［15］；此外，過多IL產(chǎn)生可抑制軟骨中Ⅱ型膠原生成，誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶類產(chǎn)生，加速軟骨侵蝕［16］。本研究預(yù)測出的IL-6、IL-1β在OA進程中備受關(guān)注，已展開大量相關(guān)研究［17-18］。而趨化因子（CXCL）是一類具有化學(xué)趨化作用的細胞因子，主要由滑膜巨噬細胞產(chǎn)生，可對中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞等細胞產(chǎn)生趨化作用，且與血管炎發(fā)展密切相關(guān)，介導(dǎo)早期OA出現(xiàn)滑膜炎癥［19］。CXCL8可影響JAK-STAT、NF-κB和JNK-MAPK信號通路并增強其他促炎細胞因子表達促進細胞凋亡并抑制軟骨細胞增殖［20］；CXCL12可驅(qū)動樹突狀細胞從血液募集至發(fā)生炎癥反應(yīng)的滑膜誘導(dǎo)OA慢性炎癥［21］。本研究篩選出的大部分核心靶基因與目前OA免疫相關(guān)研究結(jié)果相符，進一步證實研究結(jié)果的可靠性。對OA滑膜組織差異基因進行GO和KEGG富集分析，結(jié)果顯示上調(diào)基因與OA免疫機制密切相關(guān)，主要涉及多種免疫細胞，進一步說明OA是由多種炎癥細胞及因子共同參與的免疫過程，存在錯綜復(fù)雜的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，而KEGG富集預(yù)測出大部分信號通路均介導(dǎo)了OA免疫過程，這些通路在誘導(dǎo)OA滑膜炎癥因子滲出、免疫細胞浸潤、補體系統(tǒng)激活、體液免疫和細胞免疫過程中均發(fā)揮重要作用［22］。

為深入研究免疫細胞在OA滑膜組織的作用，采用CIBERSORT反卷積法對兩組免疫相關(guān)差異基因進行篩選，CIBERSORT反卷積算法是基于線性支持向量回歸（SVR）的可靠機器學(xué)習(xí)方法，廣泛用于評估22種免疫細胞相對含量及動態(tài)調(diào)節(jié)過程，在噪聲、未知混合物含量和密切相關(guān)的細胞類型方面優(yōu)于其他方法。最終結(jié)果顯示漿細胞、M0型巨噬細胞和未活化的肥大細胞在OA滑膜組織中含量較高，而未活化的CD4記憶T細胞、活化的NK細胞、活化的肥大細胞在OA滑膜組織不同程度降低，以上研究結(jié)果部分得到相關(guān)基礎(chǔ)研究證實，如OA滑膜組織中肥大細胞浸潤程度較高，與OA患者結(jié)構(gòu)損傷有關(guān)，其機制可能與肥大細胞釋放大量TNF-α及IL-6等細胞因子誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，刺激滑膜增生和軟骨侵蝕［23］；記憶CD4+T細胞積累是關(guān)節(jié)局部炎癥反應(yīng)過程中的常見現(xiàn)象，可能與慢性O(shè)A形成有關(guān)［24］；調(diào)節(jié)性T細胞在OA滑膜中含量豐富，其水平與炎癥因子水平相關(guān)［25］；而滑液中過量的CD19+CD24hiC7+B細胞可加速軟骨破壞［26］；M1型巨噬細胞產(chǎn)生炎癥因子與產(chǎn)生抗炎因子的M2型巨噬細胞比例失衡是促進OA進展的關(guān)鍵機制之一，調(diào)節(jié)M2型巨噬細胞有望對延緩OA起積極治療作用［27-28］。上述文獻證據(jù)結(jié)合課題組分析結(jié)果表明巨噬細胞、漿細胞、肥大細胞等在OA中發(fā)揮重要作用，應(yīng)成為進一步研究重點。

