王煥琦，李紅洲*，黃家?guī)X，王正強(qiáng)

貴州省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)院（貴陽(yáng) 550016）

葡萄酒在國(guó)內(nèi)歷史久遠(yuǎn)[1]，早在西漢時(shí)期我國(guó)就傳入葡萄酒[2-3]，由此開(kāi)啟我國(guó)的葡萄酒業(yè)[4]，并在唐朝得到長(zhǎng)足發(fā)展[5]，在宋朝時(shí)期陷入低迷[6]，在元朝更是因?yàn)楫?dāng)時(shí)政府的扶持到達(dá)鼎盛時(shí)期[7]，在我國(guó)歷史上有關(guān)于葡萄酒相關(guān)的禮儀和詩(shī)歌也多有記載[8]，葡萄酒不僅味美，還有其獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)元素，如多種機(jī)酸和礦物質(zhì)元素[9]葡萄酒不僅能夠預(yù)防一些疾病還能夠養(yǎng)顏美容，具有一定保健功能[10]。

醛類(lèi)是葡萄酒中風(fēng)味物質(zhì)的重要組成部分，其中乙醛占據(jù)重要地位，低濃度的乙醛具有水果的愉快香味，一旦濃度升高則會(huì)產(chǎn)生辛辣氣味[11]，然而在2009年乙醛被認(rèn)為是強(qiáng)致癌物質(zhì)[12]，糠醛別名2-呋喃甲醛是葡萄酒的一種重要呈香物質(zhì)，是一種具有杏仁油的香氣的無(wú)色液體，能更加突出葡萄酒空杯留香的特點(diǎn)[13]，可以說(shuō)醛類(lèi)物質(zhì)是葡萄酒香氣成分的重要組成部分，形成了葡萄酒協(xié)調(diào)柔和回味無(wú)窮的特點(diǎn)。

針對(duì)葡萄酒中乙醛含量的檢測(cè)主要有：韋曉群等[14]采用2，4-二硝基苯肼（DNPH）柱前衍生氣相色譜質(zhì)譜法檢測(cè)葡萄酒中乙醛，梁瑞娥等[15]采用頂空氣相色譜法測(cè)定葡萄酒中微量甲醇、乙醛，王光沖[16]采用2，4二硝基苯肼（DNPH）柱前衍生結(jié)合HPLC測(cè)定葡萄酒中的總乙醛及游離乙醛。國(guó)內(nèi)外針對(duì)葡萄酒中糠醛含量的檢測(cè)極少主要文獻(xiàn)有：李洋[17]等采用攪拌棒吸附萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定葡萄酒中糠醛，李春光[18]等采用固相微萃取內(nèi)標(biāo)法結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜測(cè)定葡萄酒中糠醛。

結(jié)合查閱大量文獻(xiàn)方法，總結(jié)針對(duì)葡萄酒中的乙醛的檢測(cè)多采用柱前衍生法，即前處理采用2，4二硝基苯肼（DNPH）柱前衍生后通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定或者通過(guò)HPLC液相色譜法測(cè)定，存在前處理復(fù)雜繁瑣、儀器設(shè)備昂貴、試驗(yàn)成本過(guò)高的問(wèn)題，而固相微萃取技術(shù)前處理法存在商用萃取成本過(guò)高的問(wèn)題，針對(duì)同時(shí)檢測(cè)葡萄酒中乙醛和糠醛的文獻(xiàn)較少。因此，試驗(yàn)通過(guò)查看相關(guān)文獻(xiàn)并結(jié)合日常檢驗(yàn)檢測(cè)工作，建立蒸餾法-氣相色譜法聯(lián)用測(cè)定葡萄酒中乙醛和糠醛的方法，該方法簡(jiǎn)單穩(wěn)定高效，能夠除去葡萄酒中糖和色素等干擾因素對(duì)氣相色譜儀的干擾并且大幅降低檢驗(yàn)檢測(cè)成本，以期更好解決葡萄酒醛類(lèi)物質(zhì)測(cè)定前處理復(fù)雜、試驗(yàn)成本過(guò)高的問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙醛標(biāo)準(zhǔn)品；糠醛標(biāo)準(zhǔn)品；乙酸正戊酯標(biāo)準(zhǔn)品（作內(nèi)標(biāo)用）；4-甲基2-戊醇溶液（作內(nèi)標(biāo)用）；乙醇（色譜純）；市售葡萄酒；超純水，GB/T 6682—2008規(guī)定的一級(jí)水Milli-Q academic超純水系統(tǒng)制備。

