劉猛 ，王艷史丹宇章檢明

1. 呂梁學(xué)院生命科學(xué)系（呂梁 033000）；2. 山西省特色植物功能成分工程研究中心（呂梁 033000）；3. 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品科學(xué)研究所（杭州 310016）

核桃，也被稱(chēng)為山核桃和胡桃，是一種利用價(jià)值高的木本類(lèi)植物油作物[1]。作為經(jīng)濟(jì)農(nóng)作物，它既可以食用，也可以用于醫(yī)藥。它所含有的豐富蛋白質(zhì)在水解之后，使得核桃的特性得到提高，同時(shí)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值也得到改善。另外，核桃中含有的酶水解后可以產(chǎn)生多種生物活性肽，可以起到保護(hù)神經(jīng)、改善生理功能的作用，比如學(xué)習(xí)和記憶[2-4]。核桃蛋白是優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，常被用于肉類(lèi)制品的填充物，它可以促進(jìn)脂肪吸附，還能使肉類(lèi)制品蓬松、柔軟、富有彈性[5-7]，核桃中也含有人體所需的必要營(yíng)養(yǎng)元素以及一些微量元素，對(duì)人體健康有積極作用[8]。核桃壓榨出油以后的剩余物質(zhì)即為核桃餅粕[9]，其蛋白質(zhì)含量約為50%，脫去油脂后剩余物質(zhì)中蛋白質(zhì)的量達(dá)到53.89%[10]，可以作為營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、價(jià)格低、不經(jīng)復(fù)雜處理的自然蛋白源[11]。

基金項(xiàng)目：山西省青年科技研究基金（201901D211450），山西省高等學(xué)?？萍紕?chuàng)新項(xiàng)目（2019L0948），呂梁市引進(jìn)高層次科技人才重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（2019104），呂梁市引進(jìn)高層次科技人才專(zhuān)業(yè)科技創(chuàng)新平臺(tái)建設(shè)項(xiàng)目（2018-21-11）

易建華等[12]通過(guò)用蛋白酶水解核桃蛋白，得出復(fù)合酶對(duì)核桃蛋白有明顯作用的結(jié)論。姜莉等[13]通過(guò)用胰蛋白酶水解核桃蛋白，對(duì)核桃多肽進(jìn)行提取。齊西婷等[14]通過(guò)中性蛋白酶來(lái)實(shí)現(xiàn)粗蛋白的水解，以VC形成對(duì)比，對(duì)其水解產(chǎn)物的特化性用4種方法來(lái)評(píng)定。通過(guò)進(jìn)行一些核桃多肽的制備，對(duì)其活性功能的研究以及對(duì)一些產(chǎn)品的創(chuàng)造等途徑，對(duì)深入研究它的加工以及增強(qiáng)人們?cè)诂F(xiàn)實(shí)生活中對(duì)它的營(yíng)養(yǎng)需求都具有重要的意義[15]。

試驗(yàn)以核桃粕為原料，運(yùn)用堿溶酸沉提取法提取核桃餅粕蛋白，利用堿性蛋白酶酶解制得核桃餅粕酶解液及核桃餅粕分離蛋白酶解液，對(duì)比核桃餅粕（walnut cake，WC）與核桃分離蛋白（walnut cake protein，WCP）酶解產(chǎn)物的抗氧化活性，為我國(guó)的核桃相關(guān)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

P0010S BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（碧云天生物技術(shù)）；堿性蛋白酶（酶活1×105U/g，河南安銳生物科技有限公司）；氫氧化鈉、鹽酸、硫酸亞鐵、水楊酸、鄰苯三酚、抗壞血酸、過(guò)氧化氫、三（羥甲基）氨基甲烷、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼、鐵氰化鉀、三氯化鐵、三氯乙酸（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

DK-98-II恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；SC-04低速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；VIS-723N可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京瑞利分析儀器有限公司）；FA2104S電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；SB-3200 DTDN超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；EPOCH2酶標(biāo)儀（美國(guó)伯騰儀器有限公司）；PHBJ-260 pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 核桃餅粕預(yù)處理

將粗餅粕進(jìn)行粉碎，過(guò)0.180 mm篩，制得核桃餅粕。

1.3.2 核桃餅粕分離蛋白的制備[16]

稱(chēng)取100 g WC，將其放在2 000 mL燒杯中，同時(shí)注入2 000 mL蒸餾水，充分混合。為使其pH達(dá)到9.0，向溶液中加入配制好的1 mol/L的NaOH，充分溶解，并將超聲波清洗器調(diào)節(jié)為50 ℃，超聲提取1 h，待超聲完成，室溫下放置30 min，將離心機(jī)調(diào)節(jié)為3 000 r/min，離心20 min。離心完成后，將上層液體與配制好的1 mol/L鹽酸混勻，使pH為4.5，用玻璃棒充分混合，放置30 min，使用離心機(jī)以3 000 r/min離心20 min，取下層沉積物加入蒸餾水中和至中性，再以3 000 r/min離心20 min，操作完成后將其沉積物分離出來(lái)，該沉積物即為核桃餅粕分離蛋白。

