張彤，胡姝，畢孝瑞，李曉東，徐宜宏*，王秋艷

1. 沈陽海關(guān)技術(shù)中心（沈陽 110016）；2. 大連海關(guān)技術(shù)中心（大連 116000）

發(fā)酵乳因?yàn)槠洫?dú)特的口感和較高的營養(yǎng)價(jià)值，受到世界各地的喜愛[1-3]。發(fā)酵乳作為世界性的產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速[4-6]。在奶牛的飼養(yǎng)過程中飼養(yǎng)員會通過在飼料中添加一些抗生素預(yù)防和治療疾病，但是大劑量抗生素的使用會造成牛奶中藥物殘留，從而給人體健康帶來危害[7-10]。由于部分的養(yǎng)殖企業(yè)并不按照安全標(biāo)準(zhǔn)使用這些抗生素，造成我國發(fā)酵乳中抗生素含量逐年上升，如果長期食用這種發(fā)酵乳會對人體造成很大傷害[11-13]。特別是殘留在發(fā)酵乳中的抗生素，很難降解，而發(fā)酵乳作為嬰幼兒食品的一種，長期食用可能會嚴(yán)重破壞嬰幼兒的免疫系統(tǒng)[14]。

目前應(yīng)用最廣的快篩檢測方法就是QuEChERS方法，多用于植物源性食品中農(nóng)殘的檢測，獸藥殘留的檢測相對較少且普遍性較低[15-18]。應(yīng)用到發(fā)酵乳方面的檢測更是相對較少且一般均為牛奶的檢測，而且檢測的抗生素種類沒有特別的全面[19-20]。試驗(yàn)通過優(yōu)化現(xiàn)有的QuEChERS前處理方法，建立發(fā)酵乳中37種常用抗生素殘留的快速篩查檢測方法，以期為發(fā)酵乳的安全保障提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)樣品

從沈陽市各超市中隨機(jī)采購不同廠家生產(chǎn)的不同種類的發(fā)酵乳樣品30份，每份樣品采購2個(gè)相同批號的獨(dú)立包裝，每個(gè)樣品至少0.2 L。

1.1.2 試驗(yàn)儀器

LC-20A/AB6500超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（日本島津公司/美國AB公司）；X1R離心機(jī)（德國Thermo公司）；渦旋振蕩器（美國Scientific Industries公司）；CPA225D電子分析天平（德國Sartorius公司）；Biocel超純水機(jī)（美國Millipore公司）；EVAP 111氮吹濃縮儀（美國Organomation公司）。

1.1.3 試劑及標(biāo)準(zhǔn)溶液

甲醇、乙腈（色譜純，北京迪馬科技有限公司）；甲酸、無水硫酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉、氯化鈉（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；C18、NH2、PSA、PAX（北京迪馬科技有限公司）；氯四環(huán)素、沙拉沙星、達(dá)氟沙星、洛美沙星、強(qiáng)力霉素、土霉素、螺旋霉素、交沙霉素、依諾沙星、四環(huán)素、羅紅霉素、林可霉素、北里霉素、磺胺甲噻二唑、磺胺吡啶、克林霉素、紅霉素、替米考星、磺胺吡唑、泰樂菌素、司帕沙星、磺胺醋?；前匪鬣奏?、奧比沙星、吡哌酸、磺胺-5-甲氧嘧啶、西諾沙星、磺胺甲惡唑、培氟哌酸、米洛沙星、氟甲喹、地美硝唑、氟羅沙星、麻保沙星、甲硝唑、二氟沙星、洛硝噠唑地標(biāo)準(zhǔn)品（德國Dr.Ehrenstorfer公司）；試驗(yàn)所用水均為一級水。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的提取與凈化

稱取2.0 g試樣于離心管內(nèi)，加9.9 mL入乙腈、0.1 mL甲酸及0.1 g乙二胺四乙酸二鈉，振蕩1 min，加入4.0 g無水硫酸鈉和1.0 g氯化鈉，渦旋混勻，超聲提取15 min，按6 000 r/min離心6 min，取6 mL上清液，加入0.9 g無水硫酸鈉和150 mg C18吸附劑，渦混2 min，按6 000 r/min 離心6 min，靜置10 min，取3 mL上清液 于10 mL試管中在40 ℃下氮吹濃縮至干。加入1 mL 0.1%甲酸-乙腈（9∶1，V/V）的定容液，渦旋混勻后，過0.22 μm濾膜，供LC-MS/MS/MS測定。

