齊一瀟 ，羅思施*，雷靜，李奕恒，張俊杰段蕊*

1. 江蘇海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院（連云港 222005）；2. 廣州創(chuàng)爾生物技術(shù)股份有限公司（廣州 510700）

膠原蛋白海綿是膠原基生物材料的一種重要產(chǎn)品形式。純膠原蛋白海綿力學(xué)性能較弱[1]，常通過復(fù)合殼聚糖[2-4]、聚乙醇酸（PGA）[5]等材料提高和改善其力學(xué)性能。產(chǎn)品各組分的特性會(huì)在復(fù)合材料中體現(xiàn)[6]，復(fù)配來(lái)自細(xì)胞外基質(zhì)的天然成分有益于模仿天然細(xì)胞外基質(zhì)的物理性能和生物學(xué)特性[7]。

彈性蛋白來(lái)自于細(xì)胞外基質(zhì)，是一種高度不溶的蛋白質(zhì)[8]，可賦予組織及器官?gòu)椥訹9]，常通過脫細(xì)胞基質(zhì)[10]、可溶性或不可溶性彈性蛋白[11]等形式用于皮膚修復(fù)、血管再生[12]等領(lǐng)域的研究。通過水解方式制成的彈性蛋白多肽，保留有彈性蛋白的特征結(jié)構(gòu)域[13]；與膠原蛋白復(fù)配用于組織工程中，可提高膠原蛋白的力學(xué)性能[14]。彈性蛋白具有促進(jìn)成纖維細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)血管再生等生物學(xué)性能[15]，也可間接影響膠原蛋白對(duì)細(xì)胞的作用。因此，彈性蛋白多肽和膠原蛋白的復(fù)合，有望拓寬膠原蛋白海綿的應(yīng)用范圍。

試驗(yàn)將彈性蛋白多肽與膠原蛋白復(fù)配制備成復(fù)合海綿，從拉伸強(qiáng)度、彈性模量、吸水量、孔隙率以及微觀形貌等方面對(duì)膠原-彈性蛋白多肽復(fù)合海綿進(jìn)行理化性能評(píng)價(jià)。通過細(xì)胞增殖試驗(yàn)和細(xì)胞毒性試驗(yàn)評(píng)價(jià)膠原-彈性蛋白多肽復(fù)合海綿對(duì)細(xì)胞活力的影響。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

牛跟腱酸溶性膠原蛋白，廣州創(chuàng)爾生物技術(shù)股份有限公司；彈性蛋白多肽粉末，Elastinproducts公司；NIH-3T3細(xì)胞，中國(guó)科學(xué)院昆明野生動(dòng)物細(xì)胞庫(kù)；L929細(xì)胞，中國(guó)科學(xué)院昆明野生動(dòng)物細(xì)胞庫(kù)；無(wú)水乙醇，分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；CCK-8試劑，碧云天公司；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基等試劑，GIBCO公司。

PT-1198小型亞拉力試驗(yàn)機(jī)，寶大儀器；Q800動(dòng)態(tài)熱機(jī)械分析儀，美國(guó)TA；ADP-B3XL-E0A-X凍干機(jī)，SP Scientific；MCO-18-AIC-PC細(xì)胞培養(yǎng)箱，ESCO；FM-500D倒置熒光顯微鏡，上海蒲丹光學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-2FD生物安全柜，AIRTECH；BSA2245分析天平，Sartorius；SB-3200DTD超聲波清洗儀，Scientz；Merlin場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡，德國(guó)Carl Zeiss AG。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 海綿的制備

將膠原蛋白溶液用0.5 mol/L HAC稀釋，制成10 mg/mL的膠原蛋白溶液。將彈性蛋白多肽粉末完全溶解于pH 7.4的PBS溶液中，制成50 mg/mL的彈性蛋白多肽溶液。分別將膠原蛋白溶液和彈性蛋白多肽溶液按照表1的比例混合，在2～8 ℃環(huán)境下攪拌均勻，于37 ℃孵育5 h，冷凍干燥后保存在干燥器內(nèi)備用。

