魏穎，包海鷹*，劉穎，和生

1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院（長(zhǎng)春 130118）；2. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)藥用菌物資源及其開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)研究室（長(zhǎng)春 130118）

關(guān)黃柏（Phellodendron amurenseRupr.）學(xué)名為黃檗，是蕓香科落葉喬木，在我國(guó)吉林、黑龍江、遼寧等省及內(nèi)蒙古地區(qū)均有分布[1]，其干燥樹(shù)皮是我國(guó)的傳統(tǒng)中藥黃柏的來(lái)源之一。2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》中記載，關(guān)黃柏以其干燥樹(shù)皮入藥，是清熱燥濕的代表藥[2]。藥理研究表明關(guān)黃柏具有抗氧化、抗炎鎮(zhèn)痛和抗痛風(fēng)等作用[3-5]；據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，關(guān)黃柏還可用作開(kāi)胃性食品添加劑的原材料[6]，可在食品的原有味覺(jué)基礎(chǔ)上增加清涼、清爽以及清凈感等，可應(yīng)用于甜點(diǎn)類(lèi)和飲品類(lèi)等，其中總黃酮類(lèi)物質(zhì)發(fā)揮重要作用[1]。吉林省靖宇縣地區(qū)的民眾有將關(guān)黃柏葉進(jìn)行制茶泡水飲用的習(xí)俗，長(zhǎng)期飲用，可以達(dá)到降血糖的功效[1]。

中藥關(guān)黃柏在我國(guó)使用歷史悠久，但是關(guān)于關(guān)黃柏樹(shù)的葉子及其炮制品的抗氧化活性對(duì)比研究未見(jiàn)報(bào)道。據(jù)文獻(xiàn)記載，關(guān)黃柏樹(shù)的樹(shù)葉或果實(shí)中富含黃酮類(lèi)物質(zhì)，樹(shù)皮富含生物堿[7]。試驗(yàn)對(duì)關(guān)黃柏葉及其不同炮制品進(jìn)行總黃酮和總生物堿含量測(cè)定。黃酮類(lèi)化合物具有良好的抗氧化活性[8-10]，對(duì)比研究關(guān)黃柏葉及其不同炮制品的抗氧化活性，為關(guān)黃柏葉資源的可持續(xù)開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)，并為關(guān)黃柏葉及不同炮制品作為新型食品能源提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

關(guān)黃柏葉（均采摘自吉林省靖宇縣東坪苗木種植專(zhuān)業(yè)合作社的關(guān)黃柏人工栽培基地的矮化和灌木化的關(guān)黃柏）；關(guān)黃柏葉不同炮制品（實(shí)驗(yàn)室炮制獲得；發(fā)酵炒制的關(guān)黃柏葉是指關(guān)黃柏原葉經(jīng)過(guò)日曬、萎凋、發(fā)酵、揉捻、團(tuán)揉、炒干而得；炒制的關(guān)黃柏葉是指關(guān)黃柏原葉經(jīng)過(guò)日曬、殺青、揉捻、團(tuán)揉、炒干而得）；關(guān)黃柏藥材（樹(shù)皮，購(gòu)自康美藥業(yè)股份有限公司，均由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)包海鷹教授鑒定）。

ELX800酶標(biāo)儀（廣州市番禺區(qū)華鑫科技有限公司），F(xiàn)A2104-N電子分析天平（上海精其儀器有限公司），HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州市江南實(shí)驗(yàn)儀器廠(chǎng)）。

鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品（上海源葉生物科技有限公司）；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（上海源葉生物科技有限公司）；維生素C標(biāo)準(zhǔn)品（天津百倫斯生物技術(shù)有限公司）；ABTS（上海金穗生物科技有限公司）；DPPH（上海金穗生物科技有限公司）；其他試劑皆為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總黃酮含量測(cè)定方法

參照文獻(xiàn)[11-13]方法測(cè)定，稍作修改。稱(chēng)取5.5 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，用蒸餾水溶解制成550 μg/mL測(cè)定液。分別吸取不同體積的標(biāo)準(zhǔn)品溶液于10 mL容量瓶中，各加入1 mL的5%亞硝酸鈉溶液，1 mL的10%硝酸鋁溶液，靜置8 min，加2 mL的10 g/100 mL氫氧化鈉溶液，用蒸餾水定容。在510 nm處測(cè)定吸光度。以蘆丁質(zhì)量濃度（mg/mL）和吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算回歸方程。

