王升貴，馬榮鋒

九仙尊霍山石斛股份有限公司（上海 201199）

霍山石斛屬蘭科石斛屬多年生草本植物，主要分布于安徽省霍山縣，屬于國家一級(jí)瀕危藥用植物。霍山石斛的食用歷史比較悠久，始記于《神農(nóng)本草經(jīng)》：“味甘，平。主傷中，除痹，下氣，補(bǔ)五臟虛勞、羸瘦，強(qiáng)陰。久服，厚腸胃、輕身、延年”?；羯绞喾N活性物質(zhì)，其中霍山石斛多糖是其標(biāo)志性成分，它具有增強(qiáng)免疫力[1]、抗氧化[2]、保護(hù)肝臟[3-4]、抗腫瘤[5]、降血脂[6]、降血糖[7]、抗疲勞[8]、清咽[9]、抗炎[10-11]、增強(qiáng)腸道生理屏障和生化屏障等作用[12]。關(guān)于多糖提取工藝方面，有學(xué)者使用響應(yīng)面法優(yōu)化鐵皮石斛多糖閃式提取工藝[13]、微波輔助法提取工藝[14]、復(fù)合酶法提取工藝[15]、水提法提取工藝[16-17]、超聲法提取工藝研究[18]等。另有研究報(bào)道響應(yīng)面法優(yōu)化回流水提法霍山石斛多糖[19-20]和超聲波提取工藝[21]?？v觀這些多糖提取工藝，主要是在傳統(tǒng)工藝上進(jìn)行優(yōu)化。此次試驗(yàn)采用創(chuàng)新的提取技術(shù)，利用響應(yīng)面法對(duì)霍山石斛多糖的超微低溫萃取法提取工藝進(jìn)行研究與優(yōu)化，得到最佳工藝條件，以期為霍山石斛的生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

霍山石斛（Dendrobium huoshanenseC.Z. Tang & S.J. Cheng）鮮條，由九仙尊霍山石斛股份有限公司提供。鑒定人為中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所郭寶林研究員。

葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品，Mr=50 000，中國藥品生物制品檢定所；苯酚、濃硫酸、無水乙醇等均為分析純，市售；植物復(fù)合酶，寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司；蒸餾水，自制。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，金壇國勝試驗(yàn)儀器廠；GZX-9070MBE電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海標(biāo)儀儀器有限公司；FA2204B分析天平，上海升隆電子科技有限公司；JS39D-250多功能食品加工機(jī)（攪拌機(jī)），蘇泊爾專賣店；紫外可見分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 超微低溫萃取工藝流程

霍山石斛鮮條→超微萃取→固液分離→低溫濃縮→低溫連續(xù)薄膜干燥→粉碎

1.2.2 多糖含量測定

采用苯酚-硫酸法測定樣品的多糖含量，多糖含量越高說明提取率越高。準(zhǔn)確量取2 mL定容的多糖提取液，置15 mL離心管中，加入無水乙醇至一定體積分?jǐn)?shù)，搖勻，于4 ℃冷藏一定時(shí)間，取出，離心（轉(zhuǎn)速4 000 r/min）20 min，棄去上清液，沉淀加80%乙醇洗滌2次，每次8 mL，離心，棄去上清液，沉淀加熱水溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，冷卻，搖勻。準(zhǔn)確量取1.0 mL供試品溶液，置具塞試管中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)和式（1）計(jì)算多糖提取率。

式中：X為樣品中粗多糖提取率（以無水葡萄糖計(jì)），mg/g；C為測試樣品的多糖質(zhì)量濃度，mg/L；M為樣品質(zhì)量，g；V1為樣品提取液定容總體積，mL；V2為沉淀粗多糖定容后體積，mL；V3為樣品測定液總體積，mL；V4為供沉淀多糖移取體積，mL；V5為樣品測定移取體積，mL。

1.2.3 響應(yīng)面分析法優(yōu)化霍山石斛提取工藝

根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取超微研磨細(xì)度（X1）、內(nèi)循環(huán)時(shí)間（X2）、料液比（X3）3個(gè)因素，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法進(jìn)行工藝優(yōu)化。通過Design Expert 8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到霍山石斛超微低溫萃取的最優(yōu)工藝參數(shù)。因素水平分析選取，見表1。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)的因素及編碼值

