陳巍元，姜宏宇，張華，

1. 延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院食品與生物科學(xué)系（延吉 133002）；2. 東北寒區(qū)肉?？萍紕?chuàng)新教育部工程研究中心 延邊大學(xué)（延吉 133002）

紫蘇油（perilla oil）富含α-亞麻酸，其含量在57%～62%左右，系ω-3多不飽和脂肪酸植物油[1]。亞麻酸在人體內(nèi)通過一系列的去飽和、鏈延伸和β-氧化反應(yīng)可代謝生成較長鏈的EPA和DHA，長期食用可以有效降低血脂、降低人體中的膽固醇、降低心血管疾病的發(fā)生，有助于延緩衰老、改善記憶力等，因此紫蘇油也有“陸地深海魚油”的稱號[2]。但是，高含量的不飽和脂肪酸也導(dǎo)致紫蘇油的儲藏穩(wěn)定性很低。不飽和脂肪酸分子對光、氧和熱都極為敏感，這使得紫蘇油極易氧化變質(zhì)[3]。根據(jù)相關(guān)研究成果，制備包覆良好、形態(tài)規(guī)則、緩釋作用良好的微膠囊，可防止富含多不飽和脂肪酸的紫蘇籽油在加工和貯藏的過程中氧化或變性。

利用復(fù)凝聚法制備微膠囊的研究中，明膠和阿拉伯膠的壁材組合最為常見，明膠與海藻酸鈉發(fā)生復(fù)凝聚反應(yīng)后也能形成微膠囊，同時海藻酸鈉相比阿拉伯膠的成本偏低，保健性和安全性更好[4-6]。李宇等[7]以大蒜精油為芯材，殼聚糖和羧甲基纖維素鈉為復(fù)合壁材，研究乳化-固化法制備大蒜精油微膠囊的工藝。徐易等[8]是以天然魚肝油為芯材，通過單因素試驗研究乳清蛋白、β-環(huán)糊精、阿拉伯膠壁材對魚肝油微膠囊化包埋率的影響，再結(jié)合中心組合響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化復(fù)合壁材用量，建立3種壁材用量與包埋率的數(shù)學(xué)模型。

但是以明膠和海藻酸鈉為壁材制備微膠囊作為復(fù)配壁材包埋紫蘇油尚未見報道。因此，試驗以紫蘇油為芯材，明膠與海藻酸鈉作為復(fù)合壁材，采用復(fù)凝聚法制備紫蘇油微膠囊，增加紫蘇油微膠囊壁材選用的廣域性，為紫蘇油在食品工業(yè)上的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

主要原料：紫蘇油（食品級，吉林省長白工坊科貿(mào)有限公司）；海藻酸鈉（食品級，上海仟味實業(yè)有限公司）；明膠B型（食品級，上海仟味實業(yè)有限公司）；轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（食品級，河南百惠得生物有限公司）。

化學(xué)試劑：氫氧化鈉、冰乙酸、司班80，石油醚（均為分析純）。

1.2 儀器與設(shè)備

JA10003N型電子分析天平（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）；IT-09B-15型磁力攪拌器（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；FK-FSH-2A高速分散攪拌機[方科儀器（常州）有限公司]；FD-1C-50型真空冷凍干燥機（北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司）；QFST-250SQ索氏提取器（浙江普托儀器有限公司）；SY-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；101-3型電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津泰斯特儀器有限公司）；PH-100B pH計（上海力辰儀器科技有限公司）。

1.3 紫蘇油微膠囊的制備

將明膠和海藻酸鈉按照一定的質(zhì)量分?jǐn)?shù)溶解（明膠與海藻酸鈉的質(zhì)量比為4∶1），先取一定量的紫蘇油加入海藻酸鈉溶液，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為紫蘇油0.5%的乳化劑司班80，均質(zhì)乳化[9]，然后加入明膠溶液再次均質(zhì)乳化，兩次均質(zhì)速度均為10 000 r/min。使用10%的冰乙酸溶液調(diào)節(jié)乳液pH進行復(fù)凝聚反應(yīng)，反應(yīng)條件為45 ℃，600 r/min，30 min。復(fù)凝聚反應(yīng)結(jié)束后在10 ℃以下維持20 min進行凝膠，每5 min攪拌1次。凝膠結(jié)束后，去除上清液并加入去離子水洗滌，再用10%氫氧化鈉溶液逐滴加入調(diào)節(jié)pH至6.0，加入一定量的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（TG酶）低溫固化處理，固化溫度為15 ℃，固化時間為2 h。固化結(jié)束后，經(jīng)過真空冷凍干燥得到微膠囊。