1.2 儀器與設(shè)備

高效氣相色譜儀配有氫火焰離子化檢測(cè)器（1260II，美國(guó)安捷倫公司）；檢測(cè)器（氫火焰離子化FID）；全玻璃蒸餾器（500 mL）；恒溫水?。乜亍?.1 ℃）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 模擬酒樣、標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液和使用溶液的配制

1.3.1.1 模擬酒樣

模擬葡萄酒12%的酒度，取無(wú)水乙醇12 mL用超純水定容100 mL，使無(wú)水乙醇的體積分?jǐn)?shù)為12%。

1.3.1.2 內(nèi)標(biāo)溶液

乙酸正戊酯溶液（2%）：作乙醛內(nèi)標(biāo)使用。吸取乙酸正戊酯標(biāo)準(zhǔn)品2 mL，使用12%無(wú)水乙醇溶液定容至100 mL。

4-甲基2-戊醇溶液（2%）：作糠醛內(nèi)標(biāo)使用。吸取4-甲基2-戊醇標(biāo)準(zhǔn)品2 mL，使用12%無(wú)水乙醇溶液定容至100 mL。

1.3.1.3 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液

準(zhǔn)確稱(chēng)取10 mg乙醛和糠醛標(biāo)準(zhǔn)品，使用12%無(wú)水乙醇溶液定容至100 mL分別得到1 000 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

1.3.1.4 標(biāo)準(zhǔn)使用溶液

分別吸取適量乙醛和糠醛標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液適量于10 mL容量瓶中使用12%無(wú)水乙醇溶液定容至10 mL，分別加入乙酸正戊酯溶液（2%）和4-甲基2-戊醇溶液（2%）內(nèi)標(biāo)物質(zhì)各0.1 mL，分別得到一系列質(zhì)量濃度為5.0，15.0，25.0，50.0，70.0和100.0 μg/mL乙醛標(biāo)準(zhǔn)使用液和一系列質(zhì)量濃度為0.5，1.0，5.0，10.0，20.0和50.0 μg/mL糠醛標(biāo)準(zhǔn)使用液。

1.3.2 樣品處理過(guò)程

用一干燥、潔凈100 mL容量瓶，準(zhǔn)確量取100 mL酒樣（液溫20 ℃）與500 mL蒸餾瓶中，用50 mL超純水分3次沖洗容量瓶，洗液一并入蒸餾瓶，加入幾顆沸石，連接冷凝管，以取樣用的原容量瓶作為接收器（外加冰?。?，開(kāi)啟冷卻水（冷卻水溫度最好低于15 ℃），緩慢加熱蒸餾，收集餾出液，容量瓶中液體接近刻度時(shí)，取下容量瓶，蓋塞，在20 ℃水浴中保溫30 min，在補(bǔ)加水至刻度，混勻，備用。

取酒樣餾出液10 mL于10 mL容量瓶中定容，分別加入乙酸正戊酯溶液（2%）和4-甲基2-戊醇溶液（2%）內(nèi)標(biāo)物質(zhì)各0.1 mL，混勻后過(guò)0.22 μm濾膜，待測(cè)。

1.3.3 氣相色譜條件

色譜柱，ZKAT-LZP930.2毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm，中國(guó)，中科安泰公司）。柱溫控制程序：初始溫度50 ℃，保持5 min后，以5 ℃/min升溫至90 ℃，以15 ℃/min升溫至200 ℃；保持2 min進(jìn)樣口溫度200 ℃；檢測(cè)器溫度200 ℃；載氣為高純氮?dú)猓兌龋?9.999%），流量1 mL/min；氫氣流量30 mL/min；空氣流量400 mL/min；尾吹氣流量25 mL/min；分流比5∶1；進(jìn)樣量1.0 μL。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制

取1.3.1中一系列標(biāo)準(zhǔn)使用液在1.3.3氣相色譜條件下檢測(cè)，以峰面積值（y）對(duì)應(yīng)進(jìn)樣質(zhì)量濃度（x）進(jìn)行線(xiàn)性回歸，加入內(nèi)標(biāo)以?xún)?nèi)標(biāo)法定量。

1.3.5 重復(fù)性試驗(yàn)

