湯水粉，錢(qián)卓真，位紹紅，王麗娟

(福建省水產(chǎn)研究所，福建 廈門(mén) 361013)

硝基咪唑類藥物含有5-硝基咪唑環(huán)結(jié)構(gòu)，具有抗原蟲(chóng)和抗菌活性，可用于防治滴蟲(chóng)病、球蟲(chóng)病以及六鞭蟲(chóng)病等疾病[1-2]，深受養(yǎng)殖戶的青睞，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，硝基咪唑主要用于治療寄生蟲(chóng)的感染，導(dǎo)致該類藥物在水產(chǎn)品中殘留[3]。由于硝基咪唑及其在生物體內(nèi)的代謝產(chǎn)物具有潛在的致突變性和致癌性，如果在動(dòng)物源性食品中殘留累積，則會(huì)對(duì)食品安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅[4-5]。因此，許多國(guó)家將硝基咪唑列為違禁藥物。我國(guó)已將這類藥物列入《食用動(dòng)物禁用的獸藥及其他化合物清單(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第250號(hào))》中。歐盟于1993年、1995年和1998年分別禁止洛硝噠唑、地美硝唑和甲硝唑這3種藥物用于食用動(dòng)物；2002年美國(guó)食品與藥物管理局公布了在進(jìn)口動(dòng)物源性食品中禁止使用包括地美硝唑等硝基咪唑類藥物在內(nèi)的共11種藥物[6]；我國(guó)食品中獸藥最高殘留限量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的只能用于治療，但不得在動(dòng)物性食品中檢出的藥物就包括甲硝唑和地美硝唑[7]。

目前，國(guó)內(nèi)外用于水產(chǎn)品、獸產(chǎn)品等動(dòng)物源性食品中硝基咪唑類藥物及其代謝物的檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫法[8-9]、高效液相色譜法[10-12]、氣相色譜法[13]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等[14-15]。其中高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法因靈敏度高、選擇性和特異性好、操作簡(jiǎn)單、能夠?qū)Φ蜐舛鹊臉悠愤M(jìn)行很好的定性確認(rèn)，而被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)品中各類藥物殘留的檢測(cè)[16-17]。本研究在已有文獻(xiàn)和相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，優(yōu)化了前處理方法，采用乙酸乙酯提取、正己烷除脂，結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜高度的選擇性和抗干擾能力，建立了水產(chǎn)品中硝基咪唑類藥物及其代謝物殘留的快速檢測(cè)方法。該方法的靈敏度高，實(shí)驗(yàn)周期短，提高了工作效率。改進(jìn)后的方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，能更好地滿足水產(chǎn)品中硝基咪唑及其代謝物檢測(cè)的要求，適合于大批量樣品的檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用水產(chǎn)品均購(gòu)自當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、超市或養(yǎng)殖戶。樣品采回后取適量肌肉部分進(jìn)行均質(zhì)，所有基質(zhì)樣品于-20℃冷凍保存，待用。

硝基咪唑類藥物標(biāo)準(zhǔn)品(德國(guó)Dr.Ehrenstorfer)，純度≥98%；甲醇、乙腈、乙酸乙酯、正己烷(美國(guó)Tedia)，色譜純；無(wú)水硫酸鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，分析純；實(shí)驗(yàn)用水為Millipore Academic制備的超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

TSQ Quantum Ultra液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)；MS105電子分析天平、 ME203E/02電子分析天平(梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易有限公司)；MS3型旋渦混合器(德國(guó)IKA公司)；離心機(jī)(北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司)。

1.3 樣品前處理方法

稱取(5.00±0.05) g均質(zhì)后的樣品，置于100 mL的塑料離心管，加入5 mL磷酸二氫鈉緩沖液(pH=8.0)，渦旋混勻。再加入30 mL乙酸乙酯和3 g無(wú)水硫酸鈉，渦旋振蕩50 s，以3 500 r/min 離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)入100 mL雞心瓶。殘?jiān)尤?0 mL乙酸乙酯重復(fù)提取一次，合并提取液于100 mL雞心瓶。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于40℃水浴蒸干。準(zhǔn)確加入1.0 mL 10%甲醇水溶液，渦旋振蕩溶解殘留物，再加入1 mL乙腈飽和正己烷渦旋混合30 s，以4 000 r/min離心5 min，取下層清液，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.4 儀器分析條件