真空冷凍干燥：將制備的濕微膠囊放入凍干物料盤中，厚度不超過1 cm，放入-80 ℃冰箱中預(yù)冷12 h后經(jīng)真空冷凍干燥機（-50 ℃，1 Pa）冷凍干燥得到紫蘇油微膠囊產(chǎn)品。

1.4 紫蘇油微膠囊包埋率的測定

包埋率是指微膠囊所包埋芯材的量與總芯材的量之比，是判斷微膠囊包埋芯材效果的關(guān)鍵指標(biāo)[10]。包埋率按式（1）計算。

1.4.1 表面含油量的測定

精確稱取0.5 g紫蘇油微膠囊樣品（m0）于干燥的裝有濾紙的漏斗中，將100 mL石油醚分5次加入過濾至干燥的旋蒸瓶（m1）。進行水浴處理，溫度為50 ℃，在溶劑蒸干之后進行烘干處理，溫度為65 ℃，然后稱其質(zhì)量（m2）。微膠囊表面油含量按式（2）計算。

1.4.2 樣品總油含量測定

索氏抽提法：依據(jù)GB/T 5009.6—2016中的第一法進行操作，并進行適當(dāng)?shù)男薷摹?/p>

精確稱取0.5 g紫蘇油微膠囊樣品（M0），充分研磨10 min，全部移入濾紙筒內(nèi)（M1）。以無水乙醚作溶劑開始進行索氏抽提。抽提結(jié)束后，取出濾紙包，進行烘干處理，溫度保持在65 ℃，然后稱其質(zhì)量（M2）。微膠囊樣品總油含量按式（3）計算。

1.5 單因素試驗

采用單因素試驗，分別考察壁材質(zhì)量分?jǐn)?shù)（1%，1.5%，2%，2.5%和3%）、pH（4.0，4.1，4.2，4.3和4.4）、壁芯比（1∶2，2∶3，1∶1，3∶2和2∶1）、均質(zhì)時間（3，5，7，9和11 min）、TG酶用量在明膠質(zhì)量中的質(zhì)量濃度（10%，15%，20%，25%和30%）對包埋率的影響。

1.6 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計

在研究過程中采用Box-Behnken試驗設(shè)計，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，響應(yīng)值為紫蘇油微膠囊的包埋率，開展三因素三水平試驗，見表1。最后應(yīng)用Design Expert對試驗結(jié)果進行構(gòu)圖分析，并對最優(yōu)值進行預(yù)估。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計因素水平編碼表

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析

在數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析中需要利用合適的軟件工具，其中：主要基于Microsoft Excel進行繪制圖表；單因素方差分析主要基于SPSS Statistics 23.0實現(xiàn)，顯著性水平選擇0.05；響應(yīng)面優(yōu)化分析主要基于Design-Expert 8.0實現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 壁材質(zhì)量分?jǐn)?shù)對微膠囊包埋率的影響

由圖1可知，隨著壁材質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，微膠囊的包埋率也逐漸增大，當(dāng)壁材質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%時，微膠囊的包埋率達到最高，為76.53%。當(dāng)壁材質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%時，壁材質(zhì)量分?jǐn)?shù)過低，會存在空白復(fù)聚物，導(dǎo)致部分微膠囊包埋不完全，囊壁較薄，芯材物質(zhì)容易泄漏，此時微膠囊的包埋率較低。當(dāng)壁材質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%時，合理增大壁材質(zhì)量分?jǐn)?shù)可以提高芯材附近的壁材量，所以能夠促進明膠、海藻酸鈉的凝聚，繼而使得包埋率得到明顯提高。但是當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過1.5%時，微膠囊的包埋率不再增加且有下降的趨勢，這可能是由于壁材質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高導(dǎo)致體系黏度增大，從而不利于芯材的分散和微膠囊的成形，導(dǎo)致包埋的效果不好。結(jié)合上述過程可以確定最佳的壁材質(zhì)量分?jǐn)?shù)，即1.5%。