樣品總黃酮含量按上述方法在510 nm處測(cè)量吸光度，計(jì)算樣品中總黃酮含量。

1.2.2 總生物堿測(cè)定方法

按照文獻(xiàn)[14]方法，稍作修改。稱(chēng)取0.024 4 g鹽酸小檗堿，用100 mL pH 4.0枸櫞酸-磷酸氫二鈉緩沖液溶解。量取2 mL小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品液，加入2 mL溴酚藍(lán)溶液，制成標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定液。分別吸取不同體積的標(biāo)準(zhǔn)品溶液于10 mL容量瓶中，加緩沖液定容至10 mL，移取2 mL至分液漏斗中，加2 mL溴酚藍(lán)溶液，用10 mL氯仿振蕩提取5 min。取氯仿層，用濾紙將氯仿層過(guò)濾至25 mL容量瓶中，用氯仿提取3次，每次5 mL，加氯仿定容。在417 nm處測(cè)量吸光度，以吸收度為縱坐標(biāo)，小檗堿質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，并獲得回歸方程。

樣品總生物堿含量測(cè)定：精密稱(chēng)取樣品0.25 g，按上述方法測(cè)定吸收度，計(jì)算樣品中總生物堿含量。

1.2.3 抗氧化活性研究方法

1.2.3.1 對(duì)DPPH自由基的清除率的測(cè)定

DPPH自由基是由于其較穩(wěn)定，被廣泛應(yīng)用于測(cè)定自由基的清除能力[15]，其無(wú)水乙醇溶液呈紫色[16]。

參照文獻(xiàn)[17-18]方法測(cè)定，對(duì)此稍作修改，將各樣品稀釋成不同質(zhì)量濃度（0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mg/mL）樣品，取1 mL于刻度試管中，加入1 mL DPPH-乙醇溶液，混合均勻，在室溫下靜置30 min，測(cè)定517 nm下的吸光度，以維生素C作對(duì)照。根據(jù)式（1）計(jì)算清除率。

式中：Ai為樣品的吸光度；Aj為無(wú)水乙醇溶液代替DPPH-乙醇溶液的吸光度；A0為空白樣品的吸光度。

1.2.3.2 對(duì)ABTS自由基清除率的測(cè)定

抗氧化劑與ABTS自由基配對(duì)后，使藍(lán)綠色的溶液褪色，退色越明顯則表示抗氧化劑的抗氧化能力越強(qiáng)[19]。

參照文獻(xiàn)[19]方法測(cè)定，稍作修改。將50 mL 7.4 mmol/mL的ABTS和50 mL 2.6 mmol/mL的過(guò)硫酸鉀溶液混合，將其至于暗處放置12～16 h，制成ABTS儲(chǔ)備液。用60%乙醇稀釋?zhuān)箖?chǔ)備液吸光度在734 nm為0.70± 0.02，獲得ABTS工作液。取1 mL不同濃度樣品溶液，加入6 mL ABTS工作液，室溫下暗處?kù)o置6 min，在734 nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度，以維生素C作對(duì)照。根據(jù)式（2）計(jì)算清除率。

式中：Ai為樣品吸光度，Aj為蒸餾水代替ABTS工作液吸光度；A0為空白樣品吸光度。

1.2.3.3 對(duì)羥基自由基清除率的測(cè)定

羥基自由基（·OH）比較活潑，可以損傷如核酸、脂質(zhì)或氨基酸等生物大分子[20]。

參照文獻(xiàn)[21-22]方法測(cè)定，稍作修改。取2 mL不同濃度樣品溶液，加入2 mL的9 mmol/L FeSO4溶液，2 mL的9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液及2 mL的8.8 mmol/L H2O2溶液，37 ℃下反應(yīng)30 min，510 nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度，以維生素C作對(duì)照，按式（3）計(jì)算清除率。

式中：Ai為樣品的吸光度；Aj為無(wú)H2O2溶液的吸光度；A0為空白樣品的吸光度。

1.2.3.4 對(duì)超氧陰離子自由基清除率的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[23-24]方法測(cè)定，稍作修改。分別取1.0 mL不同濃度樣品溶液于試管中，加入4.5 mL 50 mmol/L pH 8.2的Tris-HCl緩沖溶液，加入0.2 mL鄰苯三酚溶液后搖勻，在37 ℃下的水浴15 min，加入1.0 mL濃鹽酸。在299 nm處測(cè)量吸光度，以維生素C作對(duì)照，按式（4）計(jì)算清除率。

式中：A0為蒸餾水吸光度；Ai為樣品溶液的吸光度。

1.2.3.5 鐵原子還原能力的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[13]方法測(cè)定，稍作修改。分別取0.5 mL不同濃度樣品溶液，加入3 mL（0.2 mol/L、pH 6.8）磷酸鹽緩沖液，3 mL的10 mg/mL鐵氰化鉀，混勻后于50 ℃水浴20 min，冷卻后加入3 mL的100 mg/mL三氯乙酸，混勻后放置30 min。離心，移取2.5 mL上清液，加入3 mL蒸餾水及0.5 mL的1 mg/mL FeCl3，靜置10 min，于700 nm處測(cè)定吸光度，以維生素C作對(duì)照，按式（5）計(jì)算還原能力。