色譜柱：Hypersil Gold C18柱(100 mm × 2.1 mm，3.0 μm，美國(guó) Thermo公司)；柱溫：30℃；

流動(dòng)相：A為體積分?jǐn)?shù)0.1%的甲酸水溶液，B為甲醇；流速：0.250 mL/min。

流動(dòng)相梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution program

離子源：電噴霧離子源(ESI)，正離子模式；離子傳輸管溫度：350℃；噴霧電壓：3.0 kV；汽化溫度：200℃；鞘氣(氮?dú)?壓力：45 arb；輔助氣(氮?dú)?壓力：10 arb；碰撞氣(高純氬氣)壓力：1.5 mTorr。10種硝基咪唑類藥物的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

表 2 硝基咪唑類藥物及其代謝物的質(zhì)譜參數(shù)Tab.2 MS parameters of nitroimidazoles and their metabolites

續(xù)表2

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確稱取適量的每種硝基咪唑類藥物標(biāo)準(zhǔn)品，先用甲醇配制成濃度為1.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。再用甲醇稀釋成濃度為1.0 μg/mL硝基咪唑及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)中間液。

根據(jù)每種硝基咪唑及其代謝物的靈敏度和線性范圍，分別吸取濃度為1.0 μg/mL硝基咪唑標(biāo)準(zhǔn)中間液5.00～200 μL，配制成濃度為5.00、10.0、20.0、50.0、100、200 ng/mL系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，吸取10.0 μL進(jìn)樣分析，以各組分的峰面積(Y)和相對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 回收率與精密度

稱取(5.00±0.05)g勻漿后的樣品，分別加入一定量不同濃度的硝基咪唑類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后按同樣的樣品前處理方法進(jìn)行提取、凈化以及高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)，計(jì)算各種硝基咪唑藥物的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)方法的確定

2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)采用蠕動(dòng)泵，分別將10種硝基咪唑類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液(質(zhì)量濃度均為1 μg/mL)以10 μL/min的流速注入電噴霧離子源，在ESI正離子模式下，對(duì)10種硝基咪唑藥物的質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。選擇離子豐度最強(qiáng)的子離子作為定量離子，第二強(qiáng)的子離子作為定性離子。最后在選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)正離子模式下，再次優(yōu)化碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)。優(yōu)化后硝基咪唑類藥物及其代謝物的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2，總離子流圖見(jiàn)圖1。

2.1.2 色譜條件的優(yōu)化

硝基咪唑類藥物及其代謝物是一種中等極性化合物，已有文獻(xiàn)證實(shí)反相色譜柱更適合該類化合物的分離與檢測(cè)[18]。因此，實(shí)驗(yàn)評(píng)估了Thermo Hypersil Gold C18柱和 Agilent ZORBAX SB-C18柱的分離效果，發(fā)現(xiàn)10種硝基咪唑類藥物在兩種色譜柱上均可實(shí)現(xiàn)較好的分離。但是使用Agilent ZORBAX SB-C18柱分離時(shí)，色譜峰拖尾，而采用 Thermo Hypersil Gold C18柱作為分析柱時(shí)，基線穩(wěn)定，色譜峰拖尾較少，峰形更好。因此，實(shí)驗(yàn)采用Thermo Hypersil Gold C18色譜柱作為分析柱。

