鄭文靜，趙慧男，孫珊珊，薛霞，劉艷明*，張艷俠*

1. 山東省食品藥品檢驗研究院（濟南 250101）；2. 山東省食品藥品安全檢測工程技術研究中心（濟南 250101）

大黃魚作為我國特有的經濟魚類，因其肉鮮味美，蛋白質、微量元素以及ω-3脂肪酸含量豐富，且具有較高的藥用價值，深受消費者喜愛[1]。由于其保鮮期短、產量低，大黃魚尤其是野生黃魚往往供不應求。硫代黃素也稱為堿性黃1、硫磺素T，是一種苯并噻唑類化工染料，主要用于生物領域的組織染色[2]，其化學結構見圖1。根據《食品中可能違法添加的非食用物質和易濫用的食品添加劑品種名單（第五批）》的相關規(guī)定，硫代黃素為禁止用作食品添加劑的化學制品[3]。但其由于價格低廉、染色效果好，受利益驅使、不法商販使用硫代黃素等黃色化工染料對劣勢黃魚或偽黃魚進行染色，染色后魚體色澤鮮艷，不易褪色，從而達到以次充好、以假亂真的目的。近年來“黃魚造假”食品安全事件屢屢發(fā)生。過量食用此類問題黃魚，會對人體腎臟、肝臟造成損傷，具有致癌、致畸變性的風險，嚴重威脅消費者的身體健康[4]。為有效監(jiān)控大黃魚中硫代黃素的違法添加，建立快速準確的相關檢測方法尤為必要。

圖1 硫代黃素的化學結構

關于大黃魚中硫代黃素的檢測尚無統一的相關國家、行業(yè)檢驗標準，相關的分析檢測也少有報道，僅有一篇文獻報道，且在樣品提取和凈化方面存在一定局限性[2]。食品中合成色素和工業(yè)染料的分析方法主要有分光光度法[5-6]、薄層色譜法[7]、液相色譜法[8-10]和液相色譜-串聯質譜法[11-14]等。分光光度法設備簡單，操作方便，但存在特異性低、靈敏度低的問題。薄層色譜法自動化程度低，定量精度和重現性較差。液相色譜-串聯質譜法靈敏度高，但成本較高，樣品處理要求嚴格，影響了方法的普及應用。相比之下，高效液相色譜法具有分析速度快、檢測靈敏度高、定量分析準確及適用性好等特點，是目前食品領域量化分析合成色素和工業(yè)染料最常用的檢測方法。

試驗建立一種簡便、靈敏、準確的高效液相色譜測定大黃魚中非法染料硫代黃素的方法，對目標物穩(wěn)定性進行了考察，優(yōu)化提取溶劑及凈化方式，同時優(yōu)化色譜條件，提高目標物的回收率及方法穩(wěn)定性。該方法的建立為有效遏制大黃魚中硫代黃素的非法添加行為和產品安全風險預警提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Waters 2695高效液相色譜儀（配備Waters 2998二極管陣列檢測器，美國Waters公司）；AB204-S型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；SB-800DTD型超聲波清洗器（中國寧波新芝生物科技股份有限公司）；3-18K型冷凍離心機（德國Sigma公司）；Milli-Q超純水制備器（美國MILLIPORE公司）；渦旋混合器（德國IKA公司）；XBridge C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm，美國Waters公司）。

標準品：硫代黃素（純度≥99%，天津阿爾塔科技有限公司）。甲醇、乙腈、正己烷（色譜純，德國Merck公司）；甲酸（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）。

大黃魚樣品（均為市售）。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液的配制

準確稱取10 mg（精確至0.01 mg）硫代黃素標準品，用80%乙腈水（V/V）溶解并定容至10 mL，配制成質量濃度為1 mg/mL的標準儲備溶液，轉移至密閉棕色容器中，置于4 ℃冰箱中避光貯存。

將硫代黃素標準儲備溶液用80%乙腈水（V/V）逐級稀釋，配制成質量濃度為0.05，0.1，0.2，1，5，10，20和50 μg/mL的標準中間液，轉移至密閉棕色容器中，置于4 ℃冰箱中避光貯存。

1.2.2 樣品前處理過程

稱取2 g（準確至0.01 g）樣品于50 mL離心管中，加入20 mL 80%乙腈水（V/V）溶液，渦旋混勻，超聲提取15 min；加入10 mL乙腈飽和正己烷，振搖1 min后，按8 000 r/min離心5 min，取下層清液，用0.22 μm微孔濾膜過濾后待測。

1.2.3 色譜條件

色譜柱Waters? XBridge（3.5 μm，150 mm×4.6 mm）。流動相：A甲醇，B 0.02%甲酸水；采用梯度洗脫程序，梯度條件見表1。流速0.8 mL/min；進樣體積10 μL；檢測波長418 nm；柱溫35 ℃。