表1 膠原-彈性蛋白多肽復(fù)合海綿材料組成 單位：g

1.2.2 海綿力學(xué)性能的檢測(cè)

用小型亞拉力試驗(yàn)機(jī)檢測(cè)海綿的抗張強(qiáng)度，速率為10 mm/min。用動(dòng)態(tài)熱機(jī)械分析儀測(cè)量海綿的彈性模量，速率為1 N/min。

1.2.3 海綿吸水量的檢測(cè)

將經(jīng)過恒重的海綿稱重（M1）后，放入純化水中浸泡30 min，隨后稱量（M2）。吸水量按式（1）計(jì)算。

式中：W為吸水量，g；M1為干海綿質(zhì)量，g；M2為浸水后海綿質(zhì)量，g。

1.2.4 海綿孔隙率的檢測(cè)

在稱量瓶中盛滿無(wú)水乙醇后稱重（W1）。將經(jīng)過恒重的海綿稱重（WS）后放入上述稱量瓶中，超聲后重新補(bǔ)足稱量瓶中的無(wú)水乙醇，再次稱重稱量瓶（W2）。取出稱量瓶?jī)?nèi)的海綿，稱量剩余的無(wú)水乙醇及稱量瓶的質(zhì)量（W3）。孔隙率按式（2）計(jì)算。

式中：P為孔隙率，%；WS為干海綿質(zhì)量，g；W1為盛滿無(wú)水乙醇的稱量瓶質(zhì)量，g；W2為含有海綿、無(wú)水乙醇的稱量瓶質(zhì)量，g；W3為含有剩余無(wú)水乙醇的稱量瓶質(zhì)量。

1.2.5 掃描電鏡觀察

通過場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡觀察海綿的表面和截面的微觀結(jié)構(gòu)，并拍照分析。

1.2.6 成纖維細(xì)胞增殖試驗(yàn)

將NIH-3T3細(xì)胞懸液接種在96孔板中，孵育24 h后加入復(fù)合海綿的浸提液，以加入等量細(xì)胞培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組。將細(xì)胞培養(yǎng)24 h后用CCK-8試劑檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)增殖率。相對(duì)增殖率按式（3）計(jì)算。

式中：RGR為相對(duì)增殖率，%；A為樣品組吸光度平均值；A0為空白對(duì)照組吸光度平均值。

1.2.7 海綿細(xì)胞毒性的檢測(cè)[16]

按照GB/T 16886.5—2017所述方法檢測(cè)。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析及t檢驗(yàn)，p＜0.05表示具有顯著性差異，p＜0.01表示具有極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 海綿的力學(xué)性能分析

海綿較高的力學(xué)性能使其吸收液體后保持形態(tài)完整，拉伸延展后不易斷裂。此次研究測(cè)量海綿的抗張強(qiáng)度及彈性模量結(jié)果如圖1（A）和圖1（B）所示。C8E0Y、C8E5Z、C8E10Z三種海綿的抗張強(qiáng)度分別為7.10±0.45，8.94±0.58和26.46±1.52 N。C8E0Y與C8E5Z相比具有顯著差異，C8E0Y與C8E10Z相比具有極顯著差異，C8E5Z與C8E10Z相比具有極顯著差異。表明在一定范圍內(nèi)，彈性蛋白多肽的添加量與膠原蛋白復(fù)合海綿的抗張強(qiáng)度呈正相關(guān)。C8E0Y、C8E5Z、C8E10Z三種海綿的彈性模量分別為241.45± 17.51，252.59±11.32和255.32±32.37 Pa，但三者之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明彈性蛋白多肽的添加對(duì)海綿彈性模量的影響甚微。

