董梅，韓金龍，徐穎，郭莉君，武琴園，羅葉麗

1. 渭南市食品藥品檢驗所（渭南 714000）；2. 陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院（西安 710021）

蘋果根皮苷是蘋果中活性最高、含量最多的多酚物質(zhì)[1]。它主要存在于蘋果樹的根皮、莖、嫩葉以及蘋果果實中，具有多種生物活性[2-5]。近年來被廣泛應(yīng)用于人體藥物和生物膜的生理研究，主要包括肥胖癥、高血壓、抗氧化性、膜滲透性、食品和飲料的保質(zhì)期、食品添加劑、藥物和化妝品等方面[6-9]。

目前根皮苷的檢測大多集中在海棠、荔枝、多穗柯甜茶和蘋果芽中[10-12]，對于蘋果幼果期，果肉、果皮和幼葉中根皮苷檢測方法的報道很少。多酚物質(zhì)的檢測常用高效液相色譜法，試驗擬建立二極管陣列-高效液相色譜法測定蘋果幼果中的根皮苷，分析不同品種、不同組織中根皮苷含量的差異，為蘋果的育種優(yōu)化、提高蘋果品質(zhì)研究提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘋果幼果采自陜西白水蘋果試驗站，包括富士、秦陽、秦冠、紅星、紅蓋露、中秋王、金世紀(jì)、黃元帥、洼里紅、短枝10個品種，采摘時間2020年6月20日，采摘后放在-20 ℃冰箱保存；根皮苷標(biāo)品（含量≥98%），上海源葉生物科技有限公司；甲醇（色譜純），德國默克；乙醇（分析純），天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙睛（色譜純），美國天地。

1.2 儀器與設(shè)備

ES 225SM-DR分析天平（瑞士Presice公司）；LC-2030 3D高效液相色譜儀（日本島津公司）；XB320M型電子天平（上海天美）；KQ5200DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山舒美）；砂芯過濾裝置（天津津騰）；0.45微孔濾膜（天津津騰）；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制（287.2 mg/L）

準(zhǔn)確稱取7.18 mg標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容至25 mL棕色容量瓶中，在-20 ℃冰箱中儲存?zhèn)溆?，使用時根據(jù)需要稀釋成相應(yīng)質(zhì)量濃度，過0.45 μm濾膜后進(jìn)樣。

1.3.2 樣品的制備

蘋果削皮，果皮分離，準(zhǔn)確稱取1.00 g蘋果皮和蘋果肉放置在研缽中，加入少量抗壞血酸以防止氧化，研碎，用30 mL體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇溶液轉(zhuǎn)移到100 mL的三角瓶中，超聲提取30 min，過濾后濾渣再次加入20 mL體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇溶液超聲提取30 min。合并兩次濾液，在38 ℃條件下旋轉(zhuǎn)減壓蒸干，用甲醇溶解殘留物并定容至10 mL棕色容量瓶中，過0.45 μm濾膜，根據(jù)保留時間定性，外標(biāo)法定量。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：水-乙睛=70∶30（V/V）；柱溫：30 ℃；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；檢測器：二極管陣列檢測器；波長：190～400 nm。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

準(zhǔn)確吸取不同體積的標(biāo)準(zhǔn)溶液（287.2 mg/L），配制成5個不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品，分別是14.36，28.72，71.8，143.6和287.2 μg/mL，進(jìn)樣20 μL，同一質(zhì)量濃度的溶液連續(xù)進(jìn)樣3次，記錄峰面積，取平均值。以峰面積為縱坐標(biāo)，根皮苷的含量為橫坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 最低檢測限和定量限的測定

將一定質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級稀釋，依次進(jìn)樣，當(dāng)信噪比等于3時所對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為檢測限，當(dāng)信噪比等于10時所對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為定量限。

1.3.6 精密度和回收率

按照“1.3.2 樣品制備”方法，以富士葉片為原料，經(jīng)制備得到樣液，進(jìn)樣20 μL，重復(fù)測定6次，計算根皮苷含量，計算平均值和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD）。吸取一定質(zhì)量濃度的根皮苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液添加到蘋果芽提取液中，進(jìn)液相色譜檢測，計算根皮苷回收率，并做空白對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離條件的優(yōu)化

