王帥，王婷婷，范影，胡超

1. 安徽新天生物科技有限公司（阜陽(yáng) 236600）；2. 潁上縣科學(xué)技術(shù)學(xué)校（阜陽(yáng) 236200）

膠原蛋白是一種高分子功能性蛋白質(zhì)，含有大量的親水基團(tuán)及一些具有生物活性的基團(tuán)，具有保持肌膚水分、抗氧化、延緩衰老、美容養(yǎng)顏等功效[1]。目前，深海鱈魚(yú)是世界上大多數(shù)魚(yú)膠原蛋白的來(lái)源，從鱈魚(yú)魚(yú)皮中分離的膠原蛋白組織，易于被人體所吸收，利用率比較高，其生物安全性方面也表現(xiàn)得比較優(yōu)異，因此被廣泛應(yīng)用于食品保健、美容化妝、生物醫(yī)學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域[2-3]。

水果酵素是以多種新鮮水果為原料，經(jīng)過(guò)多種益生菌發(fā)酵所產(chǎn)生的含有豐富營(yíng)養(yǎng)成分以及一些重要的酶類(lèi)等生物活性物質(zhì)的混合發(fā)酵液。水果酵素含有豐富的能促進(jìn)腸胃蠕動(dòng)、提高免疫力等功能的生物活性物質(zhì)，具有排毒養(yǎng)顏、降血脂、增強(qiáng)抵抗力、維持身體機(jī)能平衡和預(yù)防疾病的作用[4-6]。

試驗(yàn)以深海鱈魚(yú)膠原蛋白和水果酵素為主要原料，添加山楂汁、蘋(píng)果汁、低聚半乳糖、L-蘋(píng)果酸等輔料，調(diào)配出一款新型的膠原蛋白酵素飲品。膠原蛋白酵素飲品不添加任何人工香精和色素，同時(shí)還具有淡淡的魚(yú)腥味，酸甜可口、口感優(yōu)良、風(fēng)味獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)豐富。此外，試驗(yàn)還對(duì)膠原蛋白酵素飲品的體外消化率和抗疲勞作用進(jìn)行了初步的探討，也為深海魚(yú)膠原蛋白、水果酵素的綜合開(kāi)發(fā)利用開(kāi)辟了一條新的途徑，填補(bǔ)了市場(chǎng)空白，具有較好的市場(chǎng)前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-50SII立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；2WAJ阿貝折射儀（上海光學(xué)儀器一廠）；YP502N電子分析天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；PHS-3C pH計(jì)（上海雷磁儀器有限公司）。

1.3 工藝操作

1.3.1 工藝流程

水、深海魚(yú)膠原蛋白、水果酵素、山楂汁、蘋(píng)果汁、低聚半乳糖、L-蘋(píng)果酸、檸檬酸、三氯蔗糖等原料稱(chēng)量→溶解→過(guò)濾（5 μm濾網(wǎng)）→灌裝→滅菌（115 ℃，20 min）→成品→檢驗(yàn)

1.3.2 優(yōu)化試驗(yàn)

1.3.2.1 單因素試驗(yàn)

以深海魚(yú)膠原蛋白（5.0%）、水果酵素（5.0%）、山楂汁（1.0%）、蘋(píng)果汁（0.6%）、低聚半乳糖（0.3%）、L-蘋(píng)果酸（0.08%）、檸檬酸（0.08%）和三氯蔗糖（0.005%）添加量為影響因素，通過(guò)改變其中一個(gè)變量來(lái)考察其對(duì)感官得分的影響。

1.3.2.2 正交試驗(yàn)