表1 流動相梯度程序

1.3 數據處理

通過與儀器配套的Empower 3色譜數據處理系統完成數據采集與處理，采用Origin 8.5分析軟件進行數據處理和繪圖。

2 結果與分析

2.1 硫代黃素穩(wěn)定性考察

正確配制標準溶液是保證試驗結果準確性的前提。在硫代黃素檢測過程中，研究發(fā)現用水配制的硫代黃素標準中間液12 h內響應面積降低明顯，導致定量不準，影響試驗結果。同時，這種現象也可能會導致試驗前處理過程中硫代黃素回收率失真，試驗結果準確度降低。因此，對不同配制試劑中的硫代黃素的穩(wěn)定性進行考察，保證試驗結果準確可靠。

硫代黃素作為一種堿性苯并噻唑類化合物，在水中的穩(wěn)定性可能與其pKa有關，分別用不同pH的水溶液配制10 μg/mL水平的硫代黃素標準工作液，對其穩(wěn)定性進行考察。結果顯示：硫代黃素在堿性水溶液中不穩(wěn)定，在4 ℃冰箱內儲存一周后響應面積降低20%；在pH 2～7的水溶液中較穩(wěn)定，響應面積無明顯變化。基于部分液相色譜儀的進樣系統無法實現控溫的條件，進一步比較室溫下硫代黃素在pH 2～7范圍內的水溶液中的穩(wěn)定性。如圖2所示，硫代黃素在pH 2條件下48 h內穩(wěn)定。通過對硫代黃素結構（圖1）分析可以看到，其結構為2-苯并噻唑環(huán)與1個對二甲氨基苯基相連，推測可能是在一定的pH范圍內2-苯并噻唑環(huán)處容易開環(huán)降解，造成其在不同pH下的穩(wěn)定性不同，而低溫可能會延緩其降解過程。

圖2 不同pH水溶液中硫代黃素含量變化圖

pH過低會影響色譜柱的使用壽命，考慮到色譜柱的pH耐受性，試驗考察乙腈-水中的硫代黃素的穩(wěn)定性，對超純水，20%，50%和80%（V/V）乙腈水溶液，純乙腈配制的硫代黃素標準液48 h內的響應面積進行分析，結果如圖3所示。乙腈比例高于50%的硫代黃素標準液均穩(wěn)定。分析原因是乙腈本身不易解離，有利于硫代黃素中苯并噻唑環(huán)結構的穩(wěn)定，因此，乙腈比例高時硫代黃素呈現穩(wěn)定的狀態(tài)。由于純乙腈配制的硫代黃素標準液在液相色譜分析中存在溶劑效應，出現峰變形的現象，最終采用80%乙腈水溶液配制硫代黃素標準液。

圖3 不同比例乙腈水溶液中硫代黃素含量變化圖

2.2 儀器條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜條件的選擇

比較Waters? XBridge C18（3.5 μm，150 mm×4.6 mm），Waters Atlantis T3（5 μm，150 mm×4.6 mm）和Phenomenex Titank C18（5 μm，150 mm×4.6 mm）3種色譜柱對分離效果的影響。結果顯示，在相同的色譜條件下Atlantis T3、Titank C18對目標物保留較強，出峰時間較晚，導致分析時間延長，易產生殘留。最終選擇XBridge C18色譜柱。

2.2.2 流動相的選擇

對不同流動相體系進行研究，比較甲醇-水、甲醇-20 mmol/L醋酸銨、甲醇-0.01%甲酸水溶液、甲醇-0.02%甲酸、甲醇-0.05%甲酸溶液對目標物分離情況。結果顯示：甲醇-水的流動相出峰較晚，且拖尾嚴重，對稱因子為1.56。在水相中加入醋酸銨后，出峰時間明顯縮短，但仍存在拖尾現象，對稱因子為1.46。在水相中加入甲酸后能夠縮短出峰時間，甲酸體積分數為0.01%存在拖尾，甲酸體積分數為0.02%和0.05%時峰形得到改善，峰形尖銳，對稱性好，兩者響應峰面積無明顯區(qū)別，考慮甲酸體積分數過高影響色譜柱壽命，因此選擇甲醇-0.02%甲酸作為流動相。

2.2.3 檢測波長的選擇

硫代黃素經液相色譜分離，二極管陣列檢測器掃描檢測，在200～500 nm范圍內測定硫代黃素的吸光度，得到的紫外光譜圖如圖4所示。硫代黃素的最大吸收峰為418 nm，在該條件下，可獲得較高的靈敏度，特異性好，可獲得較好基線及較少干擾，選擇418 nm作為定量的檢測波長。