分別取適量的乙醛和糠醛標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，使用無(wú)水乙醇溶液（體積分?jǐn)?shù)12%），分別配制成質(zhì)量濃度30 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，2種標(biāo)準(zhǔn)溶液在1.3.3氣相色譜條件下檢測(cè)進(jìn)樣6針，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，并且考察測(cè)定值的一致性。

1.3.6 加標(biāo)回收試驗(yàn)

分別取50 mL酒樣于3個(gè)100 mL容量瓶分別加入0.5，1和5 mL乙醛標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，以及50，100和500 μL糠醛標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，取適量酒樣定容100 mL，按照1.3.2和1.3.3方法進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，并且做樣品空白檢驗(yàn)，減去其本底值進(jìn)而計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差SRSD和平均回收率（n=5）。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱的優(yōu)化

通過(guò)大量文獻(xiàn)資料的查閱，色譜柱的選擇主要有DB-5MS毛細(xì)管柱（30.0 m×0.25 mm×0.25 μm）、DB-WAX毛細(xì)管柱（30.0 m×0.25 mm×0.25 μm）、CP WAX 57 CB毛細(xì)管柱（50.0 m×0.25 mm×0.25 μm）。通過(guò)試驗(yàn)表明，色譜柱選擇DB-5MS毛細(xì)管柱（30.0 m×0.25 mm×0.25 μm）時(shí)目標(biāo)物質(zhì)雖然可以實(shí)現(xiàn)分離但是乙醛物質(zhì)目標(biāo)峰型較寬，并且有一定的拖尾，降低檢測(cè)靈敏度，色譜柱選擇DB-WAX毛細(xì)管柱（30.0 m×0.25 mm×0.25 μm），色譜圖峰型較好，但是在測(cè)定樣品時(shí)糠醛物質(zhì)目標(biāo)峰會(huì)和干擾物質(zhì)部分重合，并且進(jìn)口色譜柱采購(gòu)成本過(guò)高，試驗(yàn)以降低試驗(yàn)成本和增大分離效果增強(qiáng)檢測(cè)靈敏度的原則，確定使用ZKAT-LZP930.2毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm，中國(guó)，中科安泰公司）國(guó)產(chǎn)色譜柱，不斷優(yōu)化條件，確定最佳色譜條件：柱溫控制程序?yàn)?，初始溫?0 ℃，保持5 min后，以5 ℃/min升溫至90 ℃，以15 ℃/min升溫至200 ℃；保持2 min進(jìn)樣口溫度200 ℃；檢測(cè)器溫度200 ℃；載氣為高純氮?dú)猓兌龋?9.999%），流量1 mL/min；氫氣流量30 mL/min；空氣流量400 mL/min；尾吹氣流量25 mL/min；分流比5∶1；進(jìn)樣量1.0 μL。從圖1和圖2可知，在最佳色譜條件下，各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)都有較好的分離度，并且峰型較好。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液中2種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和2種內(nèi)標(biāo)的色譜圖

圖2 樣品中2種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和2種內(nèi)標(biāo)的色譜圖

2.2 葡萄酒樣前處理方法討論

2.2.1 純水添加量的優(yōu)化

在蒸酒過(guò)程中純水添加太少會(huì)導(dǎo)致蒸酒時(shí)間過(guò)短導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)揮發(fā)不充分，而純水添加過(guò)多會(huì)導(dǎo)致蒸酒時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致試驗(yàn)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，試驗(yàn)考察在加標(biāo)樣品中純水添加量（20，30，40，50，60和70 mL），每一種添加量平行測(cè)定3次取平均回收率考察乙醛和糠醛加標(biāo)樣品平均回收率的的影響，結(jié)果如圖3所示。試驗(yàn)結(jié)果表明，純水添加量50 mL時(shí)，乙醛和糠醛回收率達(dá)到最高而后隨著純水添加量的提高回收率基本保持不變，為確保乙醛和糠醛有較好的回收率和節(jié)約試驗(yàn)時(shí)間的目的，最終確定最優(yōu)純水添加量為50 mL。

圖3 純水添加量對(duì)乙醛和糠醛回收率的影響

2.3 線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性范圍

從表1可以看出，乙醛和糠醛的線(xiàn)性范圍分別是5.0～100.0 μg/mL和0.5～50.0 μg/mL，相關(guān)性系數(shù)為0.999 33和0.999 75，相關(guān)系數(shù)R2＞0.999，以信噪比3（S/N=3）確定檢出限（limit it of detection，SLOD）。