1.3.3 核桃餅粕分離蛋白含量的測(cè)定

采用BCA法[17]測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

1.3.4 核桃餅粕及核桃餅粕分離蛋白酶解物的制備[18]

以核桃渣處理后的核桃餅粕為原材料，利用堿性蛋白酶水解，通過(guò)堿溶酸沉法完成分離蛋白的提取。酶水解的全程要嚴(yán)格控制蛋白酶的最適反應(yīng)條件。分別稱(chēng)取5 g的WC和WCP，加入適量蒸餾水，配制5%的WC和WCP溶液，攪拌均勻，將其置于90 ℃水浴鍋水浴15 min，待水浴完成，用1 mol/L的NaOH將其pH調(diào)為9.5，依照堿性蛋白酶的最適添加量按3%加入酶，將水浴鍋溫度調(diào)節(jié)為60 ℃，將配制好的液體置于水浴鍋中，在整個(gè)水浴的過(guò)程中使用滴管不斷添加1 mol/L的NaOH，使該液體的pH一直保持在9.5，保證水解處于最適pH。在該蛋白酶適宜條件下酶解2 h，水解完成后，取該液體放在100 ℃水浴鍋中15 min，進(jìn)行滅酶處理。待其溫度為室溫后將溶液pH調(diào)至7.0，使用離心機(jī)以4 000 r/min離心5 min，離心完成后取上層清液，即為酶解產(chǎn)物。

1.3.5 酶解物體外抗氧化活性測(cè)定[19-20]

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

分別取2 mL 1 mg/mL的WC與WCP樣品酶解液于6支10 mL試管中，依次添加2 mL配制好的0.1 mmol/L的DPPH溶液，混合搖勻，在避光處與室內(nèi)溫度平衡靜置30 min，用無(wú)水乙醇作為空白對(duì)照，測(cè)定其波長(zhǎng)在517 nm處的吸光度A1；DPPH換為2 mL無(wú)水乙醇，其他不變，測(cè)定吸光度A2；用2 mL無(wú)水乙醇取代原反應(yīng)液，檢測(cè)其吸光度A0。DPPH·清除率按式（1）計(jì)算。

1.3.5.2 超氧陰離子自由基O2-清除率的測(cè)定

取6支10 mL試管，分別加入4.5 mL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（25 ℃，pH 8.2），然后分別加入1 mL 1 mg/mL的WC及WCP樣品酶解液、0.4 mL 50 mmol/L鄰苯三酚溶液，充分振蕩，待反應(yīng)3 min后，即刻滴加100 μL 3%抗壞血酸結(jié)束反應(yīng)，然后馬上取1 mL該溶液至試管中，加入4 mL蒸餾水調(diào)勻，以蒸餾水作為空白對(duì)照，測(cè)定其波長(zhǎng)為325 nm處的吸光度A1；用0.4 mL蒸餾水取代配制好的鄰苯三酚溶液，完成對(duì)吸光度A2的測(cè)定；將樣品原液用1 mL蒸餾水來(lái)替換，測(cè)得吸光度A0。O2-·清除率按式（2）計(jì)算。

1.3.5.3 羥基自由基·OH清除率的測(cè)定

取10 mL試管，向其中分別加入2 mL配好的9 mmol/L硫酸亞鐵溶液、2 mL 9 mmol/L乙醇-水楊酸溶液，然后再分別加入2 mL樣品酶解液為1 mg/mL的WC及WCP和2 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液，分別于6支試管中，充分振蕩，置于37 ℃水浴鍋中30 min，以蒸餾水作為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)為510 nm處對(duì)其吸光度A1進(jìn)行測(cè)定；H2O2換為2 mL的蒸餾水，完成吸光度A2的測(cè)定；將待測(cè)酶解液用2 mL的蒸餾水替換，測(cè)定吸光度A0?！H清除率按式（3）計(jì)算。

1.3.5.4 總還原力的測(cè)定

在6支10 mL試管中分別加入2 mL 1 mg/mL的WC與WCP樣品酶解液，然后分別加入2 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.6），充分混勻，滴加2 mL濃度為1%的鐵氰化鉀溶液，搖勻，在50 ℃水浴鍋內(nèi)保溫20 min，使其快速降溫直至達(dá)到室內(nèi)溫度，為使反應(yīng)停止，向試管中加入2 mL 10%三氯乙酸，用離心機(jī)在3 000 r/min下離心10 min。分離2 mL上層清液，同時(shí)滴加0.4 mL 0.1%三氯化鐵溶液和2 mL蒸餾水，充分溶解，達(dá)到室內(nèi)溫度靜置10 min，用蒸餾水作為參照，在波長(zhǎng)為700 nm處測(cè)定吸光度A，其吸光度隨著還原能力的變化而變化。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)及繪圖