式中：Ai為樣品溶液吸光度；A0空白樣品吸光度。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS 26.0分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，p＜0.05為差異具有顯著性，p＜0.01為差異具有極顯著性。用Graphpad prism 8.0軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品總黃酮含量測(cè)定結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)品溶液按照1.2.1的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算的回歸方程Y=1.250 2X+0.000 4，r=0.999 3，表明蘆丁對(duì)照品在0～0.004 mg/mL有良好線(xiàn)性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖1，樣品總黃酮含量結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

由表1可知，與關(guān)黃柏樹(shù)皮的總黃酮含量相比，關(guān)黃柏原葉、發(fā)酵的關(guān)黃柏葉總黃酮含量和炒制的關(guān)黃柏葉總黃酮含量極顯著升高，其中發(fā)酵炒制的關(guān)黃柏葉的總黃酮含量最高，樣品中的總黃酮含量順序?yàn)椋喊l(fā)酵炒制的關(guān)黃柏葉＞關(guān)黃柏原葉＞炒制的關(guān)黃柏葉＞關(guān)黃柏樹(shù)皮。

表1 樣品中總黃酮含量測(cè)定結(jié)果

2.2 樣品總生物堿含量測(cè)定結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)品溶液按照1.2.2的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，求得回歸方程為Y=145.66X-0.007 4，r=0.999 1，表明生物堿質(zhì)量濃度在0.000 5～0.003 mg/mL有良好線(xiàn)性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖2，樣品總生物堿含量見(jiàn)表2。

圖2 小檗堿標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

由表2可知，與關(guān)黃柏樹(shù)皮的總含量相比，關(guān)黃柏原葉的總生物堿顯著降低（p＜0.05）、發(fā)酵的關(guān)黃柏葉總黃酮含量和炒制的關(guān)黃柏葉總黃酮含量極顯著降低（p＜0.01），其中發(fā)酵炒制的關(guān)黃柏葉的總黃酮含量最低，樣品中的總生物堿含量順序?yàn)殛P(guān)黃柏樹(shù)皮＞關(guān)黃柏原葉＞炒制的關(guān)黃柏葉＞發(fā)酵炒制的關(guān)黃柏葉。

表2 樣品中總生物堿含量測(cè)定結(jié)果

2.3 抗氧化活性結(jié)果

2.3.1 對(duì)DPPH自由基清除能力測(cè)定結(jié)果

由圖3可知，在0.2～1.0 mg/mL質(zhì)量濃度內(nèi)，不同樣品和維生素C對(duì)DPPH自由基的清除率隨質(zhì)量濃度升高而逐漸增強(qiáng)。其中，發(fā)酵炒制的關(guān)黃柏葉清除DPPH自由基的能力最強(qiáng)，在1.0 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率為80.25%，高于其他3個(gè)樣品，與維生素C對(duì)DPPH自由基的清除率最接近。

圖3 不同質(zhì)量濃度樣品與維生素C對(duì)DPPH自由基的清除率

2.3.2 對(duì)ABTS自由基清除能力測(cè)定結(jié)果

由圖4可知，在0.2～1.0 mg/mL質(zhì)量濃度內(nèi)，不同樣品和維生素C對(duì)DPPH自由基的清除率隨質(zhì)量濃度升高而逐漸增強(qiáng)。其中，發(fā)酵炒制的關(guān)黃柏葉對(duì)ABTS自由基的清除能力最強(qiáng)，在1.0 mg/mL時(shí)，對(duì)ABTS自由基的清除率為94.35%，高于其他3個(gè)樣品，與維生素C對(duì)ABTS自由基的清除率最接近。

圖4 不同質(zhì)量濃度樣品與維生素C對(duì)ABTS自由基的清除率

2.3.3 對(duì)羥基自由基清除能力測(cè)定結(jié)果

由圖5可知，在0.2～1.0 mg/mL質(zhì)量濃度內(nèi)，不同樣品和維生素C對(duì)羥基自由基的清除率隨質(zhì)量濃度升高而逐漸增強(qiáng)。其中，發(fā)酵炒制的關(guān)黃柏葉對(duì)羥基自由基的清除能力最強(qiáng)，在1.0 mg/mL時(shí)，對(duì)羥基自由基的清除率為92.27%，高于其他3個(gè)樣品，與維生素C對(duì)羥基自由基的清除率最接近。