由于硝基咪唑類藥物易溶于甲醇和乙腈，微溶于水，實(shí)驗(yàn)選擇反相色譜常用的甲醇-水和乙腈-水兩種流動(dòng)相體系，并在水相中加入0.1%甲酸促進(jìn)離子化，研究其對(duì)分離效果和峰形的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用0.1%甲酸水溶液-乙腈體系作為流動(dòng)相時(shí)，10種硝基咪唑類化合物的分離效果較差，而0.1%甲酸水溶液-甲醇作為流動(dòng)相時(shí)，可以更好地提高檢測(cè)的靈敏度和分離效果，獲得理想的色譜峰。本文還研究了在0.1%甲酸水溶液中加入5.0 mmol/L乙酸銨對(duì)10種硝基咪唑類藥物分離效果的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)在流動(dòng)相中加入一定量的乙酸銨后，部分目標(biāo)物響應(yīng)強(qiáng)度下降，而且色譜峰出現(xiàn)峰展寬的現(xiàn)象。因此本實(shí)驗(yàn)選用甲酸水溶液-甲醇作為流動(dòng)相。此時(shí)目標(biāo)化合物能被較好地分離，其色譜圖見(jiàn)圖1。

綜上所述，本研究選用Thermo Hypersil Gold C18柱、0.1%甲酸水溶液-甲醇作為流動(dòng)相對(duì)硝基咪唑藥物進(jìn)行分離分析。

2.2 前處理方法的選擇

常用于提取動(dòng)物組織內(nèi)的硝基咪唑類藥物的溶劑主要有甲醇、乙腈、乙酸乙酯等[18-20]，乙腈和甲醇雖然能提取硝基咪唑及其代謝物，而且能沉淀蛋白質(zhì)，但是其也能與水混溶，會(huì)導(dǎo)致水溶性雜質(zhì)較多，給后續(xù)的凈化與分析帶來(lái)干擾，加標(biāo)回收率比較低；相比甲醇和乙腈，乙酸乙酯極性較低，在提取硝基咪唑類藥物的同時(shí)能減少水溶性雜質(zhì)的溶出；而且硝基咪唑類藥物有一定的熱敏感性，如果在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)步驟中水浴溫度過(guò)高，將導(dǎo)致目標(biāo)物的損失，因此在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)盡可能選用沸點(diǎn)較低的有機(jī)溶劑，乙酸乙酯低沸點(diǎn)的特點(diǎn)可以彌補(bǔ)在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)步驟中過(guò)高的水浴溫度或過(guò)長(zhǎng)的濃縮時(shí)間導(dǎo)致回收率偏低的缺點(diǎn)，更適合作為提取溶劑。因此實(shí)驗(yàn)首先選用乙酸乙酯進(jìn)行考察。因動(dòng)物源性食品樣品含有大量的脂肪等雜質(zhì)，提取液用正己烷脫脂。研究發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯溶劑對(duì)10種硝基咪唑類化合物的回收率可達(dá)70.0%～120%?？紤]到硝基咪唑類藥物具有酸堿兩性性質(zhì)，即在弱堿性條件下呈游離分子狀態(tài)，在弱酸性狀態(tài)下呈質(zhì)子化狀態(tài)，因此提前在樣品中加入磷酸二氫鈉緩沖液(pH=8.0)預(yù)處理，使目標(biāo)物以游離分子狀態(tài)存在，再加入乙酸乙酯進(jìn)行提取。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，加入pH=8.0的弱堿性磷酸鹽緩沖溶液時(shí)，樣品回收率在70.0%～120%范圍內(nèi)，且平行性比在中性狀態(tài)下提取的更好。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)估

由于水產(chǎn)品樣品基質(zhì)復(fù)雜，常對(duì)待測(cè)物產(chǎn)生一定的基質(zhì)效應(yīng)。因此本研究用流動(dòng)相和空白水產(chǎn)品樣品經(jīng)提取后的定容液分別繪制系列濃度的硝基咪唑標(biāo)準(zhǔn)曲線，將兩種方法配制標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較，即基質(zhì)效應(yīng)(%)=空白樣品提取液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定結(jié)果/流動(dòng)相配制標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定結(jié)果×100，以此評(píng)價(jià)樣品所產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果顯示，在樣品基質(zhì)中各種硝基咪唑類藥物的基質(zhì)效應(yīng)在86.8%～108%之間，結(jié)果見(jiàn)圖2?？梢?jiàn)，經(jīng)本方法進(jìn)行前處理后10種硝基咪唑類藥物的基質(zhì)效應(yīng)均在可接受的范圍內(nèi)。