1.2.2 液相色譜條件

色譜柱為Waters ACQUITY UPLC @BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫40 ℃；樣品室溫度為室溫；進(jìn)樣體積5.0 μL；流速0.2 mL/min；流動(dòng)相為甲醇（A）和0.1%甲酸水溶液（B）。梯度洗脫程序：0～2 min，95% B；2～8 min，95%～75% B；8～14 min，75%～58% B；14～30 min，58%～5% B；30～32 min，5% B；32～35 min，5%～95% B。

1.2.3 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI+）；離子源溫度550 ℃；離子噴霧電壓5 500 V；入口電壓10 V；霧化氣50 Psi；輔助加熱氣50 Psi；氣簾氣30 Psi；監(jiān)測模式采用多反應(yīng)離子監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM），具體參數(shù)見表1。

表1 待測抗生素的質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

選取37種抗生素中選擇具有代表性的四環(huán)素、磺胺甲惡唑、克林霉素、交沙霉素、依諾沙星、洛美沙星進(jìn)行前處理優(yōu)化。

2.1.1 提取液的選擇優(yōu)化

分別用乙腈、1%甲酸-乙腈、乙二胺四乙酸二鈉-1%甲酸乙腈作為提取液測定回收率，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，提取液溶劑的選擇對四環(huán)素的影響較大，因?yàn)槠湟着c發(fā)酵乳中的鈣、鎂離子發(fā)生螯合反應(yīng)形成難以溶解的鹽類，所以在提取液中加入乙二胺四乙酸二鈉和甲酸后，能夠抑制此類化合物的生成，從而提高四環(huán)素回收率，因此，初步選用乙二胺四乙酸二鈉-1%甲酸乙腈作為提取液。

圖1 提取溶劑種類對回收率的影響

2.1.2 吸附劑的確定

分別用C18，NH2，PSA和PAX作為吸附劑，進(jìn)行前處理，測定回收率。結(jié)果見圖2。

由圖2可知，吸附劑的種類對于大多數(shù)抗生素回收率的影響也沒有較大區(qū)別，但是對于四環(huán)素類抗生素的回收率影響區(qū)別較大。其中，PSA作為吸附劑時(shí)四環(huán)素的回收率最低，其他的NH2和PAX對四環(huán)素的吸附性也較強(qiáng)，回收率均不及C18，故選用C18作為吸附劑進(jìn)行凈化。

圖2 不同吸附劑對回收率的影響

2.1.3 吸附劑用量的確定

分別加入50，100，150和200 mg C18吸附劑，測定回收率。結(jié)果見圖3。

由圖3可知，隨著吸附劑使用量增加，回收率逐漸升高，但150 mg之后趨于平穩(wěn)，且由于吸附劑成本較高，因此，確定吸附劑C18用量為150 mg。

圖3 不同吸附劑用量對回收率的影響

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

用優(yōu)化后的前處理方法對陰性空白基質(zhì)進(jìn)行前處理，得到基質(zhì)配制不同濃度的混合工作曲線，可以有效減小基質(zhì)效應(yīng)，提高檢測的準(zhǔn)確性。由于37種抗生素的靈敏度純在差異，所以選擇不同的線性濃度。37種抗生素在考察范圍內(nèi)均線性良好，且相關(guān)系數(shù)均不低于0.99。抗生素的測定低限具體結(jié)果見表2。根據(jù)測定低限的不同，分別添加測定低限的1，2和10倍制成模擬的加標(biāo)樣品，所得到的樣品中各待測抗生素的回收率、變異系數(shù)見表2。試驗(yàn)結(jié)果表明，在所考察的發(fā)酵乳中，37種抗生素的回收率為60.3%～92.8%，變異系數(shù)為3.2%～10.8%。

表2 線性回歸方程、檢測低限、回收率及變異系數(shù)

接表2

2.3 實(shí)際樣品中37種抗生素殘留量的測定

采用建立的方法測定沈陽市售的30份發(fā)酵乳樣品中37種抗生素。30份發(fā)酵乳樣品中37種抗生素檢測值均小于方法的測定低限。

3 結(jié)論與討論

通過單因素試驗(yàn)確定發(fā)酵乳中37種抗生素殘留量的檢測方法。試驗(yàn)結(jié)果表明：該方法準(zhǔn)確性和重復(fù)性好，靈敏度高，完全滿足發(fā)酵乳中常見抗生素殘留檢測需要，同時(shí)可推廣到同行業(yè)其他實(shí)驗(yàn)室，實(shí)現(xiàn)儀器和成果共享，具有一定創(chuàng)新性和可推廣應(yīng)用的價(jià)值。