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果，見表2。

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果

2.2 二次回歸模型的擬合及方差分析

對(duì)表2的結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面二次回歸模型擬合，方差分析結(jié)果見表3。結(jié)果表明，當(dāng)置信度為95%時(shí)，內(nèi)循環(huán)時(shí)間和交互項(xiàng)X1X3、X2X3對(duì)Y影響不明顯。擬合的二次模型為：Y=59.62+1.69X1+0.46X2+1.10X3-1.48X1X2-0.25X1X3-0.50X2X3+0.15X12+2.50×10-3X22+ 0.28X32。方差結(jié)果顯示，該模型的一次項(xiàng)X1、X3的影響極顯著（p＜0.01），這表明超微研磨細(xì)度和料液比2個(gè)因素均與霍山石斛超微低溫萃取的多糖提取率高低有直接關(guān)系，是多糖超微低溫萃取的主要限制因子，其較小的變化可引起多糖提取率相當(dāng)大的改變；超微研磨細(xì)度與內(nèi)循環(huán)時(shí)間的相互作用對(duì)霍山石斛多糖提取率的影響同樣達(dá)到極顯著水平（p＜0.01）。而X1X3、X2X3、X12、X22、X32的影響不明顯，說明超微研磨細(xì)度與料液比、內(nèi)循環(huán)時(shí)間與料液比的相互作用對(duì)霍山石斛多糖提取率的高低無顯著影響。而且，失擬項(xiàng)的p為0.134 0，沒有達(dá)到顯著水平，說明非試驗(yàn)因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響不大。因此，所擬合的二次模型信任度高，能夠較好地解釋Y的數(shù)據(jù)群，該模型的決定系數(shù)R2=0.908，表明模型回歸擬合較好。多糖提取率的預(yù)測值和實(shí)際值之間有較好的擬合度，說明該模型較適合霍山石斛超微低溫萃取工藝優(yōu)化的篩選。

表3 回歸模型的方差分析

2.3 響應(yīng)因子水平的優(yōu)化

響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值Y對(duì)應(yīng)于試驗(yàn)因素X1、X2、X3所構(gòu)成的三維空間的曲面圖及其在二維平面上的等高線圖，其可以直觀地反映各因素及它們之間的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。將2個(gè)因素固定在零水平，利用Design Expert 8.0.6軟件可作出另外2種因素交互作用的響應(yīng)曲面圖及其等高線圖，結(jié)果見圖1～圖3。從各圖中的曲面變化形式的陡峭趨勢(shì)，可得出超微研磨細(xì)度與內(nèi)循環(huán)時(shí)間的相互作用對(duì)霍山石斛多糖提取率有較明顯的影響。根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)最優(yōu)值預(yù)測方法，預(yù)測出霍山石斛多糖超微低溫萃取的提取率的最大值64.102%，各單因素最優(yōu)值分別是超微研磨細(xì)度50.000 μm、內(nèi)循環(huán)時(shí)間5.000 s，料液比1∶30（g/mL）。

圖1 X1X2相互作用對(duì)霍山石斛多糖提取率影響的響應(yīng)面圖譜（X1=超微研磨細(xì)度，X2=內(nèi)循環(huán)時(shí)間）

圖3 X2X3相互作用對(duì)霍山石斛多糖提取率影響的響應(yīng)面圖譜（X2=內(nèi)循環(huán)時(shí)間，X3=料液比）

2.4 最佳提取工藝的驗(yàn)證

根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)最優(yōu)值預(yù)測方法，預(yù)測出霍山石斛超聲波提取的最大提取率64.102%，為了進(jìn)一步驗(yàn)證該試驗(yàn)結(jié)果的可性度，依據(jù)最佳條件進(jìn)行試驗(yàn)，為利于試驗(yàn)操作，選取超微研磨細(xì)度50 μm、內(nèi)循環(huán)時(shí)間5 s、料液比1∶30（g/mL）進(jìn)行3次平行驗(yàn)證，霍山石斛多糖提取率平均值為64.04%，與優(yōu)化預(yù)測值非常接近，從而可以說明理論值與實(shí)測值之間具有良好的擬合性，表明了所建模型的有效性，說明回歸方程能較真實(shí)地反映各因素對(duì)霍山石斛超微低溫萃取的多糖提取率的影響。

圖2 X1X3相互作用對(duì)霍山石斛多糖提取率影響的響應(yīng)面圖譜（X1=超微研磨細(xì)度，X3=料液比）

3 結(jié)論與討論

利用超微低溫萃取技術(shù)進(jìn)行霍山石斛提取物的制備，經(jīng)響應(yīng)面分析及優(yōu)化，得到霍山石斛超微低溫萃取的最佳工藝：超微研磨細(xì)度50 μm，內(nèi)循環(huán)時(shí)間5 s，料液比1∶30（g/mL）。此條件下的霍山石斛多糖提取率為64.04%。采用超微低溫萃取技術(shù)提取多糖，多糖提取率高于響應(yīng)面法優(yōu)化的超聲波多糖提取[21]和響應(yīng)面法優(yōu)化的回流水提多糖法[20]。研究表明溫度對(duì)石斛多糖的得率和抗氧化活性有影響，溫度越高多糖得率和抗氧化性降低[22]。同時(shí)，溫度對(duì)總多酚、總黃酮等活性物質(zhì)均有影響，比如吳振等[23]研究滅菌溫度越高，果汁中的多酚和黃酮損失越多。由此推斷超微低溫萃取技術(shù)對(duì)霍山石斛多糖的得率及其他易氧化的活性成分影響小。且霍山石斛藥用價(jià)值和保健價(jià)值已被廣泛證實(shí)，但其種植投入大且產(chǎn)量極低，5年只生長5 cm，以致其價(jià)格一直居高不下，充分提取其活性成分，可提升其綜合利用價(jià)值，并為產(chǎn)品開發(fā)和產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供參考。