2.4 線性關(guān)系和檢出限

在上述優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件下，測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖(圖1)。從圖中可知，在該優(yōu)化條件下，各種硝基咪唑類藥物得到了很好的分離，且未發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)色譜峰的干擾。同時(shí)對(duì)序列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，以峰面積對(duì)硝基咪唑類藥物的質(zhì)量濃度作線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線(表3)。試驗(yàn)結(jié)果表明，10種硝基咪唑類藥物線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.995 0，說(shuō)明該方法適用于硝基咪唑類藥物的定量分析。

表3 10種硝基咪唑類藥物的線性方程及相關(guān)系數(shù)Tab.3 Linear equations and correlation coefficients of ten nitroimidazoles

續(xù)表3

2.5 方法的靈敏度和回收率實(shí)驗(yàn)

由于在液質(zhì)聯(lián)用儀分析樣品的過(guò)程中，存在基質(zhì)效應(yīng)，以空白樣品進(jìn)行加標(biāo)處理后，在以信噪比(S/N)>3的前提下，求得10種硝基咪唑類藥物的檢出限為1.00 μg/kg。以不含硝基咪唑類藥物的空白樣品為研究對(duì)象，本實(shí)驗(yàn)以魚(yú)肉為例，在樣品中分別加入1.00、2.00和5.00 μg/kg三個(gè)濃度水平的硝基咪唑類標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)濃度做三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，以考察方法的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性，圖3為空白樣品和添加量為5.00 μg/kg的加標(biāo)樣總離子流圖，加標(biāo)回收率和精密度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4?？芍诓煌募訕?biāo)濃度下，樣品的回收率均在70.2%～119.0%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏均差(n=3)在13.5%以下。從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，該方法的準(zhǔn)確度和精密度滿足水產(chǎn)品中硝基咪唑類藥物殘留量檢測(cè)的要求。

表4 魚(yú)肉加標(biāo)樣的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Tab.4 Recoveries and RSDs for spiked fishes sample

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

采用本方法對(duì)本地區(qū)市售的鯉魚(yú)、草魚(yú)和鯽魚(yú)等共88份樣品進(jìn)行了檢測(cè)，均未檢出硝基咪唑類藥物。相關(guān)部門(mén)應(yīng)繼續(xù)加強(qiáng)水產(chǎn)品中硝基咪唑藥類物殘留量的監(jiān)測(cè)，保障水產(chǎn)品的質(zhì)量安全。

3 結(jié)論

本研究在相關(guān)文獻(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，通過(guò)對(duì)前處理?xiàng)l件和檢測(cè)條件的優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)品中10種硝基咪唑類藥物殘留的同時(shí)測(cè)定。實(shí)驗(yàn)采用乙酸乙酯提取水產(chǎn)品中的硝基咪唑并用正己烷除脂，凈化后在液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀上檢測(cè)，以甲酸水溶液/甲醇作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，改善了硝基咪唑類藥物的響應(yīng)值和峰形，提高檢測(cè)的靈敏度。

在本檢測(cè)條件下，10種硝基咪唑線性范圍為5.00～200 ng/mL。線性相關(guān)系數(shù)均大于0.995 0。對(duì)魚(yú)肉空白樣品進(jìn)行10種硝基咪唑的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)量分別為1.00、2.00、5.00 μg/kg，回收率在70.2%～119%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏均差(n=3)在13.5%以下。該檢測(cè)方法與原有的標(biāo)準(zhǔn)方法[20]相比，操作更簡(jiǎn)便，靈敏度更高，適用于水產(chǎn)品中硝基咪唑類藥物的大批量檢測(cè)。