圖5 不同質(zhì)量濃度樣品與維生素C對(duì)羥基自由基的清除率

2.3.4 對(duì)超氧陰離子自由基清除能力測(cè)定結(jié)果

由圖6可知，在0.2～1.0 mg/mL質(zhì)量濃度內(nèi)，不同樣品和維生素C對(duì)超氧陰離子自由基的清除率隨質(zhì)量濃度升高而逐漸增強(qiáng)。其中，發(fā)酵炒制的關(guān)黃柏葉對(duì)超氧陰離子的清除能力最強(qiáng)，在1.0 mg/mL時(shí)，對(duì)超氧陰離子自由基的清除率為89.24%，高于其他3個(gè)樣品，與維生素C對(duì)超氧陰離子自由基的清除率最接近。

圖6 不同質(zhì)量濃度樣品與維生素C對(duì)超氧陰離子自由基的清除率

2.3.5 對(duì)鐵原子的還原能力測(cè)定結(jié)果

由圖7可知，在0.2～1.0 mg/mL質(zhì)量濃度內(nèi)，不同樣品和維生素C對(duì)鐵原子的還原力隨質(zhì)量濃度升高而逐漸增強(qiáng)。其中，發(fā)酵炒制的關(guān)黃柏葉對(duì)鐵原子的還原能力最強(qiáng)，在1.0 mg/mL時(shí)，對(duì)鐵原子的還原能力為0.713，高于其他3個(gè)樣品，與維生素C對(duì)鐵原子的還原能力最接近。

圖7 不同質(zhì)量濃度樣品與維生素C對(duì)鐵原子的還原能力

3 結(jié)論

試驗(yàn)對(duì)關(guān)黃柏葉及其不同炮制品進(jìn)行總黃酮和總生物堿含量對(duì)比測(cè)定，以關(guān)黃柏樹(shù)皮作為對(duì)照，總黃酮含量順序?yàn)榘l(fā)酵炒制的關(guān)黃柏葉＞關(guān)黃柏原葉＞炒制的關(guān)黃柏葉＞關(guān)黃柏樹(shù)皮。總生物堿含量順序?yàn)殛P(guān)黃柏樹(shù)皮＞關(guān)黃柏原葉＞炒制的關(guān)黃柏葉＞發(fā)酵炒制的關(guān)黃柏葉。發(fā)酵炒制的關(guān)黃柏葉中總黃酮含量，是關(guān)黃柏樹(shù)皮的3.19倍，關(guān)黃柏原葉的1.55倍；而發(fā)酵炒制的關(guān)黃柏葉中的總生物堿含量是關(guān)黃柏樹(shù)皮的0.53倍，關(guān)黃柏原葉的0.705倍，說(shuō)明發(fā)酵炒制可以增加關(guān)黃柏葉中總黃酮含量，降低總生物堿含量。

采用DPPH自由基、ABTS自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基的清除率和對(duì)鐵原子的還原能力對(duì)關(guān)黃柏葉及其不同炮制品和關(guān)黃柏樹(shù)皮進(jìn)行抗氧化活性對(duì)比評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，關(guān)黃柏原葉、發(fā)酵炒制的關(guān)黃柏葉、炒制的關(guān)黃柏葉及關(guān)黃柏樹(shù)皮均具有抗氧化活性，并且抗氧化活性隨著樣品質(zhì)量濃度增加而增強(qiáng)。在5種抗氧化活性試驗(yàn)中，發(fā)酵炒制的關(guān)黃柏葉的抗氧化活性均為最強(qiáng)，與維生素C最接近，其他樣品的抗氧化活性順序?yàn)殛P(guān)黃柏原葉＞炒制的關(guān)黃柏葉＞關(guān)黃柏樹(shù)皮，說(shuō)明發(fā)酵炒制方式可以增加關(guān)黃柏葉中的總黃酮含量，使其抗氧化活性增強(qiáng)，針對(duì)發(fā)酵炒制后關(guān)黃柏葉中的黃酮類(lèi)含量增加的問(wèn)題有待進(jìn)一步研究。

結(jié)合關(guān)黃柏葉及其不同炮制品富含黃酮類(lèi)化合物并且具有良好的抗氧化活性，對(duì)關(guān)黃柏葉及其不同炮制品進(jìn)行食用或藥用，不僅能達(dá)到提高機(jī)體的抗氧化能力、降低血糖等多種功效，并且能代替關(guān)黃柏樹(shù)皮，避免關(guān)黃柏樹(shù)木遭到破壞，使關(guān)黃柏葉資源可持續(xù)再生；關(guān)黃柏葉及其不同炮制品也可作為新型食品添加劑，起到開(kāi)胃健脾的作用。試驗(yàn)說(shuō)明關(guān)黃柏葉及其不同炮制品具有廣闊市場(chǎng)前景，可將人工栽培和矮化的關(guān)黃柏樹(shù)的葉子合理開(kāi)發(fā)和利用。