表1 葡萄酒中乙醛及糠醛的線(xiàn)性回歸方程，相關(guān)系數(shù)及檢出限

2.4 精密度與回收率

試驗(yàn)在方法測(cè)定低限，2倍方法測(cè)定低限和10倍方法檢測(cè)低限進(jìn)行3個(gè)水平試驗(yàn)（n=5），每個(gè)水平分別計(jì)算平均回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。該方法檢測(cè)葡萄酒中乙醛及糠醛測(cè)定低限加標(biāo)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD）為1.47%～4.23%，平均回收率為82.47%～89.66%，2倍方法測(cè)定低限的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD）為1.66%～ 5.33%，平均回收率為89.44%～92.15%，10倍方法檢測(cè)低限的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD）為1.54%～4.52%，平均回收率為93.14%～95.26%，說(shuō)明該檢驗(yàn)方法對(duì)葡萄酒中乙醛和糠醛的檢測(cè)有良好的精密度和準(zhǔn)確性，滿(mǎn)足檢驗(yàn)分析要求。

表2 葡萄酒中乙醛及糠醛相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差與加標(biāo)回收率（n=5）

2.5 重復(fù)性

經(jīng)過(guò)測(cè)定葡萄酒中乙醛和糠醛檢測(cè)值的SRSD分別為1.55%和1.80%，結(jié)果見(jiàn)表3，可以看出2種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)SRSD＜5%，表明葡萄酒中乙醛和糠醛在最佳色譜儀器條件下有良好重復(fù)性。

表3 方法重復(fù)性測(cè)定

2.6 樣品中乙醛和糠醛含量的測(cè)定

從表4可知，5種市售葡萄酒中乙醛均有檢出，但是含量差異有變化，其中河北干紅葡萄酒乙醛和糠醛含量最高，分別為65.24和5.78 μg/mL，而貴州藍(lán)莓酒乙醛和糠醛含量最低，分別為10.22 μg/mL，未檢出。

表4 實(shí)際樣品檢測(cè)

3 結(jié)論

試驗(yàn)建立蒸餾法-氣相色譜法聯(lián)用同時(shí)配合內(nèi)標(biāo)法測(cè)定葡萄酒中乙醛和糠醛含量的檢測(cè)方法，采用蒸餾法除去葡萄酒中糖和色素等干擾物質(zhì)對(duì)氣相色譜的影響，簡(jiǎn)化以往衍生化法和固相微萃取法試驗(yàn)步驟和試驗(yàn)成本，并且優(yōu)化蒸餾法中純水添加量，確定純水添加量為50 mL，節(jié)省了試驗(yàn)時(shí)間，同時(shí)優(yōu)化了氣相色譜柱和色譜條件，確定色譜條件為：ZKAT-LZP930.2毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm，中國(guó)，中科安泰公司），柱溫控制程序：初始溫度50 ℃，保持5 min 后，以5 ℃/min升溫至90 ℃，以15 ℃/min 升溫至200 ℃；保持2 min進(jìn)樣口溫度200 ℃；檢測(cè)器溫度200 ℃；載氣為高純氮?dú)猓兌龋?9.999%），流量1 mL/min；氫氣流量30 mL/min；空氣流量400 mL/min；尾吹氣流量25 mL/min；分流比5∶1；進(jìn)樣量1.0 μL。結(jié)果表明，乙醛和糠醛分別在5.0～100.0 μg/mL和0.5～50.0 μg/mL線(xiàn)性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2分別為0.999 33和0.999 75，乙醛和糠醛重復(fù)性檢測(cè)值SRSD值為1.55%～1.80%，3個(gè)水平樣品加標(biāo)平均回收率分別為82.47%～89.66%，89.44%～92.15%和93.14%～95.26%，方法精密度（SRSD）分別為1.47%～4.23%，1.66%～5.33%和1.54%～4.52%（n=5），乙醛和糠醛的方法最低檢出限分別為4.48和0.54 μg/mL，說(shuō)明試驗(yàn)方法重現(xiàn)性，精密度和準(zhǔn)確性良好，測(cè)得5種市售葡萄酒乙醛含量范圍為10.22～65.24 μg/mL，糠醛含量范圍為1.51～5.78 μg/mL，該方法簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確，減少了前處理步驟，使用更加便宜的檢測(cè)設(shè)備，降低了試驗(yàn)成本，為葡萄酒中乙醛和糠醛的檢測(cè)提供新方法。