趙大剛說(shuō)：“昨天秦隊(duì)讓我去查那個(gè)標(biāo)識(shí)的事，我跑了很多地方，發(fā)現(xiàn)這東西雖然不是很普遍，但是市場(chǎng)上還是有的，我在漢正街專(zhuān)賣(mài)一些流行飾品的小商店看到一些類(lèi)似的，買(mǎi)了幾個(gè)回來(lái)?！彼统鲆淮蟀扬椢锓旁谧郎?。都與死者身上發(fā)現(xiàn)的那個(gè)類(lèi)似，但都又不完全是，一是材質(zhì)多數(shù)為鐵制和塑料制品，二是標(biāo)識(shí)上的紋路也不符合。秦明月想想說(shuō)，這條線還要跟下去，建議送到省廳去檢驗(yàn)一下再說(shuō)。

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)產(chǎn)品感官評(píng)價(jià)影響顯著的4個(gè)因素（深海魚(yú)膠原蛋白、水果酵素、檸檬酸、三氯蔗糖的添加量）進(jìn)行配方優(yōu)化，設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)，以感官評(píng)分為標(biāo)準(zhǔn)確定最佳工藝配方。

1.4 產(chǎn)品技術(shù)指標(biāo)

1.4.1 感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

選擇20名潁上縣科學(xué)技術(shù)學(xué)校16～30周歲的師生作為評(píng)委，分別從色澤、氣味、口感、組織狀態(tài)對(duì)調(diào)配產(chǎn)品進(jìn)行評(píng)價(jià)，取平均值計(jì)算并核算最終感官評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1[7]。最終的感官評(píng)分按式（1）計(jì)算。

表1 感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.4.2 理化指標(biāo)檢測(cè)

采用pH計(jì)測(cè)定產(chǎn)品酸度；采用酸堿中和滴定法測(cè)定總酸含量；采用阿貝折射儀測(cè)定可溶性固形物含量。參照 GB 7101—2015《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)飲料》進(jìn)行微生物指標(biāo)檢驗(yàn)。

1.4.3 體外消化率測(cè)試

參照中國(guó)藥典模擬腸液環(huán)境，用雙縮脲法測(cè)定飲品中蛋白質(zhì)/肽被腸道消化利用的程度[8]。37 ℃水浴環(huán)境中將50 mL膠原蛋白酵素飲品加入500 mL模擬腸液中，4 h內(nèi)每0.5 h取出2 mL×3組作為待測(cè)溶液，測(cè)定模擬腸液中蛋白質(zhì)/肽含量[9-10]，以C表示。體外消化率按式（2）計(jì)算。

式中：C0為未消化時(shí)的蛋白質(zhì)濃度；Ct為不同消化時(shí)間的蛋白質(zhì)濃度。

1.4.4 力竭運(yùn)動(dòng)能力測(cè)試[11]

選取24只約25 g的雌性小鼠，隨機(jī)分成4組，每組6只小鼠，試驗(yàn)組進(jìn)行樣品灌胃，灌胃量分別為1，3和5 mg，對(duì)照組的灌胃量為3 mg的生理鹽水。0.5 h后，4個(gè)水深30 cm的水箱中分別放入6只尾部負(fù)重為5%體質(zhì)量鉛皮的小鼠進(jìn)行負(fù)重游泳，水溫為30±1 ℃，負(fù)重游泳時(shí)間為游泳開(kāi)始時(shí)間至力竭的時(shí)間。力竭的判斷標(biāo)準(zhǔn)：小鼠連續(xù)3次沉入水中不能上浮。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 深海魚(yú)膠原蛋白添加量的影響

從圖1中可以看出，膠原蛋白酵素飲品的感官評(píng)分隨著其添加量的增加而不斷的上升，當(dāng)深海魚(yú)膠原蛋白添加量為5.0%時(shí)，感官評(píng)分達(dá)到最高，當(dāng)繼續(xù)增加深海魚(yú)膠原蛋白的添加量時(shí)，感官品質(zhì)評(píng)分開(kāi)始呈現(xiàn)下降。這可能是因?yàn)殡S著深海魚(yú)膠原蛋白添加量的增加，深海魚(yú)膠原蛋白中的游離氨基與水果酵素中的還原糖或者羰基化合物發(fā)生Maillard反應(yīng)，生成醛、還原酮、類(lèi)黑精等影響食品色澤和風(fēng)味的化合物，使飲品的感官評(píng)分在添加量為5.0%時(shí)達(dá)到最高[12]。因此，飲品中深海魚(yú)膠原蛋白的最佳添加量為5.0%。