為了獲得較好的峰形，試用了不同的流動相和檢測波長，最終確定的流動相為水-乙睛=70∶30（V/V），檢測波長275 nm，在這個條件下根皮苷標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖和光譜圖如圖1所示，根皮苷的保留時間為6.847 min。

圖1 根皮苷色譜圖（a）和光譜圖（b）

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測限和定量限

以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，標(biāo)品質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，建立回歸方程：y=33 902.8x- 7 343.45，R2=0.999 9，線性范圍在14.36～287.2 μg/mL，結(jié)果表明，在該試驗條件下，標(biāo)品的質(zhì)量濃度與其峰面積線性關(guān)系良好。按照信噪比等于3計算出檢測限，結(jié)果為1.16 mg/kg；按照信噪比等于10計算出定量限，結(jié)果為3.83 mg/kg。

2.3 精密度檢測

以富士葉片為原料，經(jīng)制備得到樣液，進(jìn)樣20 μL，重復(fù)測定6次，其中根皮苷含量的平均值和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD）結(jié)果見表1。SRSD為0.87%，說明精密度良好。

表1 精密度檢測結(jié)果（n=6）

2.4 加標(biāo)回收率測定

精確吸取0.2，0.5和1.0 mL質(zhì)量濃度為287.2 μg/mL的根皮苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入到富士果皮中，按照1.3.2節(jié)的方法進(jìn)行提取分離上機(jī)分析，計算加標(biāo)回收率，結(jié)果如表2所示。

表2 根皮苷的加標(biāo)回收率結(jié)果

2.5 樣品測定

按照1.3.2節(jié)對樣品進(jìn)行前處理，并進(jìn)液相色譜進(jìn)行分析，每個樣品進(jìn)樣3次，取平均值，富士、秦陽、秦冠、紅星、紅蓋露、中秋王、金世紀(jì)、黃元帥、洼里紅、短枝的不同品種的葉片、果皮和果肉中根皮苷含量如圖2所示。

圖2 10個品種蘋果不同組織中根皮苷含量

由圖2可以看出，10種蘋果不同部位根皮苷含量有很大區(qū)別，葉片的含量比果肉和果皮都高。洼里紅的葉片中含量最高，它的果肉和果皮中也有較高的含量。紅星果肉和果皮中含量最高，金世紀(jì)葉片、果皮和果肉含量最低，但因為它是早熟品種，也被果農(nóng)接納。

3 結(jié)論

建立了蘋果組織中根皮苷的二極管陣列-高效液相色譜檢測方法，采用的流動相為乙睛和水，該方法線性范圍為14.36～287.2 μg/mL，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9，檢測限為1.16 mg/kg，定量限為3.83 mg/kg，回收率為98.48%。該方法采用等度洗脫程序，時間少，分析快，線性范圍較廣，準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，可用于蘋果組織中根皮苷的檢測[13]。

利用該方法分析了富士、秦陽、秦冠、紅星、紅蓋露、中秋王、金世紀(jì)、黃元帥、洼里紅、短枝10種蘋果幼果中根皮苷的含量。結(jié)果表明不同品種根皮苷含量有很大區(qū)別。葉片中的含量明顯高于果肉和果皮。洼里紅的葉片中含量最高，它的果肉和果皮中也有較高的含量。紅星果肉和果皮中含量最高，金世紀(jì)葉片、果皮和果肉含量最低。蘋果葉片根皮苷含量隨著生長周期不同而發(fā)生變化[14]，研究蘋果采摘后葉片中的含量，對于開發(fā)蘋果副產(chǎn)物的綜合利用具有廣闊前景和價值，以蘋果葉作為提取根皮苷的原料，提取高效、安全、無毒的抗氧化性物質(zhì)，在開發(fā)食品抗氧化劑的研制及應(yīng)用方面具有較好的應(yīng)用前景。