圖1 壁材質(zhì)量分?jǐn)?shù)對微膠囊包埋率的影響

2.2 pH對微膠囊包埋率的影響

由圖2可知，在所選范圍內(nèi)，當(dāng)pH為4.3時，包埋率達到最大值78.07%。調(diào)節(jié)pH由4.0增加到4.4時，包埋率呈現(xiàn)出先增后減的變化趨勢。在復(fù)凝聚過程中pH的調(diào)節(jié)尤為重要，如果GE-SA溶液的pH比GE等電點更低，則受到靜電作用的影響，—NH3+和—COO-會構(gòu)成特殊的復(fù)合凝聚物，難溶于水[11]。pH過高或者過低均不利于復(fù)凝聚反應(yīng)，pH較小時，GE會存在比較多的正電荷，所以和SA的靜電作用比較突出，最終得到的復(fù)合凝聚物難以保持較高的流動性，無法形成囊壁，pH過高，GE帶有的正電荷過少，靜電作用吸引力很低，難有沉淀析出。綜上，pH 4.3為微膠囊包埋的最適pH。

圖2 pH對微膠囊包埋率的影響

2.3 壁芯比對微膠囊包埋率的影響

如圖3所示，當(dāng)壁芯比為1∶1時，包埋率達到最大值78.07%，且明顯高于其他壁芯比的微膠囊樣品。經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)，芯材比過大導(dǎo)致壁材難以有效包裹，在這種情況下不僅難以達到預(yù)期的保護效果，而且會造成芯材的浪費。但是在壁材比過大的情況下同樣會產(chǎn)生不利的影響，因為這明顯增大了壁材間的交聯(lián)概率，導(dǎo)致出現(xiàn)很多空的未包埋芯材的復(fù)合凝聚物[12]，同樣造成了原料的虛耗。當(dāng)壁芯比為1∶1時，包埋率達到最高，表明在該比例下壁材能夠包埋更多的芯材且不造成資源浪費。綜上，微膠囊包埋的最適壁芯比為1∶1。

圖3 壁芯比對微膠囊包埋率的影響

2.4 均質(zhì)時間對微膠囊包埋率的影響

如圖4所示，包埋率會受到均質(zhì)時間的影響，總體來看，前者隨著后者的增加，呈現(xiàn)出先增后減的變化趨勢。包埋率的最大值是78.07%，此時對應(yīng)的均質(zhì)時間是7 min。在均質(zhì)時間較短的條件下，芯材不能均勻分散在GE-SA的溶液中，同時也會使部分芯材油滴過大，不能被壁材完全包埋，導(dǎo)致包埋率過低。如果均質(zhì)時間比較大，則可能出現(xiàn)乳液分層的現(xiàn)象[13]，由此會打破乳化液平衡，最終減小包埋率。當(dāng)均質(zhì)時間為7 min時，芯材分散最均勻，同時乳液體系最穩(wěn)定，紫蘇油微膠囊的包埋率也最高。綜上，微膠囊包埋的最適均質(zhì)時間為7 min。

圖4 均質(zhì)時間對微膠囊包埋率的影響

2.5 TG酶用量對微膠囊包埋率的影響

在復(fù)合凝聚階段形成的微膠囊很不穩(wěn)定，當(dāng)微膠囊液的pH、溫度發(fā)生變化時都會對其結(jié)構(gòu)造成破壞。因此，需要對微膠囊進行固化。當(dāng)溫度低于15 ℃時，明膠發(fā)生凝膠化[14]，穩(wěn)定微膠囊，凝膠化是固化的準(zhǔn)備階段。TG酶的最適pH為6.0，溫度處于45～55 ℃之間是最合適的，然而考慮到微膠囊仍然保持在凝膠狀態(tài)，反應(yīng)溫度不能超過15 ℃，所以此次研究中確定的TG酶固化溫度等于15 ℃，固化pH為6.0，固化時間為2 h。由圖5可知，添加不同量的TG酶固化處理后，各組微膠囊包埋率變化不大，并無顯著性差異。表明TG酶作為固化劑只是對微膠囊的結(jié)構(gòu)起到穩(wěn)定作用。綜合考慮，微膠囊包埋的最適TG酶添加量為20%。

圖5 TG酶添加量對微膠囊包埋率的影響

2.6 紫蘇油微膠囊的制備工藝優(yōu)化

結(jié)合單因素試驗結(jié)果可知：在壁芯比1∶1的條件下包埋率遠(yuǎn)高于其他組，所以直接確定壁芯比1∶1；TG酶添加量的多少對包埋率并無影響，故不再列入響應(yīng)面的優(yōu)化條件中。因此，使用響應(yīng)面優(yōu)化壁材質(zhì)量分?jǐn)?shù)（A）、pH（B）和均質(zhì)時間（C）對微膠囊包埋率（Y）的影響，利用中心組合試驗設(shè)計來優(yōu)化工藝條件?；贒esign-Expert進行處理，并獲取最優(yōu)化響應(yīng)面因子水平。試驗優(yōu)化結(jié)果和方差分析見表2和表3。