圖1 深海魚(yú)膠原蛋白添加量對(duì)飲品的影響

2.1.2 水果酵素添加量的影響

如圖2所示，其感官評(píng)分在水果酵素添加量為5%達(dá)到最優(yōu)。水果酵素作為一種新型發(fā)酵飲品，風(fēng)味獨(dú)特，營(yíng)養(yǎng)豐富，適量地添加到膠原蛋白酵素飲品中，具有協(xié)調(diào)飲品酸甜可口、中和膠原蛋白魚(yú)腥澀味的作用，使飲品富含深海魚(yú)膠原蛋白和水果酵素特有的復(fù)合氣味，感官評(píng)分較好[13]。但是，過(guò)多地添加會(huì)導(dǎo)致膠原蛋白酵素飲品色澤發(fā)暗，且滅菌后產(chǎn)生焦糖味，影響產(chǎn)品品質(zhì)，導(dǎo)致感官評(píng)分隨著水果酵素添加量增加而快速降低。因此，膠原蛋白酵素飲品中水果酵素的適宜添加量為5%。

圖2 水果酵素添加量對(duì)飲品的影響

2.1.3 其他原輔料添加量的影響

由圖3可知，山楂汁添加量是非顯著影響因素，膠原蛋白酵素飲品中山楂汁的最佳工藝配方為1.0%。如圖4所示，色澤、氣味、口感、組織狀態(tài)等評(píng)分在蘋(píng)果汁添加量為0.6%時(shí)達(dá)到最優(yōu)，為其最佳工藝配方。如圖5所示，當(dāng)?shù)途郯肴樘堑奶砑恿繛?.3%時(shí)，口感較好，為膠原蛋白酵素飲品的最適添加量。

圖3 山楂汁添加量對(duì)飲品的影響

圖4 蘋(píng)果汁添加量對(duì)復(fù)合飲料的影響

圖5 低聚半乳糖添加量對(duì)飲品的影響

同時(shí)添加L-蘋(píng)果酸與檸檬酸，可使飲品具有強(qiáng)烈的果實(shí)風(fēng)味[14]。從圖6和圖7可以看出，當(dāng)L-蘋(píng)果酸添加量為0.08%、檸檬酸添加量為0.08%時(shí)，口感較好，感官評(píng)分達(dá)到最高。由圖8可知，當(dāng)膠原蛋白酵素飲品中三氯蔗糖添加量為0.005%時(shí)，感官評(píng)分最高，為最適添加量。

圖6 L-蘋(píng)果酸添加量對(duì)飲品的影響

圖7 檸檬酸添加量對(duì)飲品的影響

圖8 三氯蔗糖添加量對(duì)飲品的影響

2.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素工藝優(yōu)化的結(jié)果，以深海魚(yú)膠原蛋白、水果酵素、檸檬酸和三氯蔗糖的添加量為顯著影響因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，以感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行感官評(píng)分。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。根據(jù)R值分析可知，膠原蛋白酵素飲品調(diào)配過(guò)程中起決定性作用的是水果酵素添加量（B）和深海魚(yú)膠原蛋白添加量（A），其次是三氯蔗糖添加量（D）和檸檬酸添加量（C）。由K值可知：深海魚(yú)膠原蛋白添加量影響大小關(guān)系為K2＞K1＞K3；水果酵素添加量影響大小關(guān)系為K2＞K1＞K3；檸檬酸添加量影響大小關(guān)系為K2＞K1＞K3；三氯蔗糖添加量影響大小關(guān)系K2＞K1＞K3。分析可得最優(yōu)組合為A2B2C2D2。因該最優(yōu)組合不在正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表中，故對(duì)該組合的優(yōu)異性及準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證。按此組合對(duì)該方案重新進(jìn)行補(bǔ)充試驗(yàn)，平行試驗(yàn)3次[15]，平均感官評(píng)分為90.82分（高于表2中評(píng)分），由此可得該組合是合理可行的，為最優(yōu)組合。膠原蛋白酵素飲品最佳工藝配方為深海魚(yú)膠原蛋白添加量5.0%、水果酵素添加量5.0%、檸檬酸添加量0.08%、三氯蔗糖添加量0.005%。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3 飲品理化指標(biāo)測(cè)定