圖4 硫代黃素在200～500 nm范圍內的光譜圖

2.3 前處理方法的優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的選擇

分別考察乙腈、甲醇、水作為提取溶劑對目標物的提取效率，結果表明以純水作為提取溶劑，目標物的回收率約為20%，且提取液渾濁，樣品凈化困難，不適用于大黃魚高蛋白基質的處理。乙腈和甲醇都具有沉淀蛋白質的作用，但純乙腈或甲醇易使蛋白質快速凝結成團，不利于目標物的釋放，向提取液中加入一定比例水相會提高樣品分散程度，有利于目標物的提取。因此，比較不同配比甲醇-水、乙腈-水溶液的提取效果。同一配比下，乙腈的提取效果比甲醇好。分析原因是甲醇和乙腈沉淀蛋白的效率和分子量不同，針對大黃魚中的蛋白質種類，乙腈沉淀蛋白的效果比甲醇好，更具有選擇性，使得硫代黃素更容易同基質釋放出來。乙腈比例高于50%，均可達到較好的回收率，回收率在90%以上。采用80%乙腈水作為提取劑時目標物的回收率最高，達到95%左右；有機相比例低于50%時，回收率開始下降，可能與硫代黃素在溶劑中的存在形式有關。樣品經80%乙腈水（V/V）提取，蛋白沉淀效果好，提取液更澄清，回收率高，因此選擇80%乙腈作為提取溶劑。

圖5 不同提取溶劑對硫代黃素回收率的影響

2.3.2 提取體積及次數的優(yōu)化

對提取次數和提取體積進行優(yōu)化。以80%乙腈水作為提取溶劑，提取體積分別為10，20和25 mL，提取次數為1次的結果表明，提取體積10 mL時的回收率為90%，提取體積增大到20 mL時，回收率有所升高，進一步增大提取體積后提取效率無明顯變化?？紤]到經濟成本，選擇用20 mL 80%乙腈水（V/V）進行提取。進一步對提取次數進行考察，增加提取次數，回收率無明顯提高，基于節(jié)約時間成本的角度，選擇提取次數為1次。

2.3.3 凈化方式的比較

針對大黃魚高蛋白、高脂肪的的復雜基質，分別考察亞鐵氰化鉀-乙酸鋅、氫氧化鈉-硫酸鋅、乙腈3種沉淀蛋白的凈化方式。由圖6可見，前2種凈化方法的回收率較低，回收率低于10%，推測原因可能是2組無機鹽沉淀劑對目標物存在吸附現象，或提取液的pH對硫代黃素的穩(wěn)定性影響較大。第3種凈化方式樣品經水分散，乙腈沉淀蛋白后，可獲得較高水平的回收率。

圖6 不同凈化方式硫代黃素回收率的比較

為清除基質中的脂肪類雜質，利用乙腈飽和正己烷除脂，除脂后的樣品溶液更加澄清，且除脂前后回收率無明顯差別，能夠保證較高而穩(wěn)定的回收率。因此，選用乙腈水提取目標物，乙腈飽和正己烷除脂，達到對樣品凈化的目的。

2.4 方法學評價

2.4.1 線性范圍、檢出限和定量限

取適量標準儲備溶液，用80%乙腈水（V/V）稀釋，配制成質量濃度分別為0.05，0.1，0.2，1，5，10，20和50 μg/mL的系列標準工作溶液。將系列標準工作溶液按濃度從低到高的順序，按1.2.3液相色譜條件進行測定，以硫代黃素峰面積（Y）對其質量濃度（X）作標準曲線。采用空白基質加標的方法，以信噪比S/N=10得到目標物的定量限（SLOQ），以信噪比S/N=3得到目標物的檢出限（SLOD）。硫代黃素在0.5～50 μg/mL之間線性關系良好，線性回歸方程為Y=6.11×104X-2.32×103，線性相關系數（R）大于0.999，SLOD為0.2 mg/kg，SLOQ為0.5 mg/kg。硫代黃素標準物質色譜圖以及陰性加標試樣色譜圖見圖7和圖8。

圖7 硫代黃素標準溶液（5 μg/mL）色譜圖

圖8 陰性加標試樣（5 mg/kg）色譜圖

2.4.2 回收率和精密度

采取向大黃魚空白樣品中添加低（0.5 mg/kg）、中（1 mg/kg）、高（5 mg/kg）3個加標水平，每個濃度水平平行測定6次，得到方法的回收率及精密度，見表2。在GB/T 27404—2008檢測方法的確認要求中規(guī)定，加標量在1～100 mg/kg，回收率范圍為90%～110%[15]。該方法3個濃度水平的加標回收率在91.6%～97.8%。GB/T 27404—2008中實驗室內變異系數隨待測組分含量的減小而增加，待測組分含量10 mg/kg時，實驗室內變異系數為7.5%[15]。該方法的相對標準偏差在1.5%～2.1%。結果表明，方法的回收率和精密度均滿足標準要求。

表2 方法的回收率及精密度（n=6）

2.5 實際樣品測定

應用所建方法對市售20批次大黃魚樣品進行檢測，結果均未檢出硫代黃素，今后可持續(xù)跟進大黃魚中非法添加的監(jiān)測。

3 結論

試驗建立大黃魚中硫代黃素的高效液相色譜定性定量方法，對提取溶劑、凈化方式及色譜條件進行優(yōu)化。同時對硫代黃素穩(wěn)定性進行系統性考察，從而保證試驗結果的準確度。該方法的前處理只需乙腈水超聲提取，乙腈飽和正己烷除脂，簡單快速，同時出峰時間短，準確度、精密度等符合要求，適用于大黃魚中硫代黃素的快速測定，能夠更好地為此類產品的市場監(jiān)管提供服務。