田鑫，郭筱兵，孫鳳霞，毛曉英，張連富， ，張建*

1. 石河子大學食品學院（石河子 832000）；2. 江南大學食品學院（無錫 214122）

近年來，隨著科技的進步和消費者觀念的轉(zhuǎn)變，食品的安全和質(zhì)量控制引起了全球的廣泛關(guān)注[1]。魚、蝦等水產(chǎn)品在儲運過程中，由于微生物的生長和蛋白質(zhì)的降解，極易腐敗[2]。腐敗變質(zhì)的肉類不僅影響其風味及營養(yǎng)價值，而且還容易引發(fā)食源性疾病[3]。

肉類制品腐敗過程中，總揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量的增加會逐漸使包裝內(nèi)環(huán)境變?yōu)閴A性，導(dǎo)致pH敏感染料顏色改變，這可通過智能比色膜進行監(jiān)測[4]。

智能傳感比色膜由兩個重要部分組成，即pH敏感染料和成膜基材。相較于目前使用較多的人工合成指示劑，如溴甲酚綠[5]、溴酚藍[6]、甲基紅[7]等，試驗選用的桑葚花青素（mulberry anthocyanin，MA）提取物提取自桑葚果實，是一種天然、無毒的水溶性色素，并且對酸堿度顯示出較寬范圍的響應(yīng)，是一種優(yōu)異的化學指示劑的替代品[8-9]。成膜基材是比色膜的另一大重要組成部分。由醋酸膠膜桿菌生物發(fā)酵獲得的細菌纖維素（bacterial cellulose，BC）是一種生物聚合物，因其具有高純度、特殊的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和高比表面積，其在食品工業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用。然而，目前有關(guān)BC應(yīng)用于包裝膜的研究較少，因此，此次試驗旨在利用桑葚花青素和BC膜制備一種智能傳感比色膜，研究比色膜的結(jié)構(gòu)、形態(tài)、對不同pH的顏色響應(yīng)及氨敏感性等，并將其應(yīng)用于蝦的新鮮度檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葚、青蝦，市售。細菌纖維素膜，桂林奇宏科技有限公司。氧化鎂、鹽酸、氨水等試劑，分析純，國藥集團有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SP-752PC型紫外分光光度計（上海光譜儀器有限公司）；RE-3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；JSM-6490LV掃描電子顯微鏡（日本電子公司）；Bruker Vertex 70V傅里葉紅外光譜儀（德國Bruker公司）。

1.3 方法

1.3.1 桑葚花青素的提取

參考陳杰等[10]的方法，將桑葚烘干至恒重，經(jīng)粉碎機粉碎后過0.250 mm直徑篩，備用。用體積分

數(shù)60%的乙醇溶液作為提取劑，按照料液比1∶20（g/mL）于50 ℃水浴3 h，濾液在35 ℃下避光旋蒸，凍干后得到桑葚花青素粉。所得粉末在4 ℃下避光保存。

1.3.2 MA溶液的可見光譜

將1 mL 0.08 g/100 mL的MA溶液分別添加到5 mL pH 4～13的緩沖溶液中，記錄其顏色變化。利用紫外-可見分光光度計測量其在400～800 nm的可見光譜。

1.3.3 智能比色膜的制備

將BC膜在蒸餾水中保存3 d，每天更換1次水，除去膜表面的防腐劑與其他雜質(zhì)。分別將BC膜浸入質(zhì)量濃度為0.08，0.16及0.24 g/100 mL的MA溶液中30 min，在25 ℃下干燥12 h，制得的比色膜分別命名為BCMA-1，BC-MA-2和BC-MA-3。將另一段BC膜浸泡在無MA的蒸餾水中，然后以相同方式干燥，比較其形態(tài)與結(jié)構(gòu)特征。制備的指示膜在4 ℃下避光保存。

1.3.4 智能比色膜的表征

1.3.4.1 智能比色膜的微觀結(jié)構(gòu)