圖1 力學(xué)性能分析結(jié)果

2.2 海綿吸水量分析

C8E0Y、C8E5Z、C8E10Z三種海綿的吸水量相對(duì)于海綿初始質(zhì)量的倍數(shù)分別為28.35±4.78，12.39± 0.58和6.30±0.76（圖2），三者間均具有極顯著差異。在試驗(yàn)過程中，與膠原蛋白海綿相比，膠原-彈性蛋白多肽復(fù)合海綿吸水后能維持完整形態(tài)。該結(jié)果表明，彈性蛋白多肽的添加對(duì)海綿的吸水性有較大影響，且該影響與添加量具有相關(guān)性。

圖2 海綿的吸水量

膠原蛋白海綿作為創(chuàng)面敷料使用時(shí)，能夠迅速吸收滲液，截留滲液中的細(xì)胞因子，有利于維持創(chuàng)面濕性環(huán)境，促進(jìn)創(chuàng)面愈合[17]。但在研究中發(fā)現(xiàn)，膠原蛋白海綿吸水后表面迅速凝膠化，凝膠化后力學(xué)性能明顯降低，也易從創(chuàng)面滑脫。材料復(fù)配可能是改善海綿以上缺陷的一種方式。張立彥等[18]利用殼聚糖和膠原蛋白制備復(fù)合海綿，結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加低相對(duì)分子質(zhì)量的殼聚糖后復(fù)合海綿的吸水率下降，添加高相對(duì)分子質(zhì)量的殼聚糖后其吸水率上升。該文章認(rèn)為復(fù)合海綿吸水率下降意味著抗水性提高，海綿具有一定的抗水性，可以延緩其在創(chuàng)面上的溶化速度，降低形變程度，保持海綿的形態(tài)。在試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，彈性蛋白多肽的添加雖然降低了海綿的吸水能力，但也降低了海綿遇水凝膠化的速度和程度。這種改變有利于復(fù)合海綿在吸收組織滲液后維持形態(tài)，粘附在傷口處，從而維持傷口濕性環(huán)境。

2.3 海綿孔隙率的分析

C8E0Y、C8E5Z、C8E10Z三種海綿的孔隙率分別為95.44%±0.65%，102.58%±3.66%和55.47%± 5.88%（圖3）。C8E0Y與C8E5Z相比無(wú)顯著性差異，C8E0Y與C8E10Z相比具有極顯著差異，C8E5Z與C8E10Z相比具有極顯著差異。

圖3 海綿的孔隙率

海綿的孔隙率影響細(xì)胞行為，較高的孔隙率促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的運(yùn)輸，方便氣體交換，增加創(chuàng)面的氧含量，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖[19]。

另外，孔隙率不僅影響細(xì)胞行為，也對(duì)海綿的力學(xué)性能有影響，高孔隙率的海綿由于大量的空隙體積，會(huì)降低海綿的力學(xué)性能[20]。根據(jù)此次試驗(yàn)對(duì)于膠原蛋白海綿（C8E0Y）和兩種膠原-彈性蛋白多肽復(fù)合海綿（C8E5Z、C8E10Z）的抗張強(qiáng)度檢測(cè)結(jié)果，C8E10Z海綿的抗張強(qiáng)度最高，與C8E0Y相比提高3.7倍，而C8E10Z的孔隙率則明顯低于C8E0Y，試驗(yàn)表明海綿材料的抗張強(qiáng)度和孔隙率呈負(fù)相關(guān)，力學(xué)性能的提升會(huì)降低其孔隙率。該結(jié)果與Jones等[21]的研究結(jié)果一致。

2.4 海綿的微觀結(jié)構(gòu)