數(shù)據(jù)采用Origin 8.0軟件進(jìn)行計(jì)算繪圖。采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，one-way ANOVA進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)以x±s表示，p＜0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 核桃餅粕分離蛋白的含量的測(cè)定

如圖1所示，BCA法蛋白濃度測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y=0.897 37x+0.078 46，R2=0.996 78。其核桃餅粕分離蛋白中蛋白質(zhì)含量為58%。

圖1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.2 酶解產(chǎn)物體外抗氧化活性的測(cè)定

WC和WCP的酶解產(chǎn)物分別對(duì)DPPH、O2-和·OH的清除能力結(jié)果如圖2所示。

圖2 WC和WCP的酶解產(chǎn)物分別對(duì)DPPH、O2-和·OH的清除能力

2.2.1 DPPH清除率

如圖2所示，堿性蛋白酶水解WC與WCP所得到的酶解液對(duì)DPPH·的清除作用差異相對(duì)很小。直接水解的WC酶解液清除DPPH·的能力為71.86%，比WCP酶解液高；經(jīng)過(guò)提取蛋白再水解的WCP酶解液DPPH清除率為68.33%，相對(duì)較低一些。由此表明堿性蛋白酶直接酶解WC的酶解液的DPPH清除作用較強(qiáng)。出現(xiàn)這一結(jié)果可能是在水解的過(guò)程中伴隨時(shí)間的推移，氨基酸殘基的抗氧化活性不時(shí)顯露出來(lái)，抗氧化活性也隨之表現(xiàn)出來(lái)，當(dāng)水解達(dá)到一定水平時(shí)，抗氧化活性的肽也被再次水解，破壞了維持其抗氧化活性的結(jié)構(gòu)，從而使得抗氧化能力變?nèi)酢?/p>

2.2.2 超氧陰離子自由基O2-清除率

如圖2所示，經(jīng)蛋白酶水解WC的O2-清除率為24.11%，而經(jīng)堿溶酸沉提取蛋白再水解的WCP酶解液中，堿性蛋白酶水解WCP的O2-·清除率較高，其結(jié)果為27.23%。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能是經(jīng)堿溶酸沉提取蛋白后餅粕中其他物質(zhì)減少，有利于水解，從而對(duì)O2-的清除作用增強(qiáng)。從清除O2-角度出發(fā)，堿性蛋白酶酶解WCP的清除作用高于堿性蛋白酶酶解WC的作用。

2.2.3 羥基自由基·OH清除率

如圖2所示，利用堿性蛋白酶水解WC與WCP，得到的WC酶解液與WCP酶解液對(duì)·OH清除率分別為17.32%和18.11%，WCP酶解液比WC酶解液對(duì)·OH清除作用要強(qiáng)，不經(jīng)過(guò)提取蛋白直接水解的WCP與經(jīng)過(guò)提取蛋白再酶解的WC對(duì)·OH的清除作用差異較小。由于蛋白質(zhì)經(jīng)堿性蛋白酶水解后會(huì)生成大量的疏水性氨基酸，自由基容易與疏水性氨基酸組合從而使其具有良好的·OH清除能力，所以經(jīng)過(guò)堿性蛋白酶水解的物質(zhì)對(duì)·OH清除率比較高。

2.2.4 總還原力的的測(cè)定

如圖3所示，堿性蛋白酶直接酶解WC的總還原力低于WCP。堿性蛋白酶水解WC與WCP得到的酶解液對(duì)總還原力的清除作用差異較小，其經(jīng)堿溶酸沉作用提取蛋白再水解的WCP酶解液總還原力低于沒(méi)有經(jīng)過(guò)分離蛋白而水解的WC酶解液。先經(jīng)蛋白酶水解再測(cè)定WC與WCP，WC的總還原力相對(duì)WCP較低，吸光度為0.612；先提取蛋白再進(jìn)行水解的WCP酶解液中，其蛋白酶水解WCP的總還原力較高，吸光度為0.702。

圖3 WC和WCP酶解產(chǎn)物的總還原力

3 結(jié)論

利用堿性蛋白酶酶解制得核桃餅粕酶解液及核桃餅粕分離蛋白酶解液，通過(guò)對(duì)·OH、O2-、DPPH自由基清除能力及總還原力的測(cè)定，結(jié)果表明，經(jīng)堿溶酸沉先提取核桃餅粕中的蛋白質(zhì)，獲得核桃餅粕分離蛋白后，酶解液的抗氧化活性略高于直接酶解核桃餅粕的酶解液，證明經(jīng)過(guò)堿性蛋白酶酶解后所得的產(chǎn)物有良好的抗氧化功能。該試驗(yàn)為核桃蛋白的深加工和利用、開(kāi)發(fā)相關(guān)功能性食品奠定了良好的應(yīng)用前景基礎(chǔ)。