利用JSM-6490LV場發(fā)射掃描電鏡觀察純BC膜及BC-MA指示膜的表面及橫截面形態(tài)。在分析之前，通過銀膠將樣品收集在鋁基上，對樣品進行真空噴金，觀測橫截面之前先用液氮對膜冷凍斷裂。每幅圖像的加速電壓和工作距離分別為15 kV和1～5 mm。

1.3.4.2 傅里葉變換紅外光譜分析

用傅里葉紅外光譜（Fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)T-IR）儀測定膜的吸收光譜，掃描次數(shù)為32，分辨率為4 cm-1，測量范圍為400～4 000 cm-1。

1.3.4.3 膜的比色分析

用掃描儀記錄指示膜在pH 4～13緩沖溶液下的顏色變化。用色度計提取指示膜的L*、a*、b*值。按式（1）計算總色差ΔE。

式中：ΔL*=L*-L0*，Δa*=a*-a0*，Δb*=b*-b0*；L*、a*、b*為不同pH下指示膜的值；L0*、a0*、b0*為指示膜的初始值。

1.3.4.4 氨敏感性

向500 mL錐形瓶中裝入80 mL 8 mmol/L的氨水，并將膜（20 mm×20 mm）懸置于液面上方1 cm處。在25 ℃下，使用掃描儀采集膜的圖像信息，每4 min一次，共24 min。用Photoshop提取膜的圖像特征信號，以中心點周圍半徑為100的像素點的R、G、B平均值作為傳感膜的表征值，根據(jù)式（2）～（5）計算SRGB值，利用傳感膜的RGB總變化率SRGB表征其靈敏度。

式中：Ra、Ga、Ba為膜反應(yīng)前的初始值；Rb、Gb、Bb為反應(yīng)后的值。

1.3.5 智能比色膜在蝦鮮度檢測中的應(yīng)用

為了測試智能指示膜用于蝦新鮮度檢測的性能，將新鮮蝦密封在無菌培養(yǎng)皿中，將制備的智能指示膜（20 mm×20 mm）貼在蓋子內(nèi)部且不與樣品接觸。然后在4 ℃下保藏6 d，分別記錄第0，第2，第4和第6天的蝦樣品的化學和微生物特性。每天用數(shù)碼相機記錄智能指示膜的顏色變化，顏色參數(shù)測定方法同1.3.4.3。

1.3.5.1 菌落總數(shù)

按照GB 4789.2—2016《食品微生物學檢驗菌落總數(shù)測定》[11]對鮮蝦貯存期間的菌落總數(shù)（total viable count，TVC）進行測定。

1.3.5.2 TVB-N測定

按照GB 5009.228—2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》[12]中的半微量滴定法對鮮蝦的揮發(fā)性鹽基氮進行測定。

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

應(yīng)用SPSS、Origin 9.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，利用方差分析進行顯著性差異分析，p＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葚花青素在不同pH下的可見光譜

為了驗證桑葚花青素作為pH指示材料的可行性，測試了MA溶液在不同pH下的顏色變化。由圖1（A）可見，MA溶液在pH低于7時呈粉紅色。當溶液變?yōu)閴A性時，即pH 7～9時逐漸變?yōu)樽仙趐H 10時呈黃色，在pH 11～12由棕色變?yōu)榛疑?，pH 13時變?yōu)榫G色。同時，隨著pH由酸到堿，MA的最大吸收峰由530 nm紅移至580 nm附近。這些變化主要歸因于花青素化學結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變[13]，當溶液由酸到堿時，黃色鹽離子形式存在的花色苷逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)轷停M而轉(zhuǎn)變?yōu)闊o色假堿，最后在強堿性環(huán)境中降解。色素溶液在弱酸性、中性和堿性pH下可以完全區(qū)分，該范圍適合跟蹤肉類產(chǎn)品的變質(zhì)。

圖1 MA溶液pH 4～13的顏色及可見光譜

2.2 比色膜的表征

2.2.1 微觀結(jié)構(gòu)