如圖4所示：膠原蛋白海綿表面較為平整，有少量的褶皺和孔隙（圖4a）；截面呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，連接松散，孔隙排列無(wú)規(guī)律（圖4b）；彈性蛋白多肽加入后，海綿表面呈現(xiàn)粗糙的形貌，形成明顯的孔隙（圖4c）和褶皺（圖4e）；截面呈開放的多孔結(jié)構(gòu)，孔隙大小均一、排列有序，孔壁致密且無(wú)明顯的粉末聚集物（圖4 d、f）。因?yàn)閺椥缘鞍锥嚯南鄬?duì)分子質(zhì)量較?。s6 000 Da），無(wú)法形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，截面無(wú)明顯的粉末聚集物，說(shuō)明彈性蛋白多肽均勻地與膠原蛋白結(jié)合，結(jié)合海綿的抗張強(qiáng)度測(cè)試結(jié)果，表明彈性蛋白多肽的添加使海綿的微觀形貌更均勻有序，從而提升海綿的抗張強(qiáng)度。Daniel等[7]發(fā)現(xiàn)在膠原蛋白溶液里加入可溶性的彈性蛋白，電鏡觀察膠原蛋白表面平滑無(wú)明顯凸起或雜質(zhì)，同時(shí)可溶性彈性蛋白的添加增加了復(fù)合材料的剛度，這與研究檢測(cè)的結(jié)果相似。

圖4 海綿SEM圖像

根據(jù)此次試驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果，膠原-彈性蛋白多肽復(fù)合海綿C8E5Z和C8E10Z相比于純膠原海綿C8E0Y的抗張強(qiáng)度均有顯著的提升。C8E5Z海綿具有比C8E10Z海綿更高的吸水量和孔隙率，既可以吸收創(chuàng)面滲出物，也可以延緩膠原凝膠化的進(jìn)程，同時(shí)具有良好的孔隙率，為創(chuàng)面提供氧氣。綜合評(píng)定，選擇C8E5Z海綿繼續(xù)檢測(cè)其生物學(xué)性能。

2.5 成纖維細(xì)胞增殖情況及細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果

彈性蛋白多肽Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly的六肽重復(fù)氨基酸結(jié)構(gòu)，與細(xì)胞上存在的彈性蛋白受體結(jié)合[22-23]，影響細(xì)胞信號(hào)傳遞和趨化，刺激成纖維細(xì)胞增殖和遷移[24]。含有彈性蛋白肽的生物材料可以對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生生物效應(yīng)，例如增加彈性蛋白的合成[25]，誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖[26]等，能夠促進(jìn)傷口愈合。為了研究彈性蛋白多肽的添加對(duì)成纖維細(xì)胞增殖作用的影響，試驗(yàn)使用C8E5Z的浸提液培養(yǎng)小鼠成纖維細(xì)胞（NIH-3T3）。細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果（圖5A）表明，C8E5Z海綿浸提液的細(xì)胞增殖率為109.83%，與添加細(xì)胞培養(yǎng)基的空白對(duì)照組相比有極顯著性差異，說(shuō)明膠原-彈性蛋白多肽復(fù)合海綿C8E5Z具有促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖的作用。

根據(jù)GB/T 16886.5，細(xì)胞存活率不小于70%，細(xì)胞毒性評(píng)級(jí)小于2級(jí)，認(rèn)為材料不具有潛在細(xì)胞毒性。細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果（圖5B）表明，膠原-彈性蛋白多肽復(fù)合海綿的增殖率為102.49%，與添加細(xì)胞培養(yǎng)基的空白對(duì)照組相比有極顯著性差異，細(xì)胞毒性評(píng)級(jí)小于2級(jí)，無(wú)潛在細(xì)胞毒性。

圖5 試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

試驗(yàn)利用彈性蛋白多肽與膠原蛋白復(fù)配制備復(fù)合海綿，并對(duì)其性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。研究表明，膠原-彈性蛋白多肽復(fù)合海綿具有較高的力學(xué)強(qiáng)度，吸水量及孔隙率低于膠原蛋白海綿，吸水后海綿凝膠化的速度延緩。細(xì)胞增殖試驗(yàn)和細(xì)胞毒性試驗(yàn)表明復(fù)合海綿具有良好的細(xì)胞相容性，可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，并且沒有潛在的細(xì)胞毒性。理想的創(chuàng)面敷料不僅需要足夠的力學(xué)性能保護(hù)創(chuàng)面，還需要具有良好的吸水量及孔隙率，有利于組織滲出液的快速吸收，同時(shí)為創(chuàng)面提供氧氣。此次試驗(yàn)制備的復(fù)合海綿具有作為創(chuàng)面敷料的潛力。