OA屬于中醫(yī)學(xué)“痹癥”范疇，中醫(yī)對其認識較早，長時間臨床實踐顯示中藥具有良好有效性及安全性，且中藥具有多成分、多靶點、多途徑作用機制，從中藥中尋找針對OA免疫機制整體調(diào)節(jié)的藥物應(yīng)作為研究重點［29-31］。OA中醫(yī)病機屬于年老體衰，肝腎虧虛，筋骨失養(yǎng)，外感風(fēng)寒濕邪氣，痹阻脈絡(luò)，流注關(guān)節(jié)［32］，證屬“本虛標實”，以肝腎虧虛為主，風(fēng)寒濕邪為標實。本次預(yù)測藥物的歸經(jīng)和功效分析，大部分藥物歸經(jīng)多屬于肺、肝腎經(jīng)且藥物多為補虛類、祛風(fēng)濕類、活血化瘀類、解表類等，進一步說明本研究藥物預(yù)測結(jié)果符合OA中醫(yī)病機，且本研究預(yù)測藥物以藤類藥物居多，中醫(yī)學(xué)受“取類比象”思維影響，認為藤類藥物形條達，纏繞蔓延，如同人體經(jīng)絡(luò)縱橫交錯走行，具有通暢經(jīng)絡(luò)、舒通筋脈作用，善治痹證久治不愈，甚則變形之頑痹，完全符合OA病癥特點。本研究從免疫浸潤角度將OA差異基因中免疫相關(guān)BP及作用于PPI核心靶基因的中藥進行反向預(yù)測，篩選出青風(fēng)藤、姜黃、雷公藤、藤黃等中藥在免疫調(diào)節(jié)干預(yù)OA過程中處于核心地位，現(xiàn)代藥理學(xué)也證實以上藥物可通過調(diào)節(jié)免疫細胞發(fā)揮OA治療作用，如青風(fēng)藤可抑制TNF-α、IL-β、IL-6等炎癥因子產(chǎn)生，減少炎癥反應(yīng)對關(guān)節(jié)軟骨的損傷［33］。此外，青風(fēng)藤還可抑制滑膜組織血管新生和血管炎癥，減少免疫細胞浸潤對滑膜的刺激；姜黃中有效成分姜黃素具有強大的抗氧化和抗炎作用，可抑制IL-1β誘導(dǎo)的NF-κB介導(dǎo)的炎癥和細胞凋亡，保護軟骨［34］；雷公藤除抗炎、鎮(zhèn)痛、抗血管新生外，還對滑膜有免疫調(diào)節(jié)功能，抑制T細胞增殖、誘導(dǎo)T細胞凋亡、恢復(fù)Th1/Th2細胞平衡［35-36］。以上文獻支持本研究結(jié)果的可信度，也為中藥干預(yù)骨關(guān)節(jié)炎免疫機制候選中藥提供參考。

目前美國風(fēng)濕病學(xué)會（ACR）、歐洲抗風(fēng)濕聯(lián)盟（EULAR）和中國2018版《骨關(guān)節(jié)炎診療指南》均推薦針對OA治療的藥物，包括非甾體類抗炎藥（NSAIDs）、阿片類藥、糖皮質(zhì)激素、抗焦慮藥、軟骨保護藥等，促使消化道出血、腦、腎和心血管疾病、關(guān)節(jié)感染、藥物依賴性等風(fēng)險性增加，長期使用飽受爭議，治療目的主要是減輕或消除疼痛，糾正畸形，改善或恢復(fù)關(guān)節(jié)功能，但卻未對免疫系統(tǒng)進行調(diào)節(jié)，遠期效果仍不理想［37-40］。對于晚期OA患者關(guān)節(jié)軟骨缺損，組織工程學(xué)方法的自體軟骨移植修復(fù)是目前研究熱點［41］。但關(guān)節(jié)周圍組織免疫微環(huán)境引發(fā)的自身免疫排斥反應(yīng)也是組織工程材料關(guān)節(jié)植入需考慮的關(guān)鍵問題。中醫(yī)藥是中國人民幾千年來的智慧結(jié)晶，其獨特魅力受到廣泛關(guān)注［42-43］。因此，從中草藥中尋找干預(yù)OA免疫失衡的潛在中藥，對早期OA患者減緩病程具有重要意義，對于晚期OA患者關(guān)節(jié)組織工程材料的特性選擇也具有指導(dǎo)意義。

本研究依賴于GEO數(shù)據(jù)庫，是既往發(fā)布數(shù)據(jù)集的二次挖掘和分析，實驗結(jié)果可能與既往實驗結(jié)論不同，原因可能為樣本量過少導(dǎo)致數(shù)據(jù)分析偏倚。此外，CIBERSORT反卷積算法分析是基于有限的遺傳數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)可能會偏離細胞異型相互作用、疾病的誘發(fā)因素以及疾病表型的可塑性，導(dǎo)致結(jié)果不準確。雖然本研究結(jié)果得到了多數(shù)文獻研究支持，但研究結(jié)果的可靠性仍需進一步實驗驗證。