通過掃描電鏡觀察了摻入MA前后BC膜微觀形貌的變化。研究發(fā)現(xiàn)不同花青素添加濃度的比色膜的表面結(jié)構(gòu)沒有顯著性差異。從圖2（A）中可以看出，純BC膜表面光滑致密，具有清晰可見的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。BC納米纖維的直徑為70～90 nm，這種多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有助于花青素的包埋。純BC膜經(jīng)MA溶液浸泡，保留了BC膜的納米纖維結(jié)構(gòu)，但其表面變得粗糙（圖2B），同時觀察到一些白色顆粒附著在膜的纖維結(jié)構(gòu)上，表明花青素與BC膜已經(jīng)成功復(fù)合。純BC膜的橫截面（圖2C）與表面具有類似的致密纖維結(jié)構(gòu)。當純BC膜與色素復(fù)合后，纖維結(jié)構(gòu)不再明顯，但仍保持了高的孔隙率（圖2D），這有助于蝦腐敗產(chǎn)生的揮發(fā)性氣體的擴散，從而與膜中的pH敏感染料發(fā)生反應(yīng)。

圖2 比色膜的掃描電鏡圖像

2.2.2 傅里葉變換紅外光譜分析

FT-IR分析用于表征BC的化學結(jié)構(gòu)并確定其與MA可能存在的相互作用。圖3為花青素、純BC膜以及復(fù)合不同濃度桑葚花青素BC膜的FT-IR譜圖。復(fù)合色素后膜的光譜中3 341～2 898和1 426～1 033 cm-1等類似位置均觀察到BC的特征譜帶[14]，表明MA對BC的分子結(jié)構(gòu)沒有影響。在MA的譜帶中，3 100～2 800 cm-1之間的峰、1 709 cm-1和1 351 cm-1處的峰是識別羧基的3個特征峰[15]。對比純BC膜和MA-BC膜的譜帶發(fā)現(xiàn)，當BC膜浸入MA溶液后，隨著溶液濃度的升高，膜在1 709 cm-1處譜帶的強度略有升高，這些變化表明BC膜與花色苷分子之間形成了新的分子間氫鍵。

圖3 基材及膜的FT-IR譜圖

2.2.3 比色膜對不同pH的顏色響應(yīng)

圖4是比色膜在不同pH下的顏色響應(yīng)。在pH 4時，比色膜呈現(xiàn)出與膜初始顏色最相近的粉紅色，隨著pH的增加，膜的顏色由粉變紅再變紫，在pH 10時變?yōu)樽厣?，pH 11～13時膜呈現(xiàn)出由灰色到墨綠色的變化趨勢。

圖4 MA-BC比色膜在不同pH下的顏色變化

MA-BC膜的亮度（L值）隨著pH的升高而降低，表明指示膜顏色隨著pH的增加而逐漸變暗。隨著pH的增加，指示膜的a值顯著降低，由pH 4時的最高值44降低至pH 13時的最低值0，表明膜有由紅至綠的變化趨勢。b值在不同pH下沒有顯著變化。Pourjavaher等[16]的研究指出當總色差（ΔE）＞5時，人眼可以感知出顏色的變化。與初始膜的色度參數(shù)比較，MA-BC指示膜的色差值ΔE在pH 6～9的范圍內(nèi)大于15，人可以輕松通過肉眼分辨出其顏色變化，因此膜適合用于監(jiān)測包裝環(huán)境內(nèi)pH的變化。

2.2.4 指示膜的氨敏感性

為了模擬所制備的MA-BC比色膜對蝦變質(zhì)期間產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物的響應(yīng)，測量了指示膜對氨氣的反應(yīng)速度和敏感性。圖5（A）是不同濃度桑葚花青素指示膜對8 mmol/L氨氣在24 min內(nèi)的顏色響應(yīng)。MA-BC-2膜的SRGB值在前4 min內(nèi)顯著增加，表明其對氨氣響應(yīng)有高靈敏度，在12 min時顯示出最高靈敏度48.77%。MA-BC-1膜的靈敏度較低，24 min時靈敏度為22.86%。從圖5（B）可以看出，桑葚花青素添加濃度最高的MA-BC-3膜的顏色幾乎沒有發(fā)生變化，呈現(xiàn)出最低的靈敏度。MA-BC-2膜呈現(xiàn)出對氨氣的最佳響應(yīng)靈敏性。