表3 回歸模型的方差分析結(jié)果

由方差分析結(jié)果可知：壁材質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH和pH二次項（B2）對微膠囊的包埋率影響極其顯著；均質(zhì)時間、壁材質(zhì)量分?jǐn)?shù)和pH的交互作用（AB）、壁材質(zhì)量分?jǐn)?shù)和均質(zhì)時間的交互作用（AC）對包埋率影響顯著；其余項影響不顯著。說明壁材質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH和均質(zhì)時間對于包埋率會產(chǎn)生不同的影響，按照影響大小可以得到pH＞均質(zhì)時間＞壁材質(zhì)量分?jǐn)?shù)。p=0.050 3＞0.05，所以失擬并不顯著，由此可以證明取得了較好的擬合效果，結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠性較高。優(yōu)化的二次多元回歸方程為：

該模型的p值為0.000 7＜0.01，由此可以證明該線性模型非常顯著。根據(jù)得到的結(jié)果可知，Radj2=0.893 7＞ 0.80，C.V.=3.94%，由此證明模型具有較高的擬合度，可以有效估測微膠囊的包埋率。

2.6.1 響應(yīng)面分析

壁材質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH和均質(zhì)時間兩兩因素間交互作用對微膠囊包埋率影響的響應(yīng)面圖如圖6～圖8所示。響應(yīng)面圖反映了各因素之間的相互關(guān)系以及相互作用程度。通過觀察響應(yīng)面的變化情況和等高線的稀疏程度，可以更加直觀清晰地觀察兩因素之間關(guān)系。當(dāng)?shù)雀呔€呈圓形且坡度較平緩時，表示兩因素交互作用不顯著，當(dāng)?shù)雀呔€呈橢圓形且坡度較陡時，表示兩因素交互作用影響顯著。

從3D響應(yīng)面圖可以看出，各個因素對紫蘇油微膠囊包埋率的影響程度。由圖6和圖7可知，pH曲面的變化程度比壁材質(zhì)量分?jǐn)?shù)和均質(zhì)時間曲面變化更大，說明pH比壁材質(zhì)量分?jǐn)?shù)和均質(zhì)時間對微膠囊包埋率的影響更顯著。由圖8可知，均質(zhì)時間曲面變化程度比壁材質(zhì)量分?jǐn)?shù)曲面變化程度大，說明均質(zhì)時間比壁材質(zhì)量分?jǐn)?shù)對微膠囊包埋率的影響較顯著，以上均與方差分析相符。

圖6 pH和壁材質(zhì)量分?jǐn)?shù)的響應(yīng)面及等高線圖

圖7 pH和均質(zhì)時間的響應(yīng)面及等高線圖

圖8 壁材質(zhì)量分?jǐn)?shù)和均質(zhì)時間的響應(yīng)面及等高線圖

2.6.2 最佳工藝確定及驗證試驗

根據(jù)試驗設(shè)計所得結(jié)果，結(jié)合回歸模型，預(yù)測最佳工藝條件：壁材質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%、pH 4.25和均質(zhì)時間9 min。在此條件下，包埋率理論最大值是87.91%。3次平行驗證試驗得出的包埋率為87.75%，與預(yù)測值相近，說明響應(yīng)面優(yōu)化的回歸模型可以有效預(yù)測紫蘇油微膠囊最佳條件，且具有一定的實際應(yīng)用價值。

3 結(jié)論

試驗通過復(fù)凝聚法制備紫蘇油微膠囊。由試驗結(jié)果可知，壁材質(zhì)量分?jǐn)?shù)與pH、均質(zhì)時間之間分別存在交互作用。三因素對包埋率的影響大小排序為pH＞均質(zhì)時間＞壁材質(zhì)量分?jǐn)?shù)。試驗設(shè)計所得結(jié)果，結(jié)合回歸模型，確定紫蘇油微膠囊最佳工藝：壁材質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%、壁芯比1∶1、pH 4.25、均質(zhì)時間9 min和TG酶添加用量為明膠質(zhì)量的20%，此時包埋率為87.75%。該試驗為紫蘇油的深入開發(fā)和研究提供參考。