膠原蛋白酵素飲品的測(cè)定指標(biāo)及其測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 膠原蛋白酵素飲品的檢測(cè)結(jié)果

2.4 膠原蛋白酵素飲品的體外消化率

深海魚(yú)膠原蛋白屬于高分子功能性蛋白質(zhì)，經(jīng)人體胃腸道消化后，才最終被人體所吸收。體外模擬人體腸道環(huán)境，通過(guò)檢測(cè)膠原蛋白酵素飲品的體外消化率來(lái)評(píng)估其在腸道環(huán)境中的消化吸收情況，結(jié)果如圖9所示。隨著時(shí)間的增加，模擬腸液體系對(duì)膠原蛋白酵素飲品的體外消化率呈上升趨勢(shì)，當(dāng)體外作用時(shí)間為2.5 h時(shí)，體外消化率達(dá)到最高，隨著時(shí)間的繼續(xù)增加，體外消化率不再繼續(xù)增長(zhǎng)。體外消化率試驗(yàn)也進(jìn)一步說(shuō)明膠原蛋白酵素飲品的消化吸收可能主要是發(fā)生在腸道環(huán)境中[16]。

圖9 膠原蛋白酵素飲品的體外消化率

2.5 小鼠力竭運(yùn)動(dòng)游泳時(shí)間的影響

小鼠負(fù)重游泳試驗(yàn)在一定程度上能反映出機(jī)體運(yùn)動(dòng)疲勞程度，同時(shí)也是評(píng)價(jià)保健食品具有抗疲勞功效的重要標(biāo)準(zhǔn)之一[27]。由表4可知，樣品灌服后能有效地延長(zhǎng)小鼠的負(fù)重游泳時(shí)間，且隨著灌服劑量的增加而增加。與空白對(duì)照組相比，1，3和5 mL劑量組小鼠的負(fù)重游泳時(shí)間延長(zhǎng)率分別為16.9%，30.6%和37.2%。由此可知，膠原蛋白酵素飲品中能有效地提高小鼠的力竭游泳時(shí)間，具有一定的抗疲勞作用。

表4 力竭游泳運(yùn)動(dòng)時(shí)間測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

此次試驗(yàn)優(yōu)化了膠原蛋白酵素飲品的制備工藝配方，研制出一款色澤均一、營(yíng)養(yǎng)豐富、酸甜可口的功能性飲品。通過(guò)單因素試驗(yàn)和四因素三水平正交試驗(yàn)得到的最佳工藝配方為深海魚(yú)膠原蛋白5.0%、水果酵素5.0%、山楂汁1.0%、蘋(píng)果汁0.6%、低聚半乳糖0.3%，L-蘋(píng)果酸0.08%、檸檬酸0.08%、三氯蔗糖0.005%，且該飲品的理化性質(zhì)和微生物指標(biāo)均符合國(guó)家和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。此外，通過(guò)體外消化率和小鼠抗疲勞試驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證了膠原蛋白酵素飲品的相關(guān)保健功效，具有一定延緩疲勞的作用。該項(xiàng)研究豐富了水果酵素加工種類(lèi)，也大大改善了深海魚(yú)膠原蛋白的魚(yú)腥味，是一款市場(chǎng)前景比較好，預(yù)期具有較高經(jīng)濟(jì)效益的新款膠原蛋白酵素飲品。