圖5 MA-BC指示膜對8 mmol/L氨氣在24 min內(nèi)的響應(yīng)

此次試驗利用0.16 g/100 mL桑葚花青素制備的智能比色膜在不同pH下具有明顯的顏色響應(yīng)，且對氨氣有最佳響應(yīng)靈敏性。因此將MA-BC-2膜用于蝦的新鮮度監(jiān)測。

2.3 比色膜用于蝦新鮮度指示

2.3.1 蝦新鮮度測定

當TVC值超過6 log10CFU/g時，肉腐敗變質(zhì)且不可食用[17]。如圖6（A）所示，4 ℃下蝦的TVC值在儲藏期內(nèi)顯著升高。第0天時初始TVC值為4.47 log10CFU/g，表明樣品新鮮可食用，第4天時TVC值上升至6.58 log10CFU/g，超過了6 log10CFU/g的腐敗閾值，證明此時樣品已經(jīng)腐敗且不可食用。

圖6 4 ℃下蝦的TVC（A）、TVB-N（B）的變化和比色膜的顏色變化（B）的變化

鮮蝦的TVB-N小于12 mg/100 g為新鮮，12～25 mg/100 g為可食用中等新鮮，大于25 mg/100 g為不可食用的腐敗蝦[18]。由圖6（B）可以發(fā)現(xiàn)，新鮮蝦的初始TVB-N值為8.58 mg/100 g，在2 d后增加至13.64 mg/100 g，為中等鮮度，在第4天和第6天分別增加至25.89和33.54 mg/100 g。綜上，蝦的TVC值和TVB-N值均在第4天超過腐敗閾值，表明蝦在4 ℃下貯藏的第4天已經(jīng)腐敗。

MA-BC-2比色膜用于蝦新鮮度監(jiān)測其顏色及色差值變化如圖6（B）所示，第0天時膜呈初始的粉紅色，第2天時紅色加深，到第4天時，青蝦腐敗，此時指示膜變?yōu)闇\紫色。第6天時變?yōu)樯钭仙?，ΔE達到最大值34.33（大于5）。明顯的顏色變化表明MA-BC-2膜可以用于蝦新鮮度監(jiān)測。

2.3.2 相關(guān)性分析

蝦腐敗過程中產(chǎn)生的揮發(fā)性堿性氣體會導(dǎo)致比色膜發(fā)生顏色變化。從圖6（B）可以看出，ΔE與TVB-N值表現(xiàn)出相同的增加趨勢，因此對比色膜ΔE值與蝦腐敗過程中的TVB-N值進行相關(guān)性分析。結(jié)果表明，蝦樣品的TVB-N值與指示膜的ΔE值之間的相關(guān)性R=0.982，線性多項式模型和模型的精度R2=0.964 5（圖7）。說明薄膜的顏色變化與揮發(fā)性化合物的產(chǎn)生存在顯著正相關(guān)，表明MA-BC-2膜可用于蝦的新鮮度監(jiān)測。

圖7 蝦的TVB-N與比色膜的ΔE之間的相關(guān)性（破折號）和最佳擬合模型（點）

3 結(jié)論

試驗利用BC膜和桑葚花青素制備了用于蝦新鮮度指示的智能傳感比色膜。結(jié)果表明：花青素被成功復(fù)合到BC膜上，且與BC膜之間形成新的相互作用，膜的性質(zhì)穩(wěn)定，且具有良好的氨敏感性，并在不同pH下呈現(xiàn)出最佳顏色變化；其中MA-BC-2膜具有最佳的氨敏感性，將其用于蝦新鮮度指示，當蝦在4 ℃下貯藏到第4天時，蝦的TVB-N、TVC分別達到腐敗閾值，同時膜的顏色由淺粉色變?yōu)榧t色，最后變?yōu)樽仙＞C上：利用0.16 g/100 mL MA溶液與BC膜復(fù)合制備的智能傳感比色膜（MA-BC-2）可以用于智能包裝的指示標簽，且在食品的貨架期指示方面具有良好